Wir danken Alan Tasker (USDA-APHIS, Riverdale, MD), Stephen Compton (Clemson), Sherry Aultman (Clemson), Craig Ramsey (USDA-APHIS, Fort Collins, CO), und Betty Marose (UMD) für die Hilfe bei der Beschaffung Proben . Wir bedanken uns bei Studenten Andrew Adrian (UA-Huntsville) und Derek Thacker (UA-Huntsville) für ihre Unterstützung bei der Erprobung dieses Protokoll, und Joseph Herdy für seine Arbeit in den Dreharbeiten zu dem Video. Diese Arbeit wurde vom National Fish and Wildlife Foundation finanziert.

1. Probenentnahme und Konservierung Diese Methode wurde entwickelt und getestet, mit frisch, gefroren, getrocknet und vor kurzem Blattgewebe. <ol><li> Identifizieren cogongrass und / oder JBG Gewebe mit Hilfe eines Taxonomen, die im Gras Artbestimmung spezialisiert. Mit seinen leuchtend roten Blättern, ist einfach zu ornamentalen JBG optisch von Wildtyp-und cogongrass JBG unterscheiden zurückgreifen, jedoch sind cogongrass und JBG zurückkehren kaum von einander. Cogongrass und der JBG zurückgekehrt Phänotyp haben grün, Blätter länger, wesentlich größer und länger Wurzelstöcke, und vieles mehr Blattfläche als JBG 12 (Abbildung 1). </li><li> Frische Blattgewebe bietet die am häufigsten vorkommende und höchste Qualität DNA und kann von Feld oder Gewächshaus angebaut I. abgeholt werden cylindrica Pflanzen. Wenn frisches Gewebe verwendet werden soll, Extraktion von DNA innerhalb von 3 Stunden nach der Entnahme, um zu verhindern Abbau. Ansonsten bereiten Gewebe für die Lagerung, keeping das Gewebe kühl und vor direkter Sonneneinstrahlung geschützt. </li><li> Um Gewebe zur DNA-Extraktion zu einem späteren Zeitpunkt zu speichern, ist die optimale Verfahren zum Einfrieren und Speichern des Gewebes bei -80 ° C unmittelbar. Lassen Sie das gefrorene Gewebe zu tauen, bevor die DNA-Extraktion. Übertragen Sie die gefrorenen Gewebe zu flüssigem Stickstoff vor den Schleifen Schritte der DNA-Extraktion zu verhindern Auftauen. </li><li> Wenn ein -80 ° C Gefrierschrank ist nicht verfügbar, sofort trocken das Gewebe. Zur Aufbewahrung, ein Gewebe in einer Papierhülle und speichern den Umschlag in getrocknetem Kieselgel oder andere aktive Trockenmittel bei Raumtemperatur. Eine kleine Menge des Indikators Siliciumdioxid gemischt mit nicht anzeigenden Siliciumdioxid wird sichergestellt, dass Siliciumdioxid vollständig dehydriert und für Trocknen Pflanzengewebe. </li><li> Verwendung von mindestens 10 mal mehr Kieselgel als frische Blattgewebe Gew.. Pflanzengewebe sollte innerhalb von 24 Stunden trocknen lassen. Die Qualität und Quantität der DNA durch trockene Lagerung im Laufe der Zeit reduziert werden (wie im Fall von Herbarium-Exemplare). </li></ol> 2. DNA-Extraktion Um DNA aus Pflanzengewebe zu extrahieren, folgen Sie dem DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA; Cat # 69104 oder 69106) den Anweisungen des Herstellers mit einer kleinen Modifikation. Anstelle der Verwendung der vorgeschlagenen weniger als 100 mg frischem Gewebe oder weniger als 20 mg trockenes Gewebe für jede Spalte, schleifen größer als 100 mg, und übertragen Sie dann 100 mg von frischem oder gefrorenem Gewebe (oder&gt; 20 mg von trockenen Geweben) in die entsprechenden Röhrchen für die Extraktion. Kern-und Plastiden-DNA wird gleichzeitig extrahiert. <ol><li> Bevor Sie diese Vorgänge, stellen Sie sicher, dass Ethanol wurde auf Puffer AP3 / E und AW aufgenommen. </li><li> Grind&gt; 100 mg von frischem oder gefrorenem Blattgewebe (oder&gt; 20 mg trockenes Blattgewebe) zu einem feinen Pulver mit drei Runden von flüssigem Stickstoff mit Schleifen in einem gekühlten Mörser und Stößel. Zu wenig Störung des Ausgangsmaterials oder unzureichende Lyse kann auch führen zu niedrigeren Ausbeuten an DNA. Vorsichtig schleifen die TISSue und nicht überlasten die Spalten mit zu viel Gewebe. </li><li> Übertragen Sie 100 mg gefrorene Pulver aus frischen oder gefrorenen Gewebe (oder 20 mg Pulver von trockenen Geweben) zu einem 1.5 ml Zentrifugenröhrchen mit 400 ul Puffer AP1 und 4 ul RNase A. Jedes Rohr in einem kleinen Schrank auf einer platziert werden können auszugleichen, um die korrekte Gewicht des Gewebes pro Röhre zu überwachen. </li><li> Schütteln oder Probe (n) zu mischen und Inkubation für 10 min bei 65 ° C, Umdrehen des Röhrchens (en) 2-3 mal während der Inkubation. </li><li> Fügen Sie 130 ul Puffer AP2 zu jeder Probe. Mischen durch Invertieren des Röhrchens (n) mehrmals, und Inkubation für 5 min auf Eis. </li><li> Pipettieren Sie jeweils Lysat in ein separates QIAshredder Mini Spin-Säule, und platzieren Sie jede Spalte in einer 2-ml-Collection-Tube (im Lieferumfang des Kits). Zentrifugen-Spalte (n) für 2 min bei 20.000 xg (~ 14.000 rpm), und transferieren jede Flow-Through-Fraktion in eine neue