Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von der National Science Foundation Grants MCB-0718846 und Defense Advanced Research Projects Agency Contract N66001-12-C-4020 (zu JDB). LAM wurde durch ein Forschungsstipendium aus den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada finanziert. Veröffentlichung dieses Artikels wird von Roche gesponsert.

1. Bereiten Sie genomischer Hefe-DNA (gDNA) <ol><li> Wird eine Stamm von Hefelyse Puffer 9, die mit 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 1% SDS enthält (w / v), 2% Triton X-100 (v / v), 1 mM EDTA pH 8,0. </li><li> Als Ausgangsmaterial Gebrauch ~ 2 x 10 6 Zellen, die in der Regel entspricht ~ 100 ul gesättigter Kultur für Laborstämme der BY4741 10 Hintergrund. Kultivierten Zellen sollten durch Zentrifugation bei 1.000 × g für 3 min bei Raumtemperatur in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt werden. Saugen Sie den Überstand. </li><li> Fügen Sie 200 ul Hefe Lysis Buffer und Zellpellet durch Pipettieren. </li><li> Hinzuzufügen ~ 300 ul säuregewaschene Glasperlen, so dass das Niveau der Perlen beträgt etwa 1 mm unter der Ebene der Zellaufschlämmung. </li><li> Unter einem Abzug mit 200 ul Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol (25: 24: 1). Verschließen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen und sicherzustellen, dass keine Kugeln werden zwischen der Kappe und dem Rohr stecken, da dies zu Undichtigkeiten beim Schütteln führen(Schritt 1.6). Invert 3 Mal zu mischen und zu überprüfen, die Kappe verschlossen. </li><li> Das Röhrchen wird 10 min bei Raumtemperatur unter Verwendung eines stationären Mischers, wie einer Eppendorf 5432. </li><li> Zentrifuge bei 20.800 g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Transfer 75 ul der wässrigen Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml 100% Ethanol. Kehren Sie 10-mal zu mischen. </li><li> Pellet die DNA durch Zentrifugation bei 20.800 xg für 20 min bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand aspirieren ohne Verdrängen der DNA-Pellet. Mit 500 ul 70% Ethanol Waschen des Pellets. </li><li> Zentrifuge bei 20.800 g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand aspirieren ohne Verdrängen der DNA-Pellet und der Luft trocknen das Pellet mit dem Mikrozentrifugendeckel geöffnet, bis überschüssiges Ethanol verdampft ist, die in der Regel rund 10 min. </li><li> Resuspendieren der DNA-Pellet in 75 ul 10 mM Tris pH 7,4 und Vortex mischen. Bewahren Sie die Probe bei -20 ° C auf unbestimmte Zeit. Messung der DNA-Konzentration in der Probe unter Verwendung einesLaborcytometer Fluorimeter wie das Qubit, das DNA aus RNA unterscheidet. Sicherzustellen, dass die Endkonzentration von gDNA ~ 1-2 ng / ul. </li><li> Bereiten Sie eine 1:10 Verdünnung von genomischer DNA mit Wasser und Wirbel zu mischen. </li><li> Aliquote von 30 ul verdünnt gDNA in die entsprechende Vertiefung einer Quellenplatte, die mit einem nanoskaligen akustischen Flüssigkeitsspender (Schritt 3) kompatibel ist. Bei Verwendung eines Labcyte Echo 550, mit einem 384-Well-Polypropylenplatte (384PP Platte). HINWEIS: Wenn in geeigneter Weise versiegelt diese Platte für mindestens einen Monat bei -20 ° C gelagert werden. </li></ol> 2. Bereiten Sie und Dispense qPCR Master Mix in eine Multiwell-Platte 1536 <ol><li> Vorzubereiten 850 ul qPCR Mastermix wie LightCycler 1536 DNA Grün Master in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Vortex zu mischen. Zentrifugieren Sie die qPCR-Mastermix für 2 min bei 20.800 xg bei Raumtemperatur, um alle Luftblasen zu entfernen. Die Komponenten der qPCR-Mastermix für eine einzelne 1536 Multiwellplatte erforderlich sind wie folgts: <ol><li> Kombinieren Sie 170 ul der Enzym-Mastermix (Grün Meister Rohr 1, 5-fach konzentriert), 42,5 ul SYBR (Grün Meister Röhrchen 4, 20x konzentriert) und 637,5 ul Wasser. </li></ol></li><li> Dispense 500 nl / Vertiefung in eine 1.536 Multiwellplatte mit einem großen Flüssigkeitsspender, wie die Art Robbins Cobra. (Beachten Sie, dass 2.2.1-2.2.4 beziehen sich speziell auf die Cobra Schritte.) <ol><li> Erstellen Sie einen Ausgabeprogramm mit folgenden Einstellungen: flüssig