Diese Arbeit wurde von der Agence Nationale pour la Recherche und durch den European Research Council finanziert.

Der Test arbeitet in verschiedenen Formaten, jedoch empfehlen wir Verkleinerung das Probenvolumen um Reagenzien, insbesondere CCF4-AM zu speichern. Deshalb wird das folgende Protokoll für feste oder HeLa-Zellen THP-1-Makrophagen-ähnlichen Zellen in einer 96-Well-Format beschrieben, dann für lebende HeLa-Zellen in 35 mm Petrischalen mit Glasboden. Der Assay kann für andere Krankheitserreger anzupassen. Neben Shigella-Infektion, beschreiben wir die Assay für THP-1 phagozytierenden verschiedenen m y cobacterial Stämme. Wichtig ist, dass nach CCF4-AM Laden, verlangen, dass alle Reagenzien und Puffer einschließlich Waschpuffern das Vorhandensein von Probenecid bei 1 mM. Probenecid ein Anion Kanal-Inhibitor, der cytosolischen Beibehaltung CCF4 fördert während aller Schritte des Protokolls. Feste Proben sollten innerhalb von ein paar Stunden nach dem Experiment erworben werden, da die CCF4 Signal ist nicht für lange Zeiträume stabil. 1. CCF4 Assay auf fixierten Proben mit Shigella flexneri (96 Well-Platten) <ol><li> Vorbereiten Bakterien für Übernacht-Kulturen. Impfen die bakteriellen Vorkulturen Wildtyp (M90T AFAI) und Mutante (BS176 AFAI) Stämme 1 Tag vor der Infektion in 8 ml Trypsin Casein-Soja-Bouillon (TCSB) mit Ampicillin (50 ug / ml) in einem Shaker ergänzt bei 37 ° C über Nacht . </li><li> Plating Zellen für eine Infektion. Seed HeLa-Zellen in 96-Well-Platten 1 Tag vor Infektion in einer Dichte von 5 × 10 3 Zellen pro Vertiefung in DMEM mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) und 1% Penicillin-Streptomycin in einer 5% CO 2-Inkubator in einem Endvolumen von 100 ul. Im Fall von THP-1-Makrophagen-ähnlichen Zellen wird die Zelle Plattieren 2 Tage vor Infektion in einer Dichte von 5 × 10 4 Zellen / Vertiefung durchgeführt, und sie sind mit 30 nM Phorbolmyristatacetat (PMA) in RPMI mit 10% inkubiert fötalem Kälberserum (FCS), 1% Penicillin-Streptomycin und 0,05 mM 2-Mercaptoethanol. </li><li> Vorbereiten Bakterien für Subkultur. Impfen Nacht Bakterienkulturenbei einer Verdünnung 1/100 in TCSB mit 50 ug / ml Ampicillin in einem Schüttler bei 37 ° C und werden für 2,5 h (OD600 = 0,3 bis 0,4). </li><li> Loading-Zellen mit CCF4-AM. Bereiten Sie die CCF4-AM Laden-Mix für ein Endvolumen von 25 ul pro Well mit 1 mM Probenecid (Sigma), 1,5 uM CCF4-AM (6 pM bei THP-1) und 1,25 ul Laden Lösung B (100 mg / ml Pluronic F127-Tensid in DMSO/0.1% Essigsäure entlang CCF4-AM LiveBlazer geladen Kit von Invitrogen) in EM-Puffer (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 0,8 mM MgCl 2, 5 mM Glucose, 25 mM HEPES bei pH 7,3). Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und fügen Sie 25 ul CCF4-AM Laden Mischung pro Vertiefung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 2,5 Stunden. </li><li> Vorbereiten Bakterien für eine Infektion. Spin 1 ml der bakteriellen Subkulturen bei 9.000 rpm für 1 min. Waschen Sie einmal mit 500 ul PBS, Schleudern bei 9000 rpm für 1 min und Resuspendieren in 500 ul PBS mit 10 ug / ml Poly-L-Lysin (Sigma) und 40 ug / ml β-lacta ergänztMase (Sigma). Nach 10 min Inkubation auf einem rotierenden Rad bei Raumtemperatur, einmal waschen mit 500 ul PBS resuspendieren und Bakterien in 500 ul EM Puffer / 1 mM Probenecid. </li><li> Handy-Infektion und Fixierung. Waschen Sie die Zellen einmal mit 150 ul PBS / 1 mM Probenecid, bereiten eine Mischung von 10 ul von Bakterien in