Röhre (nicht im Kit enthalten) ohne Unterbrechung jedes Pellet gebildet. </li><li> In 1,5 Volumina Puffer AP3 /E, und durch Pipettieren gründlich mischen. </li><li> Übertragen Sie 650 ul der Mischung in eine DNeasy Mini Spin-Säule in ein 2 ml Collection Tube. Zentrifugen-Spalte (n) für 1 min bei 6.000 xg (~ 8.000 Umdrehungen pro Minute), und entsorgen Sie die Flow-Through. Wiederholen Sie diesen Schritt mit der restlichen Mischung für jede Probe. </li><li> Legen Sie die Spin-Säule (n) in ein neues 2 ml Collection Tube (n), und fügen Sie 500 ul Puffer AW auf der Oberseite jeder Spalte. Zentrifugen-Spalte (n) für 1 min bei 6.000 xg (~ 8.000 Umdrehungen pro Minute), und entsorgen Sie Flow-Through. </li><li> Fügen Sie eine weitere 500 ul Puffer AW auf der Oberseite jeder Spalte. Säule für 2 min bei 20.000 × g (~ 14.000 rpm). Dieser Schritt wird die Säule trocknen, so dass jedes restliche Ethanol in den Puffern, die PCR inhibieren kann enthalten. </li><li> Übertragen Sie jede Spin-Säule in ein neues 1,5-ml-Probenröhrchen. Geben Sie 100 ul Puffer AE an die Spitze jeder Säule für die Elution, und inkubieren Spalte (n) für 5 min bei Raumtemperatur. Zentrifuge Spalte (n) für 1 min bei 6.000 × g (~ 8.000 rpm), um die DNA zu sammeln. </li><li> Wiederholen Sie diese Schritte einmal Elution, Elution der DNA in der gleichen 1.5 ml Zentrifugenröhrchen zu 200 ul Probe ergeben. Shop DNA-Proben bei -20 ° C bis zur Verwendung. DNA-Konzentrationen sind abhängig von Gewebetyp und Lagerbedingungen. Optimale Ausbeuten werden erzielt, wenn eluierenden DNA mit einem Gesamtvolumen von 200 ul Puffer AE, jedoch Konzentrationen können erhöht werden, wenn Elutionsvolumen, so wenig wie 50 pl werden reduziert werden. </li></ol> 3. Nachweis der DNA-Qualität und Quantität <ol><li> Testen Sie die Qualität und Quantität der extrahierten DNA vor der PCR-Setup mit einem Spektralphotometer oder Fluorimeter und Gelelektrophorese. Dies wird dazu beitragen, den Erfolg der weiteren Schritte. </li><li> Mit einem Spektralphotometer, Test-DNA-Qualität und Quantität. Gute Ausbeuten DNA sollte zwischen 50 und 150 sein ng / ul mit 260/280 und 230/280-Verhältnisse von ca. 2,0. Als Beispiel zeigt Abbildung 2 qualitativ hochwertiger Ergebnisse mit dem NanoDrop Spektralphotometer (ThermoScientific,<html> Wilmington, DE). </li><li> Führen Elektrophorese unter Verwendung eines Standard-1% Agarosegel. Überprüfen Sie das Vorhandensein von relativ großen Bands (&gt; 10 Kb) mit nicht zu kleinen Schlieren von RNA-Kontamination (Abbildung 3). </li><li> Wenn die DNA-Konzentration hoch ist, verdünnter DNA-Proben auf 70 ng / ul für die nachfolgenden Schritte. </li></ol> 4. PCR-Primer Die PCR-Primer in diesem Protokoll verwendet werden auf Sequenzunterschiede zwischen dem Plastid trnL-F Spacer-Region der cogongrass und JBG Genotypen bezogen. Diese Unterschiede in der Form von SNPs (single nucleotide polymorphisms) und indels (Einfügungen und Löschungen), die die Entwicklung von Vielfalt-spezifische Primer durch Platzierung der Primer an den Standorten der einzigartigen Sequenzen (Abbildung 4) erlaubt zu kommen. <ol><li> Die Qualität der Primer können einen erheblichen Einfluss auf die PCR-Ergebnisse. Bestellen Primer von einem seriösen Unternehmen. Wir bestellen unsere Primern aus Oblique Bio, Inc. (:/ / Www.obliquebio.com/web/ &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL), Anfordern nur Standard-Verfahren entsalzt. </li><li> trnL-F positive Kontroll-Primer: Primer-Set Dieser verstärkt das plastidäre trnL-F Spacer-Region der meisten Taxa 11-13 Gras und dient als gute positive Kontrolle (was zu einem 890 bp-Bande). <table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Reihenfolge </td></tr><tr><td> trnF (GAA)-F </td><td> 5&#39;-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 &#39; </td></tr><tr><td> trnL (5&#39;-Exon)-C </td><td> 5&#39;-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 &#39; </td></tr></tbody></table></li><li> Wildtyp-Primer cogongrass: Diese Primer sind zu cogongrass und nicht verstärken die trnL-F-Region von JBG Genotypen. Die eingestellten Ergebnisse in einer Band, die 595 bp ist. <table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Sequss </td></tr><tr><td> trnLF-C-F1 </td><td> 5&#39;-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 &#39; </td></tr><tr><td> trnLF-C-R1 </td><td> 5&#39;-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 &#39; </td></tr></tbody></table></li><li> JBG und JBG Revert Primer: Diese Primer sind zu JBG Genotyp und nicht verstärken die trnL-F Region cogongrass. Die eingestellten Ergebnisse in einer Band, die 594 bp ist. <table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Reihenfolge </td></tr><tr><td> trnLF-R-F2 </td><td> 