Klasse, Wasser; absaugen Volumen, 800 &amp; mgr; l; Abgabevolumen, 500 nl; Waschzeit, 20 sec. In den Ausgabeeinstellungen, überprüfen die Ausgabegeschwindigkeit auf 49,6 mm / s eingestellt wird, ist die Abgabe Offset 0,25 mm, und die überschüssige aufgenommene Flüssigkeit wird auch wieder in die Quelle verzichtet werden. </li><li> Setzen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen, das die qPCR Mastermix in Vertiefung A1 des Mikrozentrifugenröhrchen Halter, die in Liegeposition 1 befindet, die Kappe des Mikrozentrifugenröhrchen Schneiden oder einfach offen lassen. Stellen Sie die &quot;Saugen Sie auch &#39;zu A1 durch Bearbeiten der aspirate-Einstellungen. </li><li> Führen Sie einen Waschschritt vor der Abgabe qPCR Mastermix von ersten Abwahl der ansaugen und abgeben Schritte des Programms in Schritt 2.2.2 zu setzen und dann schlagen Sie &quot;Ausführen&quot;. Wenn Sie fertig sind, wählen Sie die Wieder ansaugen und abgeben Schritte vor dem Ausführen des vollständigen Programm zur qPCR Mastermix verzichten. Wenn der Cobra wurde im Leerlauf für weniger als 10 Minuten die anfängliche Waschschritt, der prime Systems dient, ist nicht notwendig. </li><li> Hit &#39;run&#39; bis qPCR Mastermix in jede Vertiefung zu verzichten. </li></ol></li><li> Sammeln Sie die qPCR Mastermix am Boden jeder Vertiefung durch kurze Zentrifugation von der 1536 Multiwellplatte (30 sec mit einem Low-Speed-PCR-Platte Spinner). </li></ol> 3. Geben Sie Template-DNA und Primer in die 1536 Multiwellplatte <ol><li> Verzichtet 5 nl verdünntem gDNA (Schritt 1.3) in die gewünschten Vertiefungen der Multiwellplatte 1536 unter Verwendung eines akustischen Flüssigkeitsübertragungssystem, wie das Echo 550. <ol><li> Für die Echo 550, verwenden Sie die Platte formatieren Software oder alternativ eine benutzerdefinierte Excel-Tabelle, um die Übertragung zu programmieren. Sicherstellen, dass die gewählte Quelle und für die gDNA in das Programm passt die Quelle auch in die Sie körperlich verzichtet haben die gDNA (Schritt 1.3). Quelle auswählen Plattentyp &#39;384PP_AQ_BP2&#39;, was anzeigt, die Flüssigkeit in dem 384PP Platte ein Puffer ohne Tenside. </li></ol></li><li> Verzichtet 10 nl Primer, vorwärts vorgemischt und umgekehrt zu einer Endkonzentration von jeweils 50 &amp; mgr; M zu den gewünschten Vertiefungen 1536 Multiwell-Platte unter Verwendung eines akustischen Flüssigkeitsübertragungssystem, wie das Echo 550. <ol><li> Für die Flüssigkeitsübertragungssystem, verwenden Sie die Platte formatieren Software oder alternativ eine benutzerdefinierte Excel-Tabelle, um die Übertragung zu programmieren. HINWEIS: Hier ist es möglich, Primer verzichtet werden, so dass das Layout auf dem 1536 Multiwellplatte entspricht der chromosomalen Reihenfolge der Primer so ist es einfach, eine Sichtprüfung, die Echtzeit-PCR-Ergebnissespäter (Schritt 6). </li><li> Fertigmischfutter der Primer in einer Platte, die mit der akustischen Flüssigkeitsspender kompatibel ist. Für das Echo 550, verwenden Sie ein Labcyte 384LDV (geringes Totvolumen) Platte und wählen Sie die Quellplatte Typ &#39;384LDV_AQ_B &quot;bei der Programmierung des Echo, um anzuzeigen, die Flüssigkeit ist ein einfacher Puffer ohne Proteine. </li></ol></li></ol> 4. Seal und die Centrifuge 1536 Multiwellplatte <ol><li> Verwendung eines Mikroplatten Versiegelsystem wie die PlateLoc Thermal Microplate Sealer, sofort abdichten 1536 Multiwellplatte mit optisch klare Dichtung, die mit der Heißsiegelgerät Instrument kompatibel ist. Die Oberfläche nicht berühren, der Dichtung zu Schmierflecken zu vermeiden. <ol><li> Bei Verwendung des Microplate Sealer PlateLoc Thermal, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: versiegeln Zeit 2,0 sec, Siegeltemperatur 162 ° C, Luftdruck 82 psi. Dieses Instrument nimmt ca. 5 min zu erwärmen und so sollte vorher eingeschaltet werden. </li><li> Bei Verwendung des Microplate Sealer PlateLoc Thermal, ein adapter verwendet, um die Höhe der 1536-Multiwellplatte auf der Bühne des Instruments zu erhöhen, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten. HINWEIS: Zwar ist es vorzuziehen, eine Bühnenplatte für die Thermal