einem Gesamtvolumen von 100 ul EM Puffer / 1 mM Probenecid resuspendiert und verteilen sie in jede Vertiefung. Nach 15 min Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur, schalten Sie die Platte auf 37 ° C für 1 Stunde (90 min bei THP-1) mit 150 ul PBS / 1 mM Probenecid waschen und fix mit 50 ul Paraformaldehyd 4% / 1 mM für 10 min im Dunkeln Probenecid. Dann, mit 150 ul PBS / 1 mM Probenecid, für 30 min mit 30 ul 10 uM Kerne Farbstoff DRAQ5 (Biostatus) inkubieren waschen, mit 150 ul PBS / 1 mM Probenecid waschen und verlassen Proben in 100 ul PBS / 1 mM Probenecid. </li><li> Acquisition Einstellungen festen Proben. Erwerb erfolgt entweder über (i) eine invertierte Epifluoreszenz microszu bewältigen mit einem 20x (0.5 Numerische Apertur (NA), 2.1 Arbeitsabstand (WD)) oder 40x (NA 0,75, 0,72 WD) N-Plan Luftobjektiv oder (ii) mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 10-fach Objektiv. Fluoreszenz-Bildgebung mit Anregung bei 405 nm durchgeführt (Semrock, FF01-387/11-25) und Emission über 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) und 535 nm (Semrock, erkannt FF01-520/35- 25) mit Belichtungszeiten von 5 ms (Durchlicht), 1000 msec (535 nm) und 500 ms (450 nm). Konfokale Bildgebung unter Verwendung des folgenden Belichtungszeit: 240 ms (450 nm) und 360 ms (535 nm) für die 405-nm-Laser (870 uW), 640 ms (DRAQ5) für die 640-nm-Laser (2560 uW). </li><li> Post-Akquisition-Analyse. Anschließend werden die Bilder von einem Computer-Algorithmus, der automatisch Scoring des Fluoreszenz-Signals für jeden einzelnen Zellen ermöglicht analysiert. Software wie Metamorph 7.1 oder Acapella kann verwendet werden, um ein Skript für die Messung des Verhältnisses zwischen den 450nm und 535nm Emission Signale zu schaffen (auf Anfrage). Zu beachten ist, ermöglicht die Verwendung eines Fokuskalibrierung gekoppelt automatisierte Mikroskopie während der Erfassung Erfassen Dutzenden von verschiedenen Positionen in mehreren Mulden gleichzeitig. </li></ol> 2. CCF4 Assay auf Live-Samples mit Shigella flexneri (35 mm Glas-bottom-Format, MatTek) <ol><li> Vorbereiten Bakterien für Übernacht-Kulturen. Gehen Sie wie zuvor beschrieben. </li><li> Plating Zellen für eine Infektion. Seed HeLa-Zellen in 35 mm Glasboden Kulturschalen (10 mm MatTek Microwell, MatTek corporation) 1 Tag vor der Infektion bei einer Dichte von 2 x 10 5 Zellen / Schale in einem Gesamtvolumen von 2 ml. </li><li> Vorbereiten Bakterien für Subkultur. Gehen Sie wie zuvor beschrieben. </li><li> Loading-Zellen mit CCF4-AM. Bereiten Sie die CCF-AM Laden Mix wie vorher für ein Endvolumen von 2 ml pro Schale beschrieben. Vor dem Laden, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. </li><li> Vorbereiten Bakterien für eine Infektion. Gehen Sie wie zuvor beschrieben. </li><li> AcquisitIonen-Einstellungen von Live-Proben. Die Erfassung wird für 60 min alle 90 sec mit einer invertierten Epifluoreszenzmikroskop mit einem 20x (NA 0.5, 2.1 WD) oder 40x (NA 0,75, 0,72 WD) N-Plan Luftobjektiv in einem 37 ° C Heizkammer durchgeführt. Fluoreszenz-Bildgebung mit Anregung bei 405 nm durchgeführt (Semrock, FF01-387/11-25) und Emission über 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) und 535 nm (Semrock, erkannt FF01-520/35- 25) mit Belichtungszeiten von 5 ms (Durchlicht), 200 ms (535 nm) und 100 ms (450 nm). </li><li> Handy-Infektion und Live-Akquisition. Waschen Sie die Zellen einmal mit 2 ml PBS / 1 mM Probenecid, 2 ml EM / 1 mM Probenecid, montieren Sie die Schüssel auf dem Tisch des Mikroskops und starten Sie die Übernahme. Nach 6 min (Zeitpunkt 4), setzen Sie den Erwerb zu halten, fügen Sie 250 ul Bakterien Resuspension auf der Oberseite der Zellen und starten Sie den Erwerb. </li><li> Post-Akquisition-Analyse. Filme können visualisiert werden mit Metamorph oder ImageJ. 