Diese Arbeit wurde durch persönliche Stipendien aus dem Wellcome Trust an Beate Kampmann (056.608, GRO77273) finanziert.

1. Vorbereitung der BCG lux Reporter Mykobakterien Lager <ol><li> Wachsen BCG lux (M. bovis BCG Montreal Stamm mit dem Shuttle-Plasmid pSMT1 umgewandelt) unter Schütteln bei 200rpm bis Mitte logarithmischen Phase in Middlebrook 7H9-Bouillon mit 0,2% Glycerin, 0,05% zwischen 80 und 10% ADC Bereicherung. </li><li> Bereiten Sie 1 ml einer 1:10-Verdünnung von BCG lux Kultur in sterile PBS in einem Luminometer Rohr (900μl PBS + 100 &amp;mgr; BCG lux Kultur) in zweifacher Ausfertigung. </li><li> Laden Röhrchen mit N-Decyl-Aldehyd (Luciferase Enzym-Substrat) auf der Rückseite der Maschine und gewährleistet den Deckel befestigt ist, und Röhren statt. </li><li> Prime Luminometer Injektor mit Substrat über die Prime-Programm auf 100 ucl x 3 in jeder der 3 leere Grundierung Rohre in das Luminometer platziert zu injizieren. </li><li> Legen Sie die 2 Röhren in das Luminometer und nehmen Messungen über ein Programm zur Injektion 100 ucl von Substrat in jedes Röhrchen setzen und zu lesen für 20 sec in 1 Sekunden-Intervallen. </li><li> Wenn die Aktie 1x10 8 RLU / ml zu 2x10 8 RLU / ml (dies dauert ca. 3-4 Tagen Wachstum) erreicht hat, das gleiche Volumen von sterilem 30% Glycerin, um die Kultur in einem 50ml Falcon-Röhrchen und vorsichtig mischen. </li><li> Aliquot 1,5 ml Volumen in beschriftete 2ml Schraubverschluss Mikroröhrchen und bei -80 ° C. </li></ol> 2. Bestimmen Lager RLU / CFU Korrelation und die Inhalte der Aliquots <ol><li> Gib 15 ml Middlebrook 7H9 Kulturmedium mit 10% ADC Ergänzung zu einem 200ml Erlenmeyerkolben mit einem belüfteten Kappe. </li><li> Fügen Sie 15μl der Hygromycin und 30μl 20% Tween. </li><li> Nehmen Sie ein Fläschchen mit BCG lux aus dem Gefrierschrank und Auftauen bei Raumtemperatur (RT) in der Werkbank. Den Inhalt des Fläschchens, das Medium und ziehen Sie die Kappe. </li><li> Inkubieren unter Schütteln bei 200rpm bei 37 ° C für 4 Tage. </li><li> An jedem Tag, Make-up seriellen 10-fach Verdünnungen (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000 und 1:100.000) für CFU Bestimmung. </li><li> Richten Sie den gleichen Verdünnungen parallel und duplizieren, um Lumineszenz zu bestimmen (siehe Teil 1,2-1,6). </li><li> Bereiten Sie zwei 3-Fach Platten Middlebrook 7H11-Agar (1 l flüssiges Medium mit 0,5% Glycerin, 10% OADC ergänzen, 1 ml 20% Tween und 1 ml Hygromycin). </li><li> Platte aus 100 &amp;mgr; l jeder Verdünnung auf ein Segment jeder Platte mit separaten Spreizer, verteilen die Flüssigkeit gleichmäßig auf die einzelnen Kammer. </li><li> Seal jede Platte mit Parafilm, in einem sterilen Plastikbeutel, Dichtung mit Autoklav-Band, und bei 37 ° C für 2 Wochen mit Deckel nach unten. </li><li> Überprüfen Sie regelmäßig, bis KBE erscheinen (2-3 Wochen). </li><li> Zum Zählen Kolonien, entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator nehmen und auf eine Kolonie zu begegnen. Berechnen Sie den Mittelwert für jede Verdünnung aus dem Duplikat-Platten. </li><li> Berechnen Sie die RLU / CFU-Verhältnis mit entsprechenden RLU und KBE-Zählungen für jede Verdünnung. Das Verhältnis sollte zwischen 3 und 5 RLU / CFU werden. </li></ol> 3. Vorbereitung der BCG lux Kultur für die Impfung in Vollblut <ol><li> Gib 15 ml Middlebrook 7H9 Kulturmedium mit 10% ADC Ergänzung zu einem 200ml Erlenmeyerkolben mit einem belüfteten Kappe. </li><li> Fügen Sie 