5&#39;-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 &#39; </td></tr><tr><td> trnLF-R-R2 </td><td> 5&#39;-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 &#39; </td></tr></tbody></table></li><li> Resuspendieren in jeder Primer ausreichend Volumen der Nuclease-freiem ddH 2 O, um eine 100 mM Stammlösungen, die bei -20 ° C, langen Zeitraum gelagert werden kann erhalten. </li><li> Verdünnen Sie jedes Primer-Lager bis 12 mm vor dem PCR-Setup-Schritte. </li></ol> 5. PCR-Setup DNA-Extraktionen sind amplifiziert unter Verwendung jeder der obigen Primer-Sets in PCR-Reaktionen. Fügen Sie eine positive Kontrolle, um sicherzustellen, dass alle PCR-Reagenzien arbeiten gut und kann eine Band zu erzeugen. Fügen Sie eine negative Kontrolle, um sicherzustellen, dass keines der Reagenzien mit unerwünschten DNA kontaminiert sind. Die negative Kontrolle enthält kein-Vorlage und sollten in keiner Band Produktion führen. <ol><li> Bereiten Sie alle Reaktionen in dünnwandigen PCR-Gefäße zur besseren Wärmeübergang zwischen dem Thermocycler-Block und der Probe zu ermöglichen. Wir empfehlen die Verwendung kommerziell erhältlichen Aerosol-freie Pipettenspitzen zur Vermeidung von Kontamination. </li><li> Für jede DNA-Probe isoliert, bis 50 pl PCR-Reaktionen mit jeder der oben genannten Primer-Sets in 0,2-ml dünnwandigen PCR-Gefäße, indem die folgenden Reagenzien auf Eis in der unten angegebenen Reihenfolge eingestellt. Wenn mehrere Proben hergestellt werden, machen einen Cocktail enthält alle Reagenzien, mit Ausnahmeder DNA-Vorlage, um einheitliche Bedingungen zwischen allen Reaktionen. <table border="1"><tbody><tr><td> PCR Reagenz </td><td> Volumen der eingesetzten </td><td> Abschließende Konzentrationsvermögen </td></tr><tr><td> Nuklease-freiem ddH 2 O </td><td> 40,5 ul </td><td></td></tr><tr><td> Vorteil 2 10X PCR-Puffer (Clontech, CA) </td><td> 5,0 ul </td><td> 10% (v / v) </td></tr><tr><td> Vorteil UltraPure PCR-dNTP-Mix (jeweils 10 mM, Clonetech, CA) </td><td> 1,0 ul </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> Primer 1 (12 &amp;mgr; m in ddH 2 O) </td><td> 1,0 ul </td><td> 0,24 pM </td></tr><tr><td> Primer 2 (12 &amp;mgr; m in ddH 2 O) </td><td> 1,0 ul </td><td> 0,24 pM </td></tr><tr><td> Vorteil 2 Polymerase Mix (Clontech, CA) </td><td> 0,5 ul </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> DNA-Extraktion(70 ng / Reaktion; anpassen ddH 2 O Volumen je nach Bedarf) </td><td> 1,0 ul </td><td> 1,4 ng / ul </td></tr><tr><td></td><td> Gesamt: 50,0 ul </td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Um sicherzustellen, dass alle PCR-Reagenzien sind gut klappt, richten die positive Kontrolle mit Hilfe der positiven Kontroll-Primer. Diese Primer-Set funktioniert genauso gut für cogongrass, JBG, JBG zurückkehren und andere Gräser und werden in einer Band, die 890 bp führen. </li><li> Richten die negative Kontrolle unter Verwendung der gleichen Kontroll-Primer als positive Kontrolle eingestellt, mit ddH 2 O anstelle der DNA-Extraktion. Wenn alle Reagenzien frei von DNA verunreinigt sind, wobei diese Reaktion in keiner Band führen. </li><li> Wenn die DNA-Konzentration niedrig ist, können weitere DNA zu jeder Reaktion gegeben werden, die Anpassung der Menge an Nuklease-freiem ddH 2 O verwendet, um das gesamte Reaktionsvolumen auf 50 ul zu bringen. Verwenden Sie nicht mehr als 5 mu l DNA (10% der das Gesamtvolumen) pro reaction, als mögliche Verunreinigungen in den DNA-Proben enthaltenen PCR-Reaktionen zu inhibieren. </li></ol> 6. PCR-Cycling <ol><li> Führen Sie die PCR-Amplifikationen in einem Thermocycler mit beheizbarem Deckel mit folgendem PCR-Cycling-Parameter ausgestattet ist. Wir verwenden die Mastercycle Pro S Thermocycler (Eppendorf, Hauppauge, NY) gesetzt, um mit Standard-Temperaturrampen Bedingungen zu arbeiten. Jede Qualität Thermocycler sollten gute Leistungen. <table border="1"><tbody><tr><td> Zyklus </td><td> Denaturierung Annealing </td><td> Polymerisation </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 min bei 95 ° C </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> 30 Sekunden bei 95 ° C </td><td> 30 Sekunden bei 61 ° C 90 s lang bei 68 ° C 35 Zyklen </td></tr><tr><td> 3 </td><td></td><td> 5 min bei 68 ° C </td></tr><tr><td colspan="3"> Halten bei 4 ° C, bis die Probe entnommen </td&gt; </tr></tbody></table></li><li> Optimieren der Bedingungen für die PCR (einschließlich Primer Annealing-Temperatur, Verlängerungszeiten, die Anzahl der Zyklen) nach Bedarf in Abhängigkeit von der Qualität der DNA, Primer, verwendet Taq-Polymerase oder Art der Thermocycler. Wir empfehlen unter Verwendung eines Gradienten in der Lage Thermocycler bei der Bestimmung der optimalen Glühtemperaturen. </li><li> Wenn der verwendete