Microplate Sealer PlateLoc kaufen, ist eine alternative Lösung zu vier ~ 2 mm dick Standardscheiben erhältlich in jedem Baumarkt in den Ecken einfügen, um die Höhe der 1536 Multiwellplatte zu erhöhen. </li></ol></li><li> Die versiegelte 1536 Multiwellplatte sofort Zentrifugation bei 2.000 × g für 3 Minuten bei Raumtemperatur, um alle Reagenzien an der Unterseite jeder sammeln auch. </li></ol> 5. Real Time PCR <ol><li> Programm A 1.536 qPCR Instrument, wie dem LightCycler 1536 mit einem zweistufigen Amplifikationsprotokoll gefolgt von einer Schmelzkurvenanalyse. Mit Hilfe der LightCycler 1536 Software ein Programm einzurichten, wie folgt: <ol><li> Vorinkubation: 95 ° C, 1 min halten, Anstiegsrate 4,8 ° C / s, keine Übernahme. </li><li> Zwei-Schritt-Amplifikation: 30 Zyklen von [95 ° C, keine halten,Anstiegsrate 4,8 ° C / s, keine Übernahme; 64 ° C, 30 Sek halten, Anstiegsrate 2,5 ° C / s, Einzelaufnahme]. </li><li> Die Schmelzkurve: 95 ° C, 10 sec, Anstiegsrate 4,8 ° C / s, keine Übernahme; 60 ° C, 1 min, Aufheizgeschwindigkeit 2,5 ° C / s, keine Erfassung; 97 ° C, Anstiegsrate von 0,1 ° C / s, 5 Akquisitionen / ° C (Dauerbetrieb). </li><li> Cool: 40 ° C, 30 sec, Anstiegsrate 2,5 ° C / s, keine Übernahme. </li></ol></li><li> Stellen Sie die Erkennung Format zu &#39;Green Interkalationsfarbstoff &quot;in der Registerkarte Start Definition. </li><li> Setzen Sie die Pipettensteuer zu &quot;Master Control&quot; in der Registerkarte Start Definition. Diese Eigenschaft dient als interne Kontrolle und erkennt das Vorhandensein qPCR Mastermix in jede Vertiefung der Multiwell-Platte 1536, die nützlich für putative falsche Negative identifizieren. </li><li> Legen Sie die 1536 Multiwellplatte in Schritten 2-4 in den 1536 qPCR Instrument vorbereitet und das Programm auszuführen. </li></ol> 6. Datenanalyse <ol><li> Perform visuelle Inspektion der Daten innerhalb der qPCR Software. HINWEIS: Die 1536-Software ermöglicht die Visualisierung sowohl von Amplifikation und Schmelzkurven sowie einem Wärme zeigt den Aufruf (positiv, negativ, ungültig ist, N / A, Abbildung 2), der Kreuzungspunkt-Wert (Schiebefarbskala für positive oder grau für negative; Abbildung 3) oder ein Endpunkt Fluoreszenz (EPF) Wert (Schiebefarbskala). </li><li> Exportieren von Daten aus dem 1536 Software in Form einer TXT-Datei (Ergebnistabelle) oder .xml-Datei entweder mit den Rohdaten oder berechneten Daten für die Bearbeitung offline aus dem Instrument. HINWEIS: Die teilnehmerautomatisierten Kreuzungspunkt (Cp) Aufruf Algorithmus in die 1536-Software gebaut berücksichtigt die Form und Steigung der Verstärkungskurve, während die Bestimmung positiv / negativ und Cp Wert Anrufe mit hohen Vertrauen, bei niedrigen Untermikroliter Reaktionsvolumina mit vergleichsweise niedrigen Fluoreszenzwerte. </li><li> Wenn der LightCycler DNA Grün Meister war Gebrauchd für qPCR, sicherzustellen, dass alle Vertiefungen bestand die &quot;Master-Steuerung&quot;. A fail weist auf die auch nicht erhalten qPCR-Mastermix und der fehlenden Datenpunkt sollte als möglicher falsch negativ sein. Überprüfen Sie, dass alle Vertiefungen bestand die &quot;Master-Steuerung&quot;. A fail weist auf die auch nicht erhalten DNA Mastermix und betrachten den fehlenden Datenpunkt ein Potential falsch negativ. </li></ol>

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	<li>Annaluru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+functional+designer+eukaryotic+chromosome.">Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.</a> Science. 344 (6179), 55-58 (2014).</li><li>Dymond, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+chromosome+arms+function+in+yeast+and+generate+phenotypic+diversity+by+design.">Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design.</a> Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).</li><li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+6000+genes.">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-547 (1996).</li><li>Dymond, J., Boeke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Saccharomyces+cerevisiae+SCRaMbLE+system+and+genome+minimization.">The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization.</a> Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).</li><li>Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneDesign+3.0+is+an+updated+synthetic+biology+toolkit.">GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).</li><li>Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-A-Gene+with+GeneDesign.">Design-A-Gene with GeneDesign.</a> Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).</li><li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+limits+of+genetic+recoding+in+essential+genes.">Probing the limits of genetic recoding in essential genes.</a> Science. 342 (6156), 361-363 (2013).</li><li>Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+eukaryotic+chromosome:+Redesigning+and+SCRaMbLE-ing+yeast.">Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast.</a> Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).</li><li>Dymond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+genomic+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li></ol>

LAM, NAP, Marmelade und JDB haben nichts zu offenbaren. RC und AL werden von Roche Life Science beschäftigt, den USA und arbeitete an der Entwicklung der Anwendung mit LAM als Teil eines proof of principle experiment.

Der Einbau von Echtzeit-PCR-Nachweis in den PCRTag Genotypisierungsassay ist eine wichtige Entwicklung für die Sc2.0 Projekt, da es ermöglicht deutlich höhere Durchsatzleistung. Der bisherige Workflow angegebenen 2,5 ul Reaktionen in 384-Well-PCR-Platten, 1,5 h Temperaturwechsel Laufzeit, Agarose-Gelelektrophorese, und manuelle Annotation des Gels. Die hier vorgestellte Workflow, genannt qPCRTag Analyse überwindet mehrere große Engpässe. Zunächst kondensiert ein qPCRTag Lauf 4 x 384-Well-Platten in einem einzigen Experiment die verarbeitet werden können, von Anfang bis Ende (Platte eingerichtet und Laufzeit), in etwa eine Stunde. Es ist wichtig zu beachten, dass die Kosten pro Reagenz gut für qPCRTag Analyse ist auf Augenhöhe mit dem geringeren Durchsatz Agarose-Gel-basierten Ansatz. Unter Umgehung Gelelektrophorese und manuelle Annotation, bietet jedoch die qPCRTag Workflow erhebliche Einsparungen bei Zeit und Arbeit, die die wichtigsten Vorteile sind. Wichtig ist die qPCRTag Workflow entirely kompatibel mit Automatisierung. Ein Hauptproblem bei der Verwendung von Echtzeit-Erkennung als die Ausgabe des PCRTag Assay ist die Rate der falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse. Da die PCRTag Primer wurden ursprünglich nicht für die Verwendung in Echtzeit-PCR entwickelt, wird erwartet, dass nicht alle Primerpaare für die Verwendung mit diesem Ausgang geeignet. Zu diesem Zweck ist es wichtig, die Funktion und Spezifität aller PCRTag Primerpaare zu validieren, um die Untergruppe, die nicht in den Echtzeit-basierten Assay vorne nicht funktionieren auszuschließen. Zum Beispiel sind Chromosom 3 PCRTag falsche Positive und Negative nach und große reproduzierbar in der Echtzeit-PCR-Daten (Abbildungen 2 und 3) und diese können von weiteren Analysen ausgeschlossen werden. Ferner Primerpaare bekannt fehl (durch Gelelektrophorese bewertet und in den Fig S6 und S7 von Annaluru et al. 1 gezeigt) kann ebenfalls ausgeschlossen werden. Dies ist leicht einfach erreicht excluding die fehlerhaften Primerpaare bei der Einrichtung des akustischen Übertragungsprotokoll. Wie die meisten Assays mit hohem Durchsatz, beabsichtigen wir, Echtzeit PCRTag Erkennung als primären Bildschirm verwenden, um Transformanten, die weiter stromabwärts Validierung verdienen zu identifizieren. Anschließend wird der Goldstandard für sekundäre Screening PCRTag Analyse mit Gelelektrophorese als Auslese bleiben. Über die Anwendung der PCRTag Analyse für Sc2.0, die Kombination von state-of-the-Art nanoskaligen Liquid-Handling-Systeme mit hohem Durchsatz Echtzeit-PCR-Technologie ermöglicht eine schnelle und automatisierte Analyse und hat das Potenzial, viele Bereiche auswirken. Beispielsweise könnte dieser Workflow, um einen hohen Durchsatz-Bibliothek-Screening, Infektionskrankheiten Diagnose, microbiome Analyse und innovative Genom Bearbeitung angewendet werden Ansätze versucht, mehrere Loci gleichzeitig ändern.