15μl der Hygromycin und 30μl 20% Tween. </li><li> Nehmen Sie ein Fläschchen mit BCG lux aus dem Gefrierschrank und Auftauen bei RT in der Werkbank. Den Inhalt des Fläschchens, das Medium und ziehen Sie die Kappe. </li><li> Inkubieren unter Schütteln bei 200rpm bei 37 ° C für 2 bis 4 Tagen. </li><li> Bereiten Sie 1 ml einer 1:10-Verdünnung von BCG lux Kultur in sterile PBS in einem Luminometer Rohr (900μl PBS + 100 &amp;mgr; BCG lux Kultur) in zweifacher Ausfertigung. </li><li> Prime Luminometer mit dem Substrat (wie oben beschrieben), vorsichtig vortexen der 2 Röhren und laden in das Luminometer und nehmen Messungen (wie oben beschrieben). </li><li> Verwenden Sie diese Lesung zu verdünnen die Kultur in PBS zu einem Gegenwert von 7x10 6 RLU (dieser wird ein Inokulum von etwa 2x10 5 CFU / ml Blut und einem Verhältnis von BCG an Monozyten von etwa 1:1 zu geben, unter der Annahme einer Monozytenzahl des Gebens etwa 2x10 5 bis 4x10 5 Monozyten pro ml Blut). </li></ol> 4. Vorbereitung von Vollblut <ol><li> Nehmen Sie 3 bis 5 ml Venenblut in ein Röhrchen mit frei von Konservierungsmitteln Heparin. </li><li> Übertragen Sie die Blut zu einem 50ml Falcon-Röhrchen und verdünnt mit dem gleichen Volumen RPMI 1640 mit Glutamin und 25 mM HEPES (keine Pen / Strep). </li><li> Aliquot 900μl verdünntes Blut in dreifacher Ausfertigung in sterile bijou Rohre für jeden Zeitpunkt (6 Röhren in insgesamt:. 3 für 0HRS und 3 für 96 Stunden Einrichten zusätzlicher Röhren für zusätzliche Zeitpunkte, falls erforderlich. </li><li> Aliquot 900μl der Middlebrooks 7H9 Kulturmedium mit 10% ADC ergänzen + 50μg/ml Hygromycin (dem gleichen Medium wie die Kultur der BCG lux verwendet) in die für das Wachstum steuert duplizieren. </li><li> Add 100 &amp;mgr; der verdünnten BCG lux in jedes Röhrchen Blut, und die 2 WachstumskontrolleRohren. </li><li> Gut mischen und statt der 3 Bijous für die 96hr Zeit-Punkt und die 2 Wachstum steuert auf ihrer Seite in dem schaukelnden Brutschrank bei 37 ° C, 20 U / min (CO 2 nicht erforderlich). </li></ol> 5. Mess-Lumineszenz (bei 0 STUNDEN und 96 Std.) <ol><li> Centrifuge die 3 Bijous bei 2000g für 10 min. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig 300μl Überstand, ohne das Pellet und in 2ml Schraubverschluss Röhrchen zu bei -80 ° C einzufrieren für nachfolgende Zytokin-Analyse. </li><li> Fügen Sie 300μl PBS für jeden bijou, um die Lautstärke der Überstand entfernt zu ersetzen. </li><li> Saugen Sie die Inhalte der einzelnen bijou in die entsprechenden 50ml Falcon-Röhrchen und fügen 8ml destilliertem Wasser in jedes Röhrchen. Beginnen Sie einen Timer für 10 min. Nb: Dies ist eine Zeit-und Kleinschreibung Schritt, und dieser Inkubation darf nicht länger als 10 min, beginnend ab, wenn die Zellen zum ersten Mal in Kontakt mit Wasser. </li><li> Spülen Sie jede bijou mit 2 ml destilliertem Wasser und Vortex für 5 Sekunden, bevor Kippen in die entsprechenden Falcon-Röhrchen. </li><li> Am Ende der 10 Minuten Inkubation Zentrifuge der Falcon-Röhrchen bei 2000g für 10 Minuten. </li><li> Dekantieren Überstand in Surfanios Desinfektionsmittel. </li><li> Fügen Sie ein paar Glasperlen zu jedem Pellet und vortexen. </li><li> Add 1 ml sterilem PBS in jedes Röhrchen und vortexen. </li><li> In Luminometer Rohre, machen 1:10 Verdünnungen für jede Probe in zweifacher Ausfertigung mit PBS (900μl PBS + 100 &amp;mgr; Probe) und an der 96hr Zeitpunkt. Nehmen Sie die gleichen Verdünnungen für jeden der das Wachstum steuert. </li><li> Vorsichtig vortexen die Rohre und laden in das Luminometer und nehmen Messungen (wie oben beschrieben) Nb: Readings zwischen dreifach von der gleichen Probe sollte innerhalb von 15% voneinander werden. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Es ist wichtig, um Bakterien in der logarithmischen Phase des Wachstums für das gesamte Blut lux-Assays verwenden, dh über 48-72 Stunden angewachsen vor Inokulation der Proben, wie Stoffwechselaktivität ist suboptimal, wenn entweder direkt aus dem Gefrierschrank oder in der stationären Phase. Die vor Wachstum sollten standardisiert werden für eine Reihe von Experimenten, um entweder 48 oder 72 Stunden, um die Variabilität zu vermeiden. Abbildung 1 zeigt die Wachstumskurve einer repräsentativen Kultur des BCG lux. Die Verdoppelungszeit beträgt etwa 24 Stunden bis zur stationären Phase erreicht ist. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig1.jpg" /> Abbildung 1. Representative Wachstumskurve BCG lux über 96 Stunden in 7H9 Medium und Korrelation von RLU und CFU. Obwohl RLU-Werte immer mit CFU korrelieren, kann die Zahl der RLU entspricht einer CFU je nach Lager, weshalb es ratsam, die gleiche eingefroren Lager in einer Reihe von Experimenten verwenden, um eine konsistente Multiplizität der Infektion zu gewährleisten ist ( MOI). Tabelle 1 zeigt ein Beispiel für RAW-Datum zum Zeitpunkt der Impfung (T 0) und bei 96 Stunden. Das Wachstum Verhältnisse sind nach folgender Formel berechnet T 96 / T 0, aber auch andere Zeitintervalle können natürlich auch gemessen werden. Es ist jedoch ratsam, die Kulturen jenseits 96 Stunden zu verwenden, da erhebliche Zelltod eintritt. <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/3332/3332table1.jpg" /> Tabelle 1. Beispiel von Rohdaten zum Zeitpunkt der Impfung (T0) und bei 96 Stunden (T96) und berechnete Wachstum Verhältnisse von 3 erwachsenen Spendern. Abhängig von den verfügbaren Antigen-spezifischen Gedächtnis Reaktionen und eventuell auch der neutrophilen Granulozyten, variieren Wachstum Verhältnisse zwischen Individuen, wie hier in Abbildung 2 im Blut von Kindern mit und ohne HIV-Infektion gezeigt. Im Durchschnitt kleine Kinder haben ein höheres Wachstum Verhältnisse als Erwachsene, haben Tuberkulin-Hauttest (TST) + ve Einzelpersonen geringeres Wachstum Verhältnisse als TST-ve Individuen und HIV-infizierten Patienten haben hohes Wachstum Verhältnisse durch den Mangel an CD4 T-Zell-Population, einer der wichtigsten Vermittler der zellulären Immunantwort gegen Mykobakterien. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig2.jpg" /> Abbildung 2 Inter-Donor Variabilität:. Growth-Verhältnisse von T 0 im Vergleich zu 96 Stunden für eine Reihe von Patienten, je nach zugrunde liegende HIV-Status. Reproduzierbarkeit des Wachstums Verhältnisse über einen längeren Zeitraum ist in Abbildung 3, die Ergebnisse von 64 Spendern blutete zweimal über einen Zeitraum von 12 Monaten und von einem einzigen Spender blutete immer wieder zur Kontrolle Experimente zusammengefasst dargestellt. Mögliche Ursachen der Variabilität könnten Veränderungen in mykobakterielle Sensibilisierung oder Variabilität innerhalb Ebenen der Host-Zytokine, wie in vielen Bioassays beobachtet werden. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig3.jpg" /> Abbildung 3. (A) Single Spender auf 12 Anlässe über 12 Monate. (B) mehrere (64) Spender auf 2 Gelegenheiten über 12 monate.