Thermocycler keinen beheizbaren Deckel, 1 Tropfen Mineralöl auf der Oberseite jeder Probe der Verdunstung während der PCR-Cycling zu verhindern. </li></ol> 7. Gel-Elektrophorese von PCR-Produkten Um die Ergebnisse der Analyse visualisieren, getrennte PCR-Produkte auf einem 1% Agarosegel-Elektrophorese unter Verwendung von Standardverfahren. <ol><li> Kombinieren Sie 2 ul einer Standard-DNA-Ladepuffer (typischerweise ein 5x oder 6x-Lösung) mit 5 ul jeder amplifizierte PCR-Produkt. </li><li> Laden Proben auf ein 1% Agarosegel, das Ethidiumbromid (Ethidiumbromid zum Anfärben der DNA) mit e gemachtither TAE oder SB (Natriumborat) Puffersysteme 16. Wir verwenden 1 ul einer 10 mg / ml EtBr Stammlösung pro 100 ml 1% Agarose (0,1 ug / ml). </li><li> Führen Proben bei ~ 120 V, bis der Farbstoff vor ¾ des gesamten Länge des Gels. </li><li> Unter UV-Licht (z. B. eine kurzwellige UV-Lichtbox) auch die resultierenden Banden zu sehen, ob eine entsprechende Fragment amplifiziert. </li><li> Dokumentieren Sie das Gel und die daraus resultierenden Bänder mit einer der verfügbaren Foto-Dokumentations-System oder eine Kamera. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse Nach Darstellung der PCR-Produkte, hat eine einzigartige cogongrass Bandenmuster im Vergleich zu der JBG oder zurückgesetzt JBG (5). Für jede DNA-Probe sollte die trnL-F Positivkontrolle Primer-Set in einem einzigen Band mit hoher Intensität bei ~ 890 bp führen. Diese prüft, ob alle PCR-Reagenzien gut funktionieren. Ebenso sollte die negative Kontrolle (kein Template)-Reaktion enthalten keine Banden für jedes Primer-set. Dadurch wird bestätigt, dass keines der Reagenzien wurden kontaminiert. Wenn die DNA-Probe von Wildtyp-cogongrass, eine PCR-Reaktion mit dem cogongrass-spezifische Primer in einer einzelnen Bande bei ~ 595 bp führen, während die JBG-spezifischen Primern in keiner Band führen abgeleitet. Ebenso, wenn die DNA-Probe von JBG abgeleitet ist oder zurückgesetzt JBG, ein PCR-Reaktion unter Verwendung der JBG-spezifische Primer in einer einzelnen Bande bei ~ 594 bp führen, während die cogongrass-spezifischen Primern in keiner Band führt. Weil JBG und kehrte JBG identisch Nukleinsäuresequenz haben, werden sie daher über identische Bandenmuster. Wenn viele Proben auf einem Gel zur gleichen Zeit verglichen werden sollen, empfehlen wir, alle Proben von jedem Primer gesetzt nebeneinander abgeleitet, wodurch es einfacher, die Proben für die positiven Ergebnisse zu scannen. Morphologischen Unterschiede zwischen JBG JBG und kehrt ziemlich offensichtlich sind (z. B. rote Farbe der Blätter und kleinere Statur von JB<html> G gegen den Rest der Grünfärbung, größerer Statur und aggressive Wachstum der JBG zurück), so dass während der PCR-Ergebnisse die gleichen sein werden, sind die JBG Sorten leicht zu unterscheiden Verwendung Pflanzenmorphologie. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig1.jpg" /> Abbildung 1. Vergleich von Gewächshaus gezogen Imperata cylindrica var. Koenigii (Japanese Blut Gras), kehrte I. cylindrica var. koenigii (JBG Revert) und I. cylindrica (Wildtyp cogongrass). <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig2.jpg" /> 2. Ein Beispiel von DNA-Proben überprüft unter Verwendung eines Spektrophotometers NanoDrop. Beachten Sie, dass, unabhängig von der verwendeten Spektrophotometers, das 260/280 Verhältnis sollte in der Nähe 1,8 sein und die 260/230 Ratio soll bei 2,0 zu schließen. NHALT &quot;&gt; <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig3.jpg" /> 3. DNA-Proben mit Standardmethoden Gel-Elektrophorese auf einem 1% igen Agarosegel. Eine kommerzielle DNA-Marker wurde für Größe Analyse verwendet. Lane # 4 ist ein Beispiel von schlechter Qualität DNA-Probe, zeigt, Verschmieren und einige RNA-Kontamination. <a href="/files/ftp_upload/3265/3265fig4_lg.jpg"><img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig4.jpg" /></a> Abbildung 4. Sequenzvergleiche der trnL-F Regionen Imperata cylindrica var. Koenigii (Japanese Blut Gras), kehrte I. cylindrica var. koenigii (JBG Revert) und I. cylindrica (Wildtyp cogongrass). Vertikale schwarze Pfeile zeigen Unterschiede in den Sequenzen, die sich aus SNPs und indels. Horizontal grünen Pfeile zeigen die Positionen der Wildtyp-Primer für cogongrass cogongrass-spezifischen PCR verwendet. Horizontale roten Pfeile zeigen die potungen der JBG und JBG Revert Primer für JBG-spezifische PCR eingesetzt. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig5.jpg" /> Bild 5. Repräsentative durch Gelelektrophorese von PCR-Produkten aus cogongrass abgeleitet, und JBG JBG wieder DNA-Proben mit cogongrass und JBG-spezifischen Primern sowie die trnL-F positive Kontrolle und eine negative Kontrolle ohne Matrize kombiniert.