Sc2.0 oder synthetische Hefe-Genom-Projekt ( <a href="http://www.syntheticyeast.org" target="_blank">www.syntheticyeast.org</a> ) hat sich zum Ziel gesetzt, entwerfen und bauen eine völlig synthetische eukaryotische Genom gesetzt. Unter Verwendung des hoch kuratiert Genomsequenz von Saccharomyces cerevisiae 3 als Ausgangspunkt, jeder der sechzehn lineare Chromosomen wurde neu entwickelt, um eine Reihe von Design-Prinzipien, die Aufrechterhaltung der Zell Fitness, Verbesserung der Genomstabilität und Erhöhung genetische Flexibilität angeben erfüllen. Zum Beispiel sind destabilisierende Elemente wie Wiederholungen von Sc2.0 Chromosomen gelöscht. Alle Instanzen TAG Stopcodons an TAA umcodiert zu &quot;frei&quot; ein Codon in der endgültigen Belastung für die Einführung von nicht genetisch codierte Aminosäure. Zusätzlich eine induzierbare Evolution System, Scramble, durch die Cre-lox-System aktiviert ist, ermöglicht beispiellose Fähigkeit, derivative Genome mit neuartigen Strukturen 4 zu erzeugen. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Eine weitere große Design-Element in Sc2.0 Genom ist die Einführung von PCRTags, die als DNA Wasserzeichen dienen der Verfolgung von synthetischen und Wildtyp-DNA zu ermöglichen. PCRTags sind kurz, re-codierten Segmente in ORFs auf synthetischen Chromosomen; während die PCRTag Sequenzen sich auf DNA-Ebene zwischen synthetischen und Wildtyp-Chromosomen sind die kodierten Proteine ​​in der Aminosäuresequenz und daher vermutlich Funktion identisch. PCRTag Sequenzen spezifisch als Primerbindungsstellen zur selektiven Amplifikation (Figur 1A) erleichtert gestaltet. PCRTag Entwurf wird unter Verwendung des &#39;unterschiedlichsten&#39; Algorithmus in GeneDesign 5,6 durchgeführt, wodurch man umcodiert synthetische Sequenzen, die in der Regel ca. 60% anders als die nativen Sequenzen (mindestens 33%) mit Schmelztemperaturen zwischen 58 ° C und 60 ° C und sind Amplicon Längen zwischen 200-500 Basenpaaren 2. Neukodierung nicht innerhalb der ersten 100 bp jedes ORF erlaubt, da diese Bereiche mit bekanntenhaben spezielle Einstellungen in Bezug auf die Codon-Nutzung 7. Gemeinsam begünstigen diese Designregeln Hochleistungs fast aller PCRTags unter einem einzigen Satz von PCR-Bedingungen, bei denen synthetische und Wildtyp PCRTag Primerpaare ausschließlich zu binden und zu verstärken, synthetische und native DNA, bzw. (1B). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig1.jpg" /> Abb. 1: schematische PCRTag (A) PCRTags neu kodiert Sequenzen innerhalb offenen Leserahmen (ORF) der Gene auf Sc2.0 Chromosomen. (B) synthetische (SYN) und Wildtyp (WT) PCRTag Primer ausschließlich zu binden und zu verstärken und synthetischen Wildtyp-Genom-DNA (gDNA) sind. Dargestellt ist hier eine Analyse einer ~ 30 kb-Segment des linken Arms von Chromosom sechs Testen dreizehn PCRTag Primerpaare entweder mit WT oder halb synVIL2 gDNA als Template. In vielen Fällen wird ein einziges ORF codiert für mehr als eine PCRTag. Vorhandensein / Fehlen PCRTag Amplikons über Agarose-Gelelektrophorese beurteilt. PCRTag Amplikons in der Größe von 200 bp auf 500 bp. Die schneller wandernden Spezies an der Unterseite der Platten sind Primerdimere. PCRTag Analyse hat sich als ein wichtiges Werkzeug bei der Montage der Sc2.0 Chromosomen. In einem typischen Experiment 30-50 kb synthetischer DNA, 20-30 PCRTags codiert, wird in Hefezellen transformiert, um die entsprechenden Wildtyp-DNA-1,2,8 ersetzen. PCRTag Analyse wird dann verwendet, um Transformanten, die synthetische, aber nicht Wildtyp PCRTags überspannt das Segment der DNA kodieren zu identifizieren, oder so genannte &quot;Gewinner&quot;. Es ist normalerweise notwendig, mehrere Trans testen &quot;Gewinner&quot; identifizieren, so dass der Durchsatz und die Kosten der PCRTag Analyse sind wichtige Überlegungen. Derzeit sind zwei Sc2.0 Chromosomen sind abgeschlossen (synIII 1 und synIXR 2), die weniger als 10% des Genoms Sc2.0, although mehr als die Hälfte der übrigen Chromosomen