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	<li>Cheng, S. H., Walker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+increased+anti-mycobacterial+activity+in+peripheral+blood+monocytes+after+BCG+vaccination+in+British+school+children.">Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children.</a> Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).</li><li>Cheng, S. H., Walker, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+antimycobacterial+activity+before+and+after+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+in+Chingleput,+India,+and+London,+United+Kingdom.">Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom.</a> Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).</li><li>Silver, R. F., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+human+monocytes:+virulence+correlates+with+intracellular+growth+and+induction+of+tumor+necrosis+factor+alpha+but+not+with+evasion+of+lymphocyte-dependent+monocyte+effector+functions.">Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions.</a> Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).</li><li>Hoft, D. F., Worku, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+relationships+between+immune-mediated+inhibition+of+mycobacterial+growth+and+other+potential+surrogate+markers+of+protective+Mycobacterium+tuberculosis+immunity.">Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity.</a> J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).</li><li>Worku, S., Hoft, D. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Bakterizide Assays im Rahmen der Tuberkulose Impfstoff-Forschung sind auch in Tiermodellen etabliert, wo sie angewendet werden, um potenziell vielversprechenden Impfstoffkandidaten Bildschirm. Reduzierung der bakteriellen Belastung in verschiedenen Organen Funktionen wie die wichtigsten Auslesen der Immunogenität. Die erste Generation von Menschen bakterizide Assays wurden unter Verwendung Makrophagen allein, infiziert mit M. Tuberkulose. CFU diente als Haupt-Auslesen von Mykobakte...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Cat No </td></tr><tr><td> BCG lux </td><td> Verschiedene </td><td> n / a </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H11-Agar </td><td> Becton Dickinson </td><td> 283810 </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H9-Bouillon </td><td> BD Biosciences </td><td> 271310 (500g) </td></tr><tr><td> Middlebrook ADC Bereicherung </td><td> BD Biosciences </td><td> 212352 </td></tr><tr><td> Middlebrook OADC ergänzen </td><td> Becton Dickinson </td><td> 212240 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 274364 </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G5150 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Roche </td><td> 10843555001 (20ml) </td></tr><tr><td> N-Decyl-Aldehyd </td><td> Sigma </td><td> D7384-100G </td></tr><tr><td> Ethanol (&gt; 99,7%) </td><td> VWR </td><td> 101077 </td></tr><tr><td> Sterile PBS </td><td> In House </td><td> n / a </td></tr><tr><td> RPMI-1640 mit L-Glutamin, 25 mM HEPES </td><td> Sigma </td><td> R0883 </td></tr><tr><td> Sterilem destilliertem Wasser </td><td> In House </td><td> n / a </td></tr><tr><td colspan="3"> Ausstattung </td></tr><tr><td> Rohr Luminometer (injizierbare Port erforderlich) </td><td> Berthold AutoLumat LB953 oder Einrohr-Luminometer Sirius </td><td></td></tr><tr><td> Luminometer Röhren, 12 x 75mm, Pyrex randlose </td><td> Corning von VWR </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> Erlenmeyer-Kolben mit belüfteten Kappen, sterile Polycarbonat 250ml </td><td> Corning über Fisher Scientific </td><td> 2150329 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Blutentnahmeröhrchen (frei von Konservierungsmitteln Heparin) </td><td> BD </td><td> 367676 </td></tr><tr><td> 50ml Falcon-Röhrchen, konisch </td><td> BD </td><td> 352077 </td></tr><tr><td> 7ml Sterilin Probe Polypropylen bijou Rohre </td><td> VWR </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> Sterilin Universal-Container (30 ml) </td><td> Laboratory Analysis LTD </td><td> 128C </td></tr><tr><td> Glasperlen 2mm Durchmesser </td><td> SigmaAldrich </td><td> Z143928 </td></tr><tr><td> 10ml Pipetten und Pipettenspitzen Jungen </td><td> alle </td><td></td></tr><tr><td> 1000μl und 200 ul Pipetten-und Filterspitzen </td><td> alle </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Allgemeine Laborausstattung: </td></tr><tr><td> Class II Sicherheitsschrank Schrank </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kühlschrank (4 ° C) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zentrifuge </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Schüttler-Plattform (180 0) zu Röhrchen mischen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Orbital Shaker Incubator Set bei 37 ° C für den Anbau von bis Bakterienkulturen </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged bcg or m.tb (bcg lux/m.tb lux)