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Wir haben nichts zu offenbaren.

<html> Die US-Gärtnerei und Landschaftspflege Industrien leben vom Anbau und Verkauf exotischer und neuartige Pflanzenarten. Diese, mit der zunehmenden Globalisierung des Handels verbunden ist, erhöht die Chancen, dass eine invasive Pflanzenarten geben, zu etablieren, wird verteilt und in den USA die Fähigkeit, staatlich zu regulieren, wie Pflanzen beruht auf Informationen, die oft nicht zur Verfügung steht, einschließlich der Möglichkeit, sich invasiven , korrekte Taxonomie und genetische Verschiedenheit von einheimischen und eingebürgerten Taxa. Da unser Wissen über invasive Pflanzen ist oft begrenzt, haben importierten Pflanzen mit versteckten invasiven Eigenschaften wurden bereitwillig eingeführt, nur um später zu erfahren, dass sie unsere Landwirtschaft und natürliche Ressourcen zu erobern. Dieses Protokoll zielt darauf ab, solche Probleme mit I. verbunden sind, anzugehen cylindrica Sorten durch die Bereitstellung der ersten molekularen vereinfachte Methode, die genau zwischen den Wildtyp-cogongrass und kehrte Form seiner ornamentalen JBG Gegenstück unterscheiden kann. jove_content &quot;&gt; Für die Entwicklung dieses Protokolls, wurde Wildtyp-cogongrass aus eingebürgerte Populationen an der Pond Creek Forstwirtschaft Einheit in Santa Rosa County in der Nähe von Jay, FL im Juni 2008 gesammelt werden. JBG wurde von einem kommerziellen Kindergarten (Bluebird Nursery Inc beschafft .) im Juni 2008 sowie vom Hausbesitzer die Sammlung in Columbia, kehrt MO JBG wurden aus dem Hof ​​des Campbell Geologisches Museum an der Clemson University, SC erhalten im Juni 2008;. aus University Park in Riverdale, MA im Juni 2009; und aus dem Vorgarten eines Hausbesitzer in Columbia, MO im Jahr 2009 (identifiziert durch Leland Cseke). Alle Pflanzen wurden in einem Gewächshaus an der Universität von Alabama in Huntsville (Huntsville, AL) entfernt gehalten. Genetische Sequenzierung von DNA aus diesen Pflanzen gesammelten enthalten die eingehenden Vergleich von 9 unabhängigen DNA-Regionen allgemein Barcode Pflanzen 2 verwendet. In allen Fällen waren die Sequenzen von JBG eine 100% ige Übereinstimmung mit denen der JBG zurück, was zurüberprüfen, ob JBG in der Tat zu einem grünen, invasive Form zurückkehren. Nur der nuklearen ITS und die Chloroplasten trnL-F Regionen haben Differenzen, die verwendet werden, um genetisch zwischen cogongrass und JBG unterschieden werden kann. Die ITS-Region hat eine Gesamtfläche von 3 SNPs (single nucleotide polymorphisms) zwischen cogongrass und JBG, während die trnL-F-Region verfügt über 2 SNPs und 2 indels (Insertionen und Deletionen). Diese genetischen Unterschiede erlaubt Vielfalt-spezifische PCR-Primer zu entwickeln, welches zwischen Wildtyp-und cogongrass JBG kehrt zu unterscheiden. Die zuverlässigsten Ergebnisse wurden von Primern aus dem Plastid trnL-F abgeleitet Region kommen. Somit ist dieses Protokoll auf der Sequenzunterschiede zwischen den trnL-F Regionen der Chloroplasten-Genom cogongrass, JBG und kehrte JBG (Abbildung 4) basiert. Damit erzeugen Primer, die eher typisch für die betreffenden Sorten sind und zur Vermeidung von Fehlalarmen aus nahe verwandten Arten, all bekannt trnL-F-Sequenzen von I. cylindrica Sorten wurden mit trnL-F-Sequenzen aus verwandten Grasart (43 unabhängige Sequenzen aus 29 Arten, z. B. Cymbopogon citratus, Sorghastrum incompletum, Coix lacryma-Jobi, Miscanthus sinensis, Saccharum officinarum, Sorghum halepense) verglichen. Obwohl, wir Vielfalt-spezifischen Primer-Sequenzen untersucht, über 29 Arten von Gras, die Spezifität der Vielfalt-spezifische Primer wurde noch nicht umfassend für seine Fähigkeit, DNA aus den meisten anderen Grasarten verstärken untersucht. Folglich sollten Gewebe für eine DNA-Extraktion verwendet sorgfältig wie I. identifiziert werden cylindrica vor Beginn dieses Protokoll. Wenn das Gras nicht als entweder cogongrass oder JBG identifiziert werden, dann empfehlen wir die Sequenzierung des PCR-Produkt, um sicherzustellen, dass Sequenzen, um eine exakte Übereinstimmung cogongrass oder JBG sind. Derzeit ist die genaueste Methode, um die Identität einer bestimmten Probe zu überprüfen Gras PCR bei den T-durchführenRNL-F und seine Regionen, gefolgt von der Sequenz Überprüfung der PCR-Produkte und der Vergleich der Sequenzen zu bekannten Sequenzen von genau identifiziert Taxa. DNA kann verstärkt mit Kontroll-Primer in diesem Protokoll aufgeführt (für die Region trnL-F) oder anderen Primern, dass in anderen Publikationen 13-15 werden. Die Sequenzierung ist viel mehr arbeits-und kostenintensiv als der Einsatz unserer vereinfachten Verfahren. Die Qualität der Primer für die PCR verwendet wird, ist entscheidend für den Erfolg des Verfahrens. Wir haben die Primer für dieses Verfahren erhältlich von Bio Schrägansicht, Inc. (hergestellt <a href="http://www.obliquebio.com/web/" target="_blank">http://www.obliquebio.com/web/</a> , Huntsville, AL). Der Vorteil für die Bestellung der Primer von Oblique Bio ist, dass sie eine große Anzahl von Aliquots von jedem Primer aus der identischen Probe-Baureihe als die Primer, die wir für die Optimierung in unserem Labor verwendet zu speichern. Folglich Primer nicht nur die gleiche Sequenz, aber they aus exakt den gleichen Produktionscharge, die in diesem Protokoll verwendet wurde, kommen. Unter Verwendung der Primer aus derselben Charge, können zur Vermeidung von externen Variablen in der Prozedur, die von Unterschieden in der Qualität der PCR-Primer zur Folge haben kann. Ebenso wird während andere Taq-Polymerasen sollte aber für PCR, die Qualität der Taq-Polymerase verwendet feine Auswirkungen auf die Qualität der PCR-Ergebnisse. Um eine bessere Konsistenz in PCR-Reagenzien ermöglichen, haben wir das Protokoll unter Verwendung von Reagenzien von Clontech optimiert. Der Vorteil 2 Polymerase (Clontech, Mountain View, CA, Kat. Nr. 639201 oder 639202) ist eine Mischung aus einem robusten, Hot-Start Taq-Polymerase und ein Lektorat Enzym, das eine hohe Spezifität und genauere Verstärkungen sorgen hilft. Da dieses Protokoll beruht auf Chloroplasten-DNA, die das Muttertier in Gräsern vererbt wird, kann die Hybridisierung zwischen Ereignissen und cogongrass JBG Genotypen nicht mit unseren molekulare Identifizierung Verfahren erfasst werden. In Fällen, in denen hypridization ist &amp; Fahrwerkcted, empfehlen wir die Verwendung nuklearer Regionen, die von beiden Eltern vererbt werden. Die am häufigsten verwendeten nicht-variable Region Plastiden in Pflanzenzellen Genotypisierung Aspekt ist die nukleare ribosomalen ITS-Region 13-15,17. Derzeit machen wir Fortschritte in Richtung Multiplexen der Verstärkung des Chloroplasten trnL-F-Region mit der des nuklearen ITS-Region in der gleichen PCR-Röhrchen. Multiplexen mit Kern-DNA-Regionen Plastiden würde möglicherweise eine Umgehung der Einschränkungen bei der Verwendung entweder allein, allerdings verlangen, dass diese Methoden Optimierung und zusätzliche Auswertung zur Machbarkeit auf einer von Fall zu Fall zu bestimmen. Der Einsatz von quantitativen real-time PCR (qPCR) und neuere Technologien, wie z. B. Molecular Beacons (fluoreszierenden Primer-Sonden), werden auch als Fail-Safe-Anlage und genaue Genotypisierung Methoden ausgewertet. Die hier vorgestellte Protokoll bietet eine schnelle und zuverlässige Methode zur Unterscheidung der JBG von dem der Wildtyp-cogongrass zurück. Wir ermutigen Siers dieses Protokoll, um Kontakt mit uns auf, um Ergebnisse aus der Verwendung von diesem Protokoll ergeben, zu berichten. Solche gemeinsamen Information wird dazu beitragen, Informationen über die Verteilung der JBG zurückkehrt. Dies wird auch dazu beitragen Regulierungsbehörden auf der USDA fundierte Entscheidungen über Maßnahmen, die werden müssen, kann die Ausbreitung und mögliche Hybridisierung der sehr invasiv cogongrass Sorten zu umgehen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DNeasy Plant Mini Kit </td><td> Qiagen, Valencia, CA </td><td> 69104 oder 69106 </td><td> Jeder seriöse genomischen Pflanzen-DNA Kit, das gute Qualität liefert DNA funktionieren sollte für diese Verfahren in Ordnung. </td></tr><tr><td> trnF (GAA)-F </td><td> Oblique Bio, Inc. </td><td> 3-0578 </td><td> Vorwärts-Primer positive Kontrolle </td></tr><tr><td> trnL (5&#39;-Exon)-C </td><td> Oblique Bio, Inc. </td><td> 3-0579 </td><td> Reverse-Primer positive Kontrolle </td></tr><tr><td> trnLF-C-F1 </td><td> Oblique Bio, Inc. </td><td> 3-0864 </td><td> Vorwärts-Wildtyp-Primer cogongrass </td></tr><tr><td> trnLF-C-R1 </td><td> Oblique Bio, Inc. </td><td> 3-0865 </td><td> Rückgängig machenWildtyp-Primer cogongrass </td></tr><tr><td> trnLF-R-F2 </td><td> Oblique Bio, Inc. </td><td> 3-0866 </td><td> Vorwärts und JBG JBG zurückkehren Primer </td></tr><tr><td> trnLF-R-R2 </td><td> Oblique Bio, Inc. </td><td> 3-0867 </td><td> Reverse JBG JBG und zurück Primer </td></tr><tr><td> Vorteil UltraPure PCR-dNTP-Mix </td><td> Clontech, Mountain View, CA </td><td> 639125 </td><td></td></tr><tr><td> Vorteil 2 Polymerase </td><td> Clontech, Mountain View, CA </td><td> 639201 oder 639202 </td><td> Ein gutes Lektorat, Hot-Start Taq-Polymerase </td></tr></tbody></table>