befinden sich derzeit in der Synthese und Montage. Die Skala der PCRTag Analyse für dieses Projekt erforderlich ist schnell übertraf die Fähigkeit, Gele laufen und manuell punkten die Anwesenheit von synthetischen DNA-und Abwesenheit von Wildtyp-DNA. Um den Durchsatz des PCRTag Test haben wir einen Workflow mit Echtzeit-PCR, die Verwendung von Agarose-Gelelektrophorese umgehen entwickelt zu verbessern. Der Arbeitsablauf macht Gebrauch von einer großen Flüssigkeitsspender zur qPCR Mastermix in jedes Well einer Multiwell-Platte 1536, ein nanoskaliges akustischen Flüssigkeitsspender zur Matrizen-DNA und Primer übertragen zu verteilen, und eine 1.536 qPCR Thermocycler, so dass wir, um Reaktionen zu 500 nl miniaturisieren und Durchsatz zu maximieren. Außerdem Analyse automatisiert werden kann. Diese Art von Hochdurchsatz-Genotypisierung Protokoll sollte verallgemeinerbar für jedes Projekt Analyse vieler Klone erfordern an mehreren Loci sein.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Yeast gDNA prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast gDNA</td>
			<td>custom</td>
			<td>custom</td>
			<td>template for real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-washed glass beads (0.5mm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8772</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5432 Mixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5432</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621807</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte 384PP plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>P-05525</td>
			<td>gDNA source plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DNA Green Mastermix prep and dispensing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536 DNA Green</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5573092001</td>
			<td>real time PCR mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL Microfuge Tube Holder</td>
			<td>ARI</td>
			<td>EST BD060314-1</td>
			<td>microfuge tube holder for deck of Cobra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536 Multiwell Plate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5358639001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobra liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>630-1000-10</td>
			<td>dispense qPCR master mix into 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Plate Spinner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89184-608</td>
			<td>cenrifugation of 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Template and primer dispensing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRTag primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>custom</td>
			<td>premixed forward and reverse, [50uM] each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempPlate pierceable sealing foil, sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2923-0110</td>
			<td>temporary seal for PCRTag primer plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte LDV 384 well plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>LP-0200</td>
			<td>pre-mixed primer source plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550 Liquid Handler</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>transfer 2.5nL drops of primer and template DNA into 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plateloc Thermal Microplate Sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G5402-90001</td>
			<td>heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Permanent Seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24212-001</td>
			<td>optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G5402-20008</td>
			<td>can substitute ~2mm thick washers&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR</td>
			<td>Thermo Scientfic</td>
			<td>75-004-521</td>
			<td>centrifuge heat sealed 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Industrial Air Compressor</td>
			<td>Jun Air</td>
			<td>1795011</td>