Funktionale Tests sind seit langem eine wichtige Rolle bei der Messung der Immunogenität eines bestimmten Impfstoff gespielt. Dies wird üblicherweise als Serum bakterizide Titer ausgedrückt. Studium der Serum bakterizide Titer in Reaktion auf Impfstoffen für Kinder haben es uns zur Entwicklung und Validierung cut-off Werte für schützende Immunantworten und wie cut-offs sind in den Routineeinsatz. Keine solche Assays wurden nach vorne in die Routine Beurteilung von Impfstoffen, die vor allem die zellvermittelte Immunität in Form von Effektor-T-Zell-Reaktionen, wie z. B. TB-Impfstoffe induzieren genommen. Im Tiermodell ist die Leistung eines bestimmten Impfstoff routinemäßig in standardisierten bakterizide Assays ausgewertet und alle aktuellen Roman TB-Impfstoff-Kandidaten haben diesen Schritt in ihrer Auswertung wurden die vor dem 1. Humanstudien Phase unterzogen. Die Beurteilung der Immunogenität und damit die Wahrscheinlichkeit der Schutzwirkung von neuartigen Anti-TB-Impfstoffe sollten im Idealfall durchlaufen eine ähnliche stufenweise Auswertung in der menschlichen Modellen nun auch eine Bestimmung in bakterizide Assays. Bakterizide Assays im Rahmen der Tuberkulose Impfstoff-Forschung sind bereits gut in den Tiermodellen etabliert, wo sie angewendet werden, um potenziell vielversprechenden Impfstoffkandidaten Bildschirm. Reduzierung der bakteriellen Belastung in verschiedenen Organen Funktionen wie die wichtigsten Auslesen der Immunogenität. Es wurden jedoch keine solchen Tests in klinischen Studien für neue Anti-TB-Impfstoffe bisher einbezogen. Zwar gibt es noch Ungewissheit über die genauen Mechanismen, die von Mykobakterien in humanen Makrophagen töten führen, ist die Interaktion von Makrophagen und T-Zellen mit Mykobakterien eindeutig erforderlich. Der Test in diesem Papier beschrieben stellt eine neuartige Generation von bakterizide Assays, die Untersuchungen solcher Schlüssel zellulären Komponenten ermöglicht mit allen anderen zellulären und humoralen Faktoren, die in Vollblut ohne Annahmen bezüglich ihrer relativen individuellen Beitrag. Der Test von unserer Gruppe beschrieben werden kleine Mengen von Blut und hat bereits in Studien an Erwachsenen und Kindern in TB-endemischen Einstellungen eingesetzt. Wir haben Immunogenität des BCG-Impfstoffes gezeigt, erhöhtes Wachstum von Mykobakterien bei HIV-positiven Patienten, sowie die Wirkung von anti-retroviralen Therapie und Vitamin D auf Mykobakterien Überleben in vitro. Hier fassen wir die Methodik, und präsentieren Ihnen unsere Reproduzierbarkeit Daten mit diesem relativ einfachen, kostengünstigen und Feld-freundlichen Modell. Hinweis: Definitionen / Abkürzungen BCG lux = M. bovis BCG, Montreal Belastung, mit Shuttle-Plasmid pSMT1 Durchführung der luxAB Gene von Vibrio harveyi verwandelt, die unter der Kontrolle der Mykobakterien GroEL (Hsp60)-Promotor. KBE = Kolonie bildende Einheiten (ein Maß für Mykobakterien Lebensfähigkeit).