a pcr-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of imperata cylindrica

Wild-Typ I. cylindrica (cogongrass) gehört zu den Top Ten der schlimmsten invasiven Pflanzen in der Welt, negative Auswirkungen auf Landwirtschaft und natürliche Ressourcen in 73 verschiedenen Ländern in ganz Afrika, Asien, Europa, Neuseeland, Ozeanien und Amerika 2.1. Cogongrass bildet sich schnell verbreitenden, monodominant Ständen, die eine große Vielfalt an einheimischen Pflanzenarten verdrängen und wiederum bedrohen die heimische Tierwelt, die auf den Vertriebenen einheimischen Pflanzenarten für Futter und Unterkunft ab. Um auf das Problem hinzu, eine ornamentale Vielfalt [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] ist weit verbreitet unter den Namen Imperata cylindrica &#39;Rubra&#39;, Red Baron und Japanisch Blut Gras (JBG) vermarktet. Diese Sorte ist vermeintlich sterilen und nicht-invasive und gilt als eine wünschenswerte Zier für seine rot gefärbten Blättern. Doch unter den richtigen Bedingungen kann JBG produzieren lebensfähige Samen (Carol Holko, 2009 persönliche Mitteilung) und kann zu einem grünen zurückkehren invasive Form, die oft nicht zu unterscheiden ist von cogongrass wie es auf den besonderen Charakteristika des Wildtyp-invasive Vielfalt 4 (Abbildung 1) erfolgt. Dies macht die Identifizierung mit der Morphologie eine schwierige Aufgabe, auch für gut trainierte Pflanzensystematiker. Reversion von JBG zu einem aggressiven grünen Phänotyp ist auch keine Seltenheit. Mit Ablauf der kodierenden und variablen Regionen im kerntechnischen und Chloroplasten-DNA, haben wir bestätigt, dass JBG hat mit dem grünen invasiv in den Staaten Maryland, South Carolina und Missouri zurückgekehrt. JBG ist verkauft worden und in fast jedem Staat gepflanzt in den kontinentalen USA, wo es keine aktive cogongrass Befall. Das Ausmaß des Problems wieder in nicht gut verstanden, weil zurückgekehrt Pflanzen sind nicht dokumentiert und oft zerstört. Die Anwendung dieser molekularen Protokoll stellt eine Methode zur Identifizierung JBG kehrt und können helfen, diese Sorten von Co-vorkommende einND möglicherweise Hybridisierung. Cogongrass ist ein obligat outcrosser und, wenn mit einem anderen Genotyp überschritten, können lebensfähige Wind verteilt Samen, die über weite Entfernungen cogongrass 7.5 zu verbreiten. JBG hat eine etwas andere Genotypen als cogongrass und kann in der Lage, lebensfähige Hybride mit cogongrass bilden. Um auf das Problem hinzu, ist JBG mehr Kälte und Schatten toleranter als cogongrass 8-10, und Genfluss zwischen diesen beiden Sorten ist wahrscheinlich Hybriden, die aggressiver sind zu generieren, Schatten tolerant, und winterhart als Wildtyp-cogongrass. Während Wildtyp-cogongrass befällt derzeit über 490 Millionen Hektar weltweit, im Südosten der USA befällt es über 500.000 Hektar und ist in der Lage besetzen die meisten von den USA, wie es breitet sich schnell nach Norden wegen seiner breiten Nische und geographische Potenzial 3,7,11. Das Potenzial für eine genetische Kreuzung ist ein ernstes Problem für die USDA-APHIS Federal Noxious Wochenprogramm. Derzeit verbietet die USDA-APHIS JBG in Staaten where gibt es große cogongrass Befall (z. B. Florida, Alabama, Mississippi). Allerdings kann verhindern, dass die beiden Sorten aus der Kombination als schwieriger erweisen als cogongrass JBG und erweitern ihre Distributionen. Ferner ist die Verteilung der JBG wieder derzeit nicht bekannt und ohne die Möglichkeit, diese Sorten durch Morphologie zu identifizieren, einige cogongrass Befall kann das Ergebnis der JBG kehrt sein. Leider aktuellen molekularen Methoden der Identifikation in der Regel verlassen sich auf AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphismen) und DNA-Sequenzierung, die beide zeitaufwändig und kostspielig sind. Hier präsentieren wir die erste kostengünstige und zuverlässige PCR-basierter molekularer Genotypisierung Methode, um genau zwischen cogongrass und JBG zurückkehren zu unterscheiden.