			<td>to run the Echo and Heat Sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Real Time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td>requires 220V outlet</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qpcrtag analysis - a high throughput, real time pcr assay for sc2.0 genotyping

Die synthetische Hefe-Genom-Projekt (Sc2.0) zielt darauf ab, 16 Designer Hefechromosomen aufbauen und kombinieren sie zu einem einzigen Hefezelle. Einem synthetischen Chromosom, synIII 1, und ein synthetisches Chromosomenarm, synIXR 2 stammen, wurden konstruiert, und ihre in vivo-Funktion in der Abwesenheit von den entsprechenden Wildtyp-Chromosomen validiert. Ein wichtiges Designmerkmal Sc2.0 Chromosomen ist die Einführung von PCRTags, die kurze, re-kodierten Sequenzen innerhalb offenen Leserahmen (ORFs), die Differenzierung von synthetischen Chromosomen von ihren Wildtyp-Gegenstücke ermöglichen sind. PCRTag Primer lagern selektiv entweder synthetischen oder Wildtyp-Chromosomen und der Gegenwart / Abwesenheit jeder Art von DNA kann unter Verwendung eines einfachen PCR-Assay getestet werden. Die Standard Auslesen des PCRTag Assay ist, um die Anwesenheit / Abwesenheit des Amplicons durch Agarose-Gelelektrophorese beurteilt. Jedoch mit einer durchschnittlichen PCRTag Amplikon Dichte von einem pro 1,5 kb und agenome Größe von ~ 12 Mb, wird die fertig Sc2.0 Genom rund 8.000 PCRTags kodieren. Um den Durchsatz zu verbessern, haben wir eine Echtzeit-PCR-basierten Nachweistest für PCRTag Genotypisierung, die wir qPCRTag Analyse nennen entwickelt. Der Arbeitsablauf gibt 500 nl Reaktionen in einer Multiwellplatte 1536, so dass wir mit sowohl synthetische als auch Wildtyp-Primerpaare in einem einzigen Experiment testen, bis zu 768 PCRTags.

Wir testeten synthetischen und Wildtyp-Chromosom 3 PCRTag Primerpaare 1 mit genomischer Hefe-DNA (gDNA) aus vier verschiedenen Stämmen extrahiert. Chromosom 3 hat 186 PCRTag Primerpaare, die die Länge des Chromosoms überspannen (synIII ist ~ 270 kb und Wildtyp-Chromosom 3 ~ 315 kb). Zu jeder der vier Stämme mit beiden Sätze von Primern zu testen, teilten wir die Multiwellplatte in vier Quadranten, eine für jede Art von gDNA, Zuweisen synthetischen PCRTag Primer an der oberen Hälfte jedes Quadranten und Wildtyp auf der unteren Hälfte. Genomische DNA wurde aus den Hefestämmen, von denen zwei zu kodieren Wildtyp-Chromosom 3 (Wildtyp, synIXR 2) extrahiert, während die übrigen zwei kodieren synthetischen Chromosom 3 (synIII 1, synIII synIXR). qPCR Mastermix wurde mit einem großen Flüssigkeitsspender, gefolgt von gDNA und PCRTag Primer mit den Echo 550. Die Primer wurden identisch in aufgereiht in jede Vertiefung einer Multiwell-Platte 1536 abgegebenjeder Quadrant der Multiwellplatte für einfachen visuellen Vergleich. Die Multiwell-Platte wurde dann Hitze mit optisch klare Dichtung abgedichtet und auf Echtzeit-PCR-Analyse unterzogen. In diesem qPCRTag Experiment beobachteten wir, zum größten Teil, Verstärkung, wie erwartet, wobei ausschließlich synthetische Primer amplifiziert synthetische DNA und umgekehrt (Figuren 2 und 3). Allerdings beobachteten wir auch einige Abweichungen von dem erwarteten Muster, was darauf hindeutet, falsch-negative und falsche Positive in der Datenmenge. In diesem Experiment wurde die Mastersteuerung in 100% der Vertiefungen nachgewiesen, was auf die großen Flüssigkeitsspender erfolgreich in jede Vertiefung der Platte verzichtet Mastermix (Daten nicht gezeigt). Dies schließt eine mögliche Quelle für falsche Negative. Zusätzlich werden einige Chromosom 3 PCRTags bekannt fehl (in den Figuren gezeigt S6 und S7 von Annaluru et al. 1), darunter mindestens 2 SYN und 1 GewPrimerpaare; somit können diese Vertiefungen kann in jedem Quadranten ignoriert. Wahr falsch negative könnte aus einem Mangel an Transfer von template gDNA oder Primer in unserer Erfahrung ergeben sich jedoch angesichts der korrekten Kalibrierung von der Echo 550 sowie die Vorbereitung von gDNA und Primern, wie beschrieben, ist dies nicht eine