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A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

Wir beschreiben einen alternativen Ansatz, um die Auszählung von Mykobakterien<em&gt; In-vitro-</em&gt;, Die Reporter-Gen verwendet getaggt Mykobakterien statt Kolonie-bildenden Einheiten (KBE). &quot;Survival&quot; von Organismen sowie Host-Reaktion-Marker sind gleichzeitig gemessen Bereitstellung eines kostengünstigen, vielseitig und funktionsfähiges System für Untersuchungen der Wirt / Pathogen-Interaktionen im Rahmen der Tuberkulose.

A Functional Whole Blood Assay zur Rentabilität von Mykobakterien Measure, mit Reporter-Gene BCG oder M. Tb (BCG Tagged Lux / M. Tb Lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

a-functional-whole-blood-assay-to-measure-viability-mycobacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

13.8K Aufrufe.  Imperial College London. Wir beschreiben einen alternativen Ansatz, um die Auszählung von Mykobakterien In-vitro-, Die Reporter-Gen verwendet getaggt Mykobakterien statt Kolonie-bildenden Einheiten (KBE). "Survival" von Organismen sowie Host-Reaktion-Marker sind gleichzeitig gemessen Bereitstellung eines kostengünstigen, vielseitig und funktionsfähiges System für Untersuchungen der Wirt / Pathogen-Interaktionen im Rahmen der Tuberkulose.

Serie: A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many advantages for ease and standardization of immunological assessments, but detrimental effects of this process have been observed on some cell subsets, such as granulocytes, B cells, and dendritic cells 1-3. Assaying fresh leukocytes gives a more accurate picture of the in vivo state of the cells, but is often difficult to perform in the context of large clinical trials. Fresh cell assays are dependent upon volunteer commitments and timeframes and, if time-consuming, their application can be impractical due to the working hours required of laboratory personnel. In addition, when trials are conducted at multiple centers, laboratories with the resources and training necessary to perform the assays may not be located in sufficient proximity to clinical sites. To address these issues, we have developed an 11-color antibody staining panel that can be used with Trucount tubes (Becton Dickinson; San Jose, CA) to phenotype and enumerate the major leukocyte populations within the peripheral blood, yielding more robust cell-type specific information than assays such as a complete blood count (CBC) or assays with commercially-available panels designed for Trucount tubes that stain for only a few cell types. The staining procedure is simple, requires only 100 &mu;l of fresh whole blood, and takes approximately 45 minutes, making it feasible for standard blood-processing labs to perform. It is adapted from the BD Trucount tube technical data sheet (<a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">version 8/2010</a>). The staining antibody cocktail can be prepared in advance in bulk at a central assay laboratory and shipped to the site processing labs. Stained tubes can be fixed and frozen for shipment to the central assay laboratory for multicolor flow cytometry analysis. The data generated from this staining panel can be used to track changes in leukocyte concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific cell types of interest. In this report, we demonstrate the procedure used by blood-processing lab technicians to perform staining on fresh whole blood and the steps to analyze these stained samples at a central assay laboratory supporting a multicenter clinical trial. The video details the procedure as it is performed in the context of a clinical trial blood draw in the HIV Vaccine Trials Network (HVTN).

In this report, we demonstrate the staining and analysis steps of a phenotyping assay performed on fresh whole blood to enumerate major innate and adaptive leukocyte populations. We emphasize considerations for performing these procedures in the context of a multicenter clinical trial.