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A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wir bieten eine kostengünstige und schnelle molekulare Genotypisierung Protokoll, das Vielfalt-spezifische PCR-Primer verwendet, die Ziel-DNA-Sequenz Unterschiede innerhalb der Chloroplasten trnL-F Spacer-Region, zwischen Sorten unterscheiden<em&gt; Imperata cylindrica</em&gt; (Cogongrass), die nicht durch Morphologie allein unterschieden werden. Diese Sorten gehören die vom Bund aufgelistet schädliches Unkraut, cogongrass und eng verwandten, weit verbreitete ornamentalen Vielfalt, ich<em&gt;. cylindrica</em&gt; Var.<em&gt; Koenigii</em&gt; (Japanische Blut Gras).

Ein PCR-basierte Genotypisierung Methode, zwischen Wildtyp-und Ziersorten Unterscheiden von Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

31.5K Aufrufe.  The University of Alabama, Huntsville. Wir bieten eine kostengünstige und schnelle molekulare Genotypisierung Protokoll, das Vielfalt-spezifische PCR-Primer verwendet, die Ziel-DNA-Sequenz Unterschiede innerhalb der Chloroplasten trnL-F Spacer-Region, zwischen Sorten unterscheiden Imperata cylindrica (Cogongrass), die nicht durch Morphologie allein unterschieden werden. Diese Sorten gehören die vom Bund aufgelistet schädliches Unkraut, cogongrass und eng verwandten, weit verbreitete ornamenta...