450/535 nm Intensitätsverhältnissen für jeden einzelnenDual-Zelle unter Verwendung ImageJ werden. Wie bereits erwähnt, ermöglicht die Verwendung eines Fokuskalibrierung gekoppelt automatisierte Mikroskopie während der Erfassung Erfassen mehreren verschiedenen Positionen in Abhängigkeit von dem Zeitabstand. </li></ol> 3. CCF4 Assay auf Fixed Proben unter Verwendung von Mykobakterien (96 Well Format) <ol><li> Vorbereiten Bakterien. Wachsen Mykobakterienstämme bis zur mittleren logarithmischen Phase in 7H9 Albumin enthält Dextrose Katalase (ADC) bei 30 ° C (für Mycobacterium marinum) oder 37 ° C (für Mycobacterium bovis BCG und Mycobacterium tuberculosis). </li><li> Plating Zellen für eine Infektion. Platte THP-1 Makrophagen 2 Tage vor Infektion Inkubation mit 30 nM PMA in RPMI mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), 1% Penicillin-Streptomycin und 0,05 mM 2-Mercaptoethanol in einer 5% CO 2-Inkubator in einem Endvolumen von 100 ul mit einer Dichte von 5 × 10 4 Zellen / Vertiefung. </li><li> Vorbereiten Bakterien für eine Infektion. Harvest Kulturen, waschen und mit PBS resuspendieren vor Beschallung und Filtration durch eine Spritze, um zu vermeiden verklumpen. Bestimmen Sie die Konzentration von jedem Stamm von OD600 Messung und infizieren THP-1-Zellen bei einer MOI von 1:1 bei 30 ° C (für Mycobacterium marinum) oder 37 ° C (für Mycobacterium bovis BCG und Mycobacterium tuberculosis) in RPMI-Medium mit 5% CO 2. Nach 2 Stunden, Entfernen Mittel, 3 x waschen mit PBS und füge alle frisches Medium für 1 bis 2 Tage (im Fall von Mycobacterium marinum) oder 3 bis 7 Tagen (im Falle von Mycobacterium bovis BCG und Mycobacterium tuberculosis). </li><li> Loading-Zellen mit CCF4-AM und Fixierung. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und bereiten die CCF4-AM Laden-Mix, wie zuvor für ein Endvolumen von 25 ul pro Well mit einem CCF4-AM Endkonzentration von 6 uM beschrieben. Die Beladung erfolgt bei Raumtemperatur im Dunkeln für 2 Stunden vor dem Waschen mit 150 ul PBS / 1 mM Probenecid und behebenation mit 50 ul Paraformaldehyd bei 4% ergänzt mit1 mM für 30 min im Dunkeln Probenecid. Dann, mit 150 ul PBS / 1 mM Probenecid waschen und verlassen Proben in 100 ul PBS / 1 mM Probenecid. </li><li> Acquisition Einstellungen und Post-Akquisition-Analyse. Gehen Sie wie bisher in den ersten Absatz mit Shigella flexneri beschrieben. </li></ol> Supplemental Protokoll Fluorimetrische Tests werden durchgeführt, um β-Lactamase-Aktivität an der Oberfläche der Bakterien zu überprüfen. Dies sollte für jeden Bakterienstamm bestimmt ist, in dem beschriebenen Test verwendet werden erfolgen. Zu diesem Zweck sind gewaschenen Bakterien in Kontakt mit 100 nM CCF4-AM (Invitrogen), 50 ug / ml Schweine-Esterase Leberextrakten (Sigma) in 1 ml PBS setzen für 1 Stunde bei 37 ° C im Dunkeln. Lösliche Lactamase 1 mg / ml (Invitrogen) als positive Kontrolle verwendet werden. Dann wird ein Scan-Emission bei 405 nm Anregung unter Verwendung eines PTI Quantamaster Fluorimeter und 1 ml quartz Küvette. Der Verlust von FRET bei 535 nm und das Auftreten eines hohen Spitzenwert 450 nm sichtbar gemacht auf Bakterien neben der CCF4 Sonde.