Aufzählung der wichtigsten peripheren Blut Leukozyten Populationen für Multicenter Clinical Trials mit einem Vollblut Phenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell anemia 1-3. Due to the presence of multitude of antigens on the RBC surface (~308 known antigens 4), patients in the chronic blood transfusion therapy develop alloantibodies due to the miss match of minor antigens on transfused RBCs 4, 5. Grafting of hydrophilic polymers such as polyethylene glycol (PEG) and hyperbranched polyglycerol (HPG) forms an exclusion layer on RBC membrane that prevents the interaction of antibodies with surface antigens without affecting the passage of small molecules such as oxygen ,glucose, and ions3. At present no method is available for the generation of universal red blood donor cells in part because of the daunting challenge presented by the presence of large number of antigens (protein and carbohydrate based) on the RBC surface and the development of such methods will significantly improve transfusion safety, and dramatically improve the availability and use of RBCs. In this report, the experiments that are used to develop antigen protected functional RBCs by the membrane grafting of HPG and their characterization are presented. HPGs are highly biocompatible compact polymers 6, 7, and are expected to be located within the cell glycocalyx that surrounds the lipid membrane 8, 9 and mask RBC surface antigens10, 11.

The cell membrane modification of red blood cells (RBCs) with hyperbranched polyglycerol (HPG) is presented. Modified RBCs were characterized by aqueous two phase partitioning, osmotic fragility and complement mediated lysis. The camouflage of surface proteins and antigens was evaluated using the flow cytometry and Micro Typing System (MTS) blood phenotyping cards.

Antigene geschützten funktionellen Red Blood Cells durch die Membran Pfropfung von Compact hyperverzweigten Polyglycerinen

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Verwendung des Overlay-Assay zur qualitativen Messung bakterielle Produktion und die Sensibilität für Pneumokokken Bacteriocine

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

Eine einfache Durchflusszytometrischer Methode Glukoseaufnahme und Glukosetransporter-Expression für Monozytensubpopulationen in Vollblut zu messen

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

Die protektive Wirksamkeit und pulmonale Immunantwort nach subkutaner und intranasale BCG Verabreichung an Mäuse

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

Die Verwendung eines Monozyten einschichtiges Assay Fcy rezeptorvermittelte Phagozytose zur Bewertung

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for protection against children&#39;s severe TB meningitis and some forms of disseminated TB, but fails to protect against pulmonary TB, which is the most prevalent form of the disease. Promising strategies to improve BCG currently rely either on its transformation with genes encoding immunodominant M. tuberculosis (Mtb)-specific antigens and/or complementation with genes encoding co-factors that would stimulate antigen presenting cells. Major limitations to these approaches include low efficiency, low stability, and the uncertain level of safety of expression vectors. In this study, we present an alternative approach to vaccine improvement, which consists of BCG complementation with exogenous proteins of interest on the surface of bacteria, rather than transformation with plasmids encoding corresponding genes. First, proteins of interest are expressed in fusion with monomeric avidin in standard E. coli expression systems and then used to decorate the surface of biotinylated BCG. Animal experiments using BCG surface decorated with surrogate ovalbumin antigen demonstrate that the modified bacterium is fully immunogenic and capable of inducing specific T cell responses. Altogether, the data presented here strongly support a novel and efficient method for reshaping the current BCG vaccine that replaces the laborious conventional approach of complementation with exogenous nucleic acids.

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

A novel technique for rapid antigen display on a bacterial surface is presented, which involves surface biotinylation followed by exposure to proteins of interest in fusion with monomeric avidin. Loading BCG with selected antigens successfully improves its immunogenicity, suggesting that surface decoration can replace traditional genetic approaches.

Ausdruck der exogene Antigene im Mycobacterium Bovis BCG Impfstoff über nicht-genetische Oberfläche Dekoration mit dem Avidin-Biotin-System

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

Optimierte Interferon-Gamma ELISpot Assay zur Maßnahme T-Zell-Antworten im Meerschweinchen-Modell nach der Impfung

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...