Serie: A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Eine einfache Methode für genaue Genotypisierung

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Forschung

Biologie

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the BRCA1 have been complicated by the lack of a robust assay for the full length BRCA1 protein and the difficulties inherent in working with cell lines that express hypomorphic BRCA1 protein1,2,3,4,5. We developed a system whereby the endogenous BRCA1 protein in a cell was acutely depleted by RNAi targeting the 3'-UTR of the BRCA1 mRNA and replaced by co-transfecting a plasmid expressing a BRCA1 variant. One advantage of this procedure is that the acute silencing of BRCA1 and simultaneous replacement allow the cells to grow without secondary mutations or adaptations that might arise over time to compensate for the loss of BRCA1 function. This depletion and add-back procedure was done in a HeLa-derived cell line that was readily assayed for homologous recombination activity. The homologous recombination assay is based on a previously published method whereby a recombination substrate is integrated into the genome (Figure 1)6,7,8,9. This recombination substrate has the rare-cutting I-SceI restriction enzyme site inside an inactive GFP allele, and downstream is a second inactive GFP allele. Transfection of the plasmid that expresses I-SceI results in a double-stranded break, which may be repaired by homologous recombination, and if homologous recombination does repair the break it creates an active GFP allele that is readily scored by flow cytometry for GFP protein expression. Depletion of endogenous BRCA1 resulted in an 8-10-fold reduction in homologous recombination activity, and add-back of wild-type plasmid fully restored homologous recombination function. When specific point mutants of full length BRCA1 were expressed from co-transfected plasmids, the effect of the specific missense mutant could be scored. As an example, the expression of the BRCA1(M18T) protein, a variant of unknown clinical significance10, was expressed in these cells, it failed to restore BRCA1-dependent homologous recombination. By contrast, expression of another variant, also of unknown significance, BRCA1(I21V) fully restored BRCA1-dependent homologous recombination function. This strategy of testing the function of BRCA1 missense mutations has been applied to another biological system assaying for centrosome function (Kais et al, unpublished observations). Overall, this approach is suitable for the analysis of missense mutants in any gene that must be analyzed recessively.

We provide a method for testing BRCA1 variants in a tissue culture based assay for homologous recombination repair of DNA damage by depleting endogenous BRCA1 protein from a cell using RNAi and replacing it with a BRCA1 point mutant that contains a coding change.

Ermittlung der Auswirkungen von BRCA1-Mutationen auf homologe Rekombination unter Verwendung von Zellen, die endogenes Wildtyp-BRCA1 Express

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

Proteinmembran Overlay Assay: Ein Protokoll, die Interaktion zwischen löslichen und unlöslichen Proteinen testen In-vitro-</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.
The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.
PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per &mu;l. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.
Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit utilizes the polymerase chain reaction (PCR), which is established as the method of choice for highest sensitivity in the detection of Mycoplasma, Acholeplasma, and Ureaplasma contamination in cell cultures and other cell culture derived biologicals.

Optimierte PCR-basierten Nachweis von Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice-Cap: Ein Verfahren zur Züchtung von Arabidopsis Und Tomatenpflanzen in 96-well-Platten für High-Throughput-Genotypisierung

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and animal tissues (Figure 1). Direct PCR is based on specially engineered Thermo Scientific Phusion and Phire DNA Polymerases, which include a double-stranded DNA binding domain that gives them unique properties such as high tolerance of inhibitors.
PCR-based target DNA detection has numerous applications in plant research, including plant genotype analysis and verification of transgenes. PCR from plant tissues traditionally involves an initial DNA isolation step, which may require expensive or toxic reagents. The process is time consuming and increases the risk of cross contamination1, 2. Conversely, by using Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit the target DNA can be easily detected, without prior DNA extraction. In the model demonstrated here, an example of derived cleaved amplified polymorphic sequence analysis (dCAPS)3,4 is performed directly from Arabidopsis plant leaves. dCAPS genotyping assays can be used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) by SNP allele-specific restriction endonuclease digestion3. 
Some plant samples tend to be more challenging when using Direct PCR methods as they contain components that interfere with PCR, such as phenolic compounds. In these cases, an additional step to remove the compounds is traditionally required2,5. Here, this problem is overcome by using a quick and easy dilution protocol followed by Direct PCR amplification (Figure 1). Fifteen year-old oak leaves are used as a model for challenging plants as the specimen contains high amounts of phenolic compounds including tannins. 
Gene transfer into mice is broadly used to study the roles of genes in development, physiology and human disease. The use of these animals requires screening for the presence of the transgene, usually with PCR. Traditionally, this involves a time consuming DNA isolation step, during which DNA for PCR analysis is purified from ear, tail or toe tissues6,7. However, with the Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit transgenic mice can be genotyped without prior DNA purification. In this protocol transgenic mouse genotyping is achieved directly from mouse ear tissues, as demonstrated here for a challenging example where only one primer set is used for amplification of two fragments differing greatly in size.

The Direct PCR approach presented here facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified plant and animal tissue.

Genotypisierung von Pflanzen und Tieren Proben ohne vorherige DNA-Aufreinigung

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Infinium-Assay für Groß SNP Genotypisierung Anwendungen

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analyse - ein hoher Durchsatz, Echtzeit-PCR-Assay für Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in mammals. However, humans cannot oxidize cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid to cytidine monophosphate-N-glycolylneuraminic acid due to a primary exon deletion of the CMAH gene. To understand the effects and implications of the lack of CMAH activity in more detail, a Cmah knock-out model in mice is of keen interest in basic and applied research. The analysis method to determine the phenotype of this mouse model is herein described in detail, and is based on the detection of both N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in the liver and milk of wild-type and Cmah knock-out mice. Endogenous sialic acids are released and derivatized with o-phenylenediamine to generate fluorogenic derivatives, which can be subsequently analyzed by HPLC. The presented protocol can be also applied for the analysis of milk and tissue samples from various other origins, and may be of use to investigate the nutritional and health effects of N-glycolylneuraminic acid.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

We describe a HPLC-based method for the determination of N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in mouse liver and milk.

Bestimmung von Sialinsäuren in Leber- und Milchproben von Wildtyp und<em&gt; CMAH</em&gt; Knock-out Mäuse.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

Neuartige Methode der Transport der Plasmid-DNA zu Maus Blase Urothel durch Elektroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...