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Cell Biol. 19, 394-401 (2007).</li><li>van der Wel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M.+leprae+translocate+from+the+phagolysosome+to+the+cytosol+in+myeloid+cells.">M. leprae translocate from the phagolysosome to the cytosol in myeloid cells.</a> Cell. 129, 1287-1298 (2007).</li><li>Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. 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Wir haben nichts zu offenbaren.

Die CCF4-AM/β-lactamase Assay ist eine einfache Methode, um Störungen durch intrazelluläre vacuolar Shigella flexneri und Mykobakterien in verschiedenen Zelltypen induziert verfolgen. Es nutzt eine Lactamase empfindlich zytoplasmatischen FRET Reporter, die von einem aktiven Enzym auf der Oberfläche der Bakterien gespalten wird. Verlust des CCF4-AM Substrat kann leicht durch Zugabe von Probenecid zu allen Lösungen nach dem Laden des Substrats vermieden werden. Wie gezeigt, kann der Test mehrere Zelltypen (Epithelzellen Phagozyten) und Formate (96 Vertiefungen, 35 mm Petrischalen mit Glasboden, 6/12/24 Well-Platten) angepasst werden. Für die Verwendung der 6/12/24 Well-Platte werden sterile Deckgläser am Boden jeder Vertiefung vor der Aussaat der Zellen verteilt. Am Ende des Versuches werden die Deckgläser auf Objektträger in Montage-Medium überführt, wie zum Beispiel Gold-Verlängern Antifade Reagent (Invitrogen). Auf diese Weise wird das Signal über einen längeren Zeitraum stabil nach dem Testim Vergleich zu den Vertiefungen 96 in dem Format Proben in PBS nach Fixierung erhalten bleiben. Die hohen Kosten der CCF4-AM Substrat sollte berücksichtigt vor der Bestimmung des Volumens der Probe zu entnehmen. Das ist, warum wir Verkleinern sind zu empfehlen. Experimente sind teurer in 6/12/24 Well-Format, aber die Signale sind seit Tagen stabil. Im Gegenteil, sind Versuche billiger in der 96-Well-Format, aber sind die Proben am Tag des Experiments analysiert werden. Bemerkenswert ist, daß Live-Experimente auch an der 96-Well oder 384-Well-Format durchgeführt werden. Dies ermöglicht die Durchführung Live-Experiment mit Dutzenden von Bedingungen zur gleichen Zeit (Bakterienmutanten, MOI, Plasmid oder siRNA-Transfektion, Chemikalien usw.) mit einer Anzahl von Positionen pro Vertiefung. Obwohl für Shigella flexneri geeignet, markieren wir, dass &quot;echte&quot; Echtzeit oder Zeitraffer-Experimente sind nicht für Mykobakterien Studien möglich, da die Infektion Zyklus übersteigt messbaren Konzentrationen von CCF4, die im Cytosol zurückgehalten werden kann. FürAus diesem Grund ist die CCF4-AM Substrat auf Zellen angewendet erst nach Einfall erreicht wird. Bei MetaMorph Software für die Erfassung und Analyse verwendet wird, empfehlen wir die Verwendung des Moduls &quot;Bildschirm Übernahme&quot;, die den Erwerb eines ganzen 96/384 Well-Platte mit einer bestimmten Anzahl von Bildern pro Vertiefung ermöglicht. Ferner sind die Module &quot;Beurteilung Bildschirm Daten&quot; können (i) die Visualisierung der Stickbild Mosaik von jeweils gut für jeden Kanal zur gleichen Zeit auf einem großen &quot;Plakat&quot; und (ii) eine spezielle Looping Algorithmus zur Messung der Intensitäten in der 535 und die 450 nm-Kanälen. Auch wenn wir in der Lage gewesen zu vacuolar Bruch durch einzelne Bakterien mit Zeitraffer-Mikroskopie zu messen, möchten wir darauf hinweisen, dass die enzymatische Aktivität auf der Oberfläche der einzelnen Bakterien Rendering variiert es schwierig, genau zu korrelieren Anzahl der intrazellulären Bakterien und Wirksamkeit der Vakuole Bruch. Aufgrund der Robustheit des Assays ist es für h geeignetoch Durchsatz nähert sich in 96 oder 384 Well Format. Wir haben auch erfolgreich dieses Protokoll für die FACS-Analyse, um die Infektion von Zellen in Suspension 16 studieren angepasst. Der