Hauptfehlerquelle. Insgesamt in diesem Experiment die falsch-negative Rate war für WT Primer mit WT-Vorlage (~ 2%), obwohl für SYN SYN Primer mit DNA (~ 8%) etwas höher extrem niedrig. False Positives, die Erkennung von Signal in Brunnen, wo SYN Primer werden mit WT gDNA (und umgekehrt) gemischt werden, kann von Querverstärkung oder Primer-Dimere entstehen. Tatsächlich sind Primerdimere oft durch Gelelektrophorese (1B) sichtbar sind und eine angemessene Fehlerquelle. Für die Anwendung der qPCR kann die Untersuchung der Schmelzkurven von Nutzen sein, um zu bestimmen, ob verschiedene Arten, wie Primer-Dimere, in ein Signal beitragen. Ferner performing ein Kontrollexperiment, wobei Primer in Abwesenheit von Template-DNA entfallen kann zur Identifizierung von Primern mit einer Neigung zu dimerisieren. Quer Amplifikation durch Gelelektrophorese beobachtet werden, insbesondere, wenn zu viele PCR-Zyklen durchgeführt werden, oder wenn die Glühtemperatur zu niedrig ist. Wir haben durch die Optimierung dieser beiden Parameter für die qPCRTag Protokoll versucht, die Anzahl an Fehlalarmen zu minimieren durch Querverstärkung. Schließlich Prüfung der Übergangsstelle (Cp) Werte für jede Vertiefung kann dazu beitragen, Primer, die nicht in Echtzeit-basierte Erkennung geeignet sind (Abbildung 3, zum Beispiel BB22, Fb22, BB46, FB46). Insgesamt in diesem Experiment die False Positive Rate war gering für SYN-Primer mit WT-Vorlage (~ 5%) und höher für WT Primer mit SYN-Vorlage (~ 10%). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig2.jpg" /> Abbildung 2: Plattenwärme Karte Anzeigen Gegenwart / absence halber qPCRTag Experiment. Vier verschiedene Typen von genomischer DNA (Quadranten durch feste weiße Linien getrennt) wurden unter Verwendung von synthetischen (SYN) zu PCRTag Analyse unterzogen und Wildtyp (WT) Chromosom 3 PCRTag Primer (gestrichelte weiße Linien zu trennen SYN (top ) und WT (unten) in jedem Quadranten). WT und synIXR gDNA kodieren Wildtyp-Chromosom 3, wodurch Amplifikation mit WT PCRTag Primer. SynIII und synIII synIXR gDNA kodieren synthetischen Chromosom 3, wodurch Amplifikation mit SYN PCRTag Primer. Primer werden nach ihren links-nach-rechts chromosomalen Positionierung angeordnet und in den vier Quadranten zum Vergleich positioniert identisch. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig3.jpg" /> Abbildung 3: PlattenwärmeKarte Anzeigen Kreuzungspunkt (Cp) Wert für eine qPCRTag Experiment. Das ist die gleiche Datenmenge wie in Abbildung 2 und die Platte Layout ist daher identisch. N / A bezieht sich auf &quot;keine Verstärkung.&quot; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analyse - ein hoher Durchsatz, Echtzeit-PCR-Assay für Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.8K Aufrufe.  Institute for Systems Genetics. Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Serie: qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Forschung

Biologie

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitative Real-Time PCR unter Verwendung der Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Mittels quantitativer Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Profiling von Pre-micro RNAs und microRNAs mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

High-Throughput-Assay Verzuckerung für Lignocellulose-Materialien

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

Ein PCR-basierte Genotypisierung Methode, zwischen Wildtyp-und Ziersorten Unterscheiden von Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice-Cap: Ein Verfahren zur Züchtung von Arabidopsis Und Tomatenpflanzen in 96-well-Platten für High-Throughput-Genotypisierung

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Schnelle und effiziente Verwendung von Zebrafisch-Genotypisierung PCR mit Hochauflösende Schmelzanalyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Ein hoher Durchsatz MHC II-Bindungsassay für die quantitative Analyse von Peptid-Epitope

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...