Assay kann auch zur Untersuchung anderer Bakterien oder Träger präsentiert Lactamase auf ihrer Oberfläche, die zu einer Vielzahl von Anwendungen verwendet werden. Zum Beispiel kann dieser Ansatz verwendet werden, um vacuolar Bruch durch andere Erreger wie β-Lactamase exprimieren, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes und Salmonella typhimurium 12 induziert untersuchen. Da Listeria monocytogenes hat einen kurzen Zyklus Infektion vergleichbar mit Shigella flexneri sind Zeitraffer-Experimente möglich. Im Gegensatz dazu, weil Legionella pneumophila und Salmonella typhimurium Display lange Zyklen Infektion, empfehlen wir Ihnen Endpunkt Experimente durchzuführen. Die Vielfalt der möglichen Anwendungen macht das CCF4-AM/β-lactamase Assay eininteressant fluorometrische Verfahren zur Verfolgung vacuolar Bruch durch intrazelluläre Erreger in fixierten Proben oder in Echtzeit induziert.

Zahlreiche bakterielle Krankheitserreger sind in Membran-Kompartimente von eukaryotischen Zellen während ihrer Verlauf der Infektion verinnerlicht. Eintritt in die Zelle erfolgt entweder durch Phagozytose durch spezialisierte Wirtszellen, wie es der Fall für Mycobacterium tuberculosis, die von Makrophagen aufgenommen werden, oder die Erreger aktiv induzieren ihre Aufnahme in der Regel nicht Fresszellen. Bei der induzierten Aufnahme, beispielsweise zum Shigella flexneri, spritzt das Pathogen Effektorproteinen in den Wirt Cytosol, die unter anderem die Zellfunktionen streng reguliert endomembrane Sortiermaschinen was bakteriellen Lokalisierung innerhalb einer Endosomen 1,2 entführen. Anschließend stört Shigella das umschließende Membran führt zu vacuolar Bruch und cytosolischen Zugang des Erregers stören Wirtmembran Menschenhandel und die Vermeidung Lieferung an den Lysosomen. In jüngerer Zeit hat phagolysosomale Bruch auch als Infektion str gefundenategy von Mycobacterium tuberculosis, dass ein Erreger für eine lange Zeit, um ausschließlich innerhalb eines membrangebundenen Kompartiment 3,17 lokalisiert gedacht wurde. Um die Dynamik der subzellulären Membran Menschenhandel invasiver Krankheitserreger zu untersuchen, haben große Verbesserungen seit der Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) basiert Studien der späten 1980er Jahre 4,5 erreicht worden. Zum Beispiel, Fluoreszenzmikroskopie Methoden unter Verwendung von Farbstoffen, nahm Antikörper gegen bakterielle Oberfläche Komponenten oder Marker für die Co-Lokalisation mit subzellulären Kompartimenten über 6,7. Doch sie immer noch nicht erhalten genaue raumzeitliche Auflösung und Robustheit vacuolar Bruch durch bakterielle Erreger quantitativ zu messen. Diese Hürde wurde mit einem Test auf der Grundlage der Cephalosporin CCF4-AM FRET abgeleitet Reporter, die zum ersten Mal verwendet wurde, um die Genexpression studieren 8 angesprochen. Dann wurde sie in Zusammenhang mit der verwendeten infection Biologie zu untersuchen Effektor-Sekretion und um die Aufnahme von Neisseria in Wirtszellen 9,10,11 folgen. Wir entwickelten einen Test unter Ausnutzung dieser Reporter für das Studium vacuolar Bruch durch Shigella flexneri 12 und Mycobacterium tuberculosis 17 induziert. Das Prinzip unserer Methode ist in Abbildung 1 beschrieben mit Shigella flexneri. Zuerst werden Wirtszellen mit dem FRET CCF4-AM Substrat, das innerhalb des Zytoplasmas nach Abspaltung der Uhr Estereinheiten eingefangen geladen. Dann werden die Zellen mit Shigella flexneri infiziert. β-Lactamase, die auf der Oberfläche der Bakterien kann zur Spaltung des Substrats CCF4 sobald vacuolar Bruch auftritt. Dies führt zu einem Verlust des FRET-Signals Umschalten des Emissionsmaximum von 535 nm bis 450 nm bei Anregung von der Probe bei 405 nm. Die Quotientenmeßschaltung der 450/535 nm Intensitäten hebt vacuolar Integrität: niedrige Verhältnisse widerspiegeln Membran-engeschlossenen oder extrazellulären Bakterien während hohe Verhältnisse widerspiegeln Kontakt zwischen den Bakterien und dem Host Cytosol. Wir berichten auch über eine Anpassung dieser Methode zur Untersuchung phagosomalen Bruch von Mycobacterium tuberculosis in THP-1 Makrophagen induziert. Die experimentellen Prinzipien bleiben die gleichen, obwohl die Reihenfolge umgekehrt, CCF4-AM Belastung erst nach bakterielle Infektion angewendet wird. Somit kann durch quantitative ratiometrische Fluoreszenzmessungen an der Ebene einer einzelnen Zelle, kann die Vakuole Bruch Shigella flexneri in Echtzeit und in festen Proben aus verschiedenen Zelltypen 12,13,14 verfolgt werden. Darüber hinaus kann dieses Verfahren eine Reihe von anderen invasiven Krankheitserreger wie in dieser Studie mit Mycobacterium bovis und Mycobacterium tuberculosis gezeigt angepasst werden. Schließlich ermöglicht die Miniaturisierung der Protokoll mit 96 Vertiefungen (oder 384-Well-) Formate Screening von zahlreichen Bedingungen bei hohem Durchsatz.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K1089</td>
			<td>Protect from light, stock in - 80 &deg; aliquots</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Draq5</td>
			<td>Biostatus</td>
			<td>DR50050</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9155</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>&mu;CLEAR-PLATE, BLACK, 96 well </td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655090</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek corp.</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8761</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>&beta;-lactamase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0389</td>
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single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens

Shigella flexneri sind pathogene Bakterien, die Wirtszellen Eingehen einer endozytischen Vakuole eindringen. Anschließend kann der Bruch dieser Membran umschlossenen Kammer Bakterien im Cytosol zu bewegen, vermehren und weiter einzudringen Nachbarzellen. Mycobacterium tuberculosis durch Immunzellen phagozytiert, und vor kurzem zum Bruch phagosomalen Membran in Makrophagen gezeigt. Wir entwickelten einen robusten Assay zur Verfolgung phagosomalen Membranzerstörung nach Wirtszelle Eintrag von Shigella flexneri oder Mycobacterium tuberculosis. Der Ansatz nutzt CCF4 ein FRET Reporter empfindlich auf β-Lactamase, die in das Cytosol der Wirtszelle ausgleicht. Beim Eindringen von Wirtszellen, die durch bakterielle Pathogene, bleibt die Sonde intakt, solange die Bakterien in der Membran-Kompartimente befinden. Nach Unterbrechung der Vakuole, β-Lactamase-Aktivität auf der Oberfläche der intrazellulären Erregers spaltet CCF4 sofort führenING zu einem Verlust von FRET-Signals und der Umstellung seiner Emissionsspektrum. Diese robuste ratiometrischen Assay liefert genaue Informationen über den Zeitpunkt der Vakuole Bruch durch die eindringenden Bakterien induziert, und es kann zu automatisierten Mikroskopie und Bildverarbeitung durch spezialisierte Algorithmen für die Erkennung der Signale der Emission gekoppelt werden FRET-Donor und Akzeptor. Darüber hinaus ermöglicht es die Untersuchung der Dynamik der Vakuole Störungen, hervorgerufen durch intrazelluläre Bakterien in Echtzeit in einzelne Zellen. Schließlich ist es perfekt für das Hochdurchsatz-Analyse mit einer räumlich-zeitlichen Auflösung als bisherige Methoden geeignet. Hier bieten wir die experimentellen Details beispielhafter Protokolle für die CCF4 vacuolar Bruch Assay auf HeLa-Zellen und THP-1 Makrophagen für Zeitraffer-Experimente oder Endpunkte Experimente mit Shigella flexneri sowie mehrere Mykobakterienstämme wie Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, und Mycobacterium tuberculosis.

Die CCF4-AM/β-lactamase Ansatz ist eine robuste und sensitive Methode für die Verfolgung vacuolar Ruptur intrazelluläre Erreger wie Shigella flexneri (Abbildung 1). Die Shigella-Stämme, die in dieser Studie verwendet werden, sind M90T AFAI und BS176 AFAI bezeichnet. M90T AFAI ein Shigella flexneri Stamm, der das Adhäsin AfaE, die in der Lage, effizient binden CD55 auf der Oberfläche von Epithelzellen 15 drückt. Daher AfaE exprimierenden Stämmen zeigen viel höhere Invasion Fähigkeiten im Vergleich zum Wildtyp-Stamm M90T in Epithelzellen. BS176 AFAI ist ein Ausdruck AfaE mutierte Shigella flexneri Stamm frei von der Shigella Virulenzplasmid. Dieser Stamm ist nicht HeLa-Zellen einzudringen. Dennoch Dieser Stamm ist in der Lage, THP-1-Zellen geben, da die Aufnahme in dieser Zelllinie nur verlassen sich auf klassische Phagozytose und erfordert keine funktionellen Typ-3-Sekretionssystem. Beide Stämme exprimieren β-LactamaseUnd Anzeigen von β-Lactamase-Aktivität an ihrer Oberfläche durch das Vorhandensein des AfaE kodierenden Plasmid. Nach Infektion von HeLa-Zellen mit dem nicht-invasive BS176 AFAI Belastung für 1 h, das FRET CCF4 Sonde intakt, wie in 2A durch die grünes Signal (535 nm) gezeigt. Im Gegenteil führt die Infektion mit dem virulenten Stamm M90T AFAI für 1 Stunde mit einem Schalter des Signals in Richtung blau (450 nm) Hervorhebung der Spaltung der Sonde im Cytosol. Um dies zu quantifizieren, entwickelten wir ein Skript für das Metamorph und Acapella Software, die automatische Erkennung von Zellen und die Messung der Intensitäten in den 535 und 450 nm Kanäle für die Bestimmung der ratiometrische Signals ermöglicht. Wie in 2B gezeigt, sind Kerne und Cytosol von Zellen unter Verwendung des segmentierten DRAQ5 Kanal. Dann wird der Algorithmus in der Lage, die 450 nm und 535 nm die positiven Zellpopulationen zum Berechnen der Verhältnisse zwischen den zwei Intensitäten für jede einzelne Zelle, die erkennendargestellt als Histogramm in 2C. Low-Verhältnisse für den mutierten Stamm gegen hohe Verhältnisse für den virulenten Stamm erhalten. Während dieser repräsentativen Experiment Infektion erworben wurde mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie wird Epifluoreszenzmikroskopie auch für diese Aufgabe geeignet Abbildungen 3 und 4 zeigen Beispiele aus 2 verschiedenen menschlichen Zelltypen:. HeLa Epithelzellen und THP-1-Makrophagen-ähnlichen Zellen. Nach Infektion mit dem virulenten M90T AFAI Shigella-Stamm für 1 Stunde und 90 min für HeLa und THP-1-Zellen, einen Schalter für das von grünen (535 nm) bis blau (450 nm) im Vergleich zu BS176 AFAI infizierten Zellen (3A beobachtet und 4A). Das Skript wir MetaMorph entwickelte Software erkennt unmittelbar die CCF4 positive Zellpopulation und berechnet das Verhältnis zwischen den Intensitäten in 450 und 535 nm Kanäle für jeden einzelnen Zellen. Dann werden Zellen, in Abhängigkeit von deren Verhältnis mit einem Makro entwi eingestuftped in Excel, wodurch man Histogramme, die die Verteilung der Zellen. Wie es der Fall gewesen ist für den anderen Skript für Acapella entwickelt werden BS176 AFAI infizierten Zellen durch niedrige Verhältnisse gekennzeichnet, während M90T AFAI infizierte Zellen hohe Übersetzungen mit der MetaMorph Algorithmus auf HeLa-Zellen und THP-1 Makrophagen (3B und 4B) anzuzeigen . Schließlich wird eine Anpassung dieser Methode auf die Untersuchung von Mykobakterien in Abbildung 5 dargestellt. Mycobacterium bovis BCG liegt in der phagosome für den gesamten Verlauf des Experiments, wie durch die starke 535 nm Signal während des zeitlichen Verlaufs des Experiments detektierten reflektierten. Im Gegensatz dazu löst Mycobacterium tuberculosis phagosomalen Membranreißen in THP-1 Makrophagen nach mehr als 3 Tagen nach der Infektion, wie durch einen 450 nm-Signal an 7 Tagen nach Infektion (5A und 5B) hervorgehoben. Mit dem gleichen Algorithmus wie für das Studium vacuolar Bruch durch Shigella </em&gt;, fanden wir, dass Mycobacterium tuberculosis infizierte Zellen höher 450/535 nm-Verhältnis als Mycobacterium bovis BCG Anzeige nach 7 Tagen der Infektion (5C und 5D). <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schema repräsentiert das Prinzip der CCF4-AM/β-lactamase Assay für die Verfolgung von Shigella flexneri vacuolar Bruch. CCF4-Uhr frei diffundiert durch die Plasmamembran in das Zytoplasma, wo Estereinheiten durch cytosolische Esterasen Herstellung CCF4 Anionen gespalten werden. Diese Reaktion verhindert das Eindringen von CCF4 jede Membran eingebettet Fach. Bei diesem Schritt löst CCF4 FRET bei 535 nm nach Anregung bei 405 nm gemessen. Die Sonde bleibt bis β-Lactamase-exprimierenden Bakterien Zerplatzen intakte Die endozytischen Vakuole. Bei diesem Schritt wird das FRET-Signal verloren geht, weil CCF4 von β-Lactamase Auslösung eines Schalters in Emission von 535 nm bis 450 nm nach Anregung bei 405 nm gespalten wird. <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="2.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig2.jpg" /> Abbildung 2. Tracking-Shigella flexneri vacuolar Bruch mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. (A) Nach 2 Stunden 30 min von CCF4-AM Laden, HeLa-Zellen werden mit dem β-Lactamase-Expression Shigella flexneri BS176 AFAI mutierten Stamm oder M90T AFAI virulenten Stamm für 1 Stunde und festen infiziert mit 4% Paraformaldehyd für 10 min. Dann werden Kerne mit DRAQ5 angefärbt und die Zellen werden aufgenommen mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 10-fach Objektiv. Repräsentative Bilder wurden mit den folgenden fusionierten Kanäle gewählt: die intakte Sonde CCF4 erscheint bei 535 nm (grünn), wird die Sonde gespalten CCF4 bei 450 nm (blau). (B) Beispiele von Bildern Hervorhebung das Detektionssystem der automatisierten Algorithmus auf der Acapella Software. Die Segmentierung der Zellen (Kerne + Cytosol) wird nach der DRAQ5 Kanal. CCF4 positive Zellen werden unter Verwendung der 450 und 535 nm Kanäle gebündelt zusammen. (C) Histogramm der Ergebnisse unserer automatisierten Analyse auf Acapella mit Shigella flexneri BS176 AFAI mutierten Stamm oder M90T AFAI virulenten Stamm zeigt. Der Mittelwert stellt das Verhältnis zwischen der Intensität in der 450 und 535 nm Kanäle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50116/50116fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig3.jpg" /> Abbildung 3. Tracking-Shigella flexneri vacuolar Bruch in HeLa-Zellen mit Epifluoreszenzmikroskopie. (A) Nach 2 Stunden 30 min von CCF4-AM Laden werden HeLa-Zellen mit der β-Lactamase-Expression Shigella flexneri BS176 AFAI mutierten Stamm oder M90T AFAI virulenten Stamm für 1 Stunde und infiziert fixiert mit 4% Paraformaldehyd für 10 min. Dann werden die Zellen abgebildet mit einem Epifluoreszenzmikroskop mit einem 20x-Objektiv. Repräsentative Bilder wurden mit den folgenden Kanäle gewählt:. CCF4 intakte Sonde 535 nm (grün) und CCF4 geschnittenen Sonde 450 nm (blau) (B) Histogramm repräsentiert das Ergebnis unseres automatisierten Analyse auf MetaMorph Software. Die einzelnen Zellen werden in Abhängigkeit von ihrem Verhältnis der Intensitäten in den 450 und 535 nm Kanäle. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig4.jpg" /> &gt; Abbildung 4. Tracking-Shigella flexneri vacuolar Bruch in THP-1-Zellen mit Epifluoreszenzmikroskopie. (A) Nach 2 Stunden 30 min von CCF4-AM Laden, THP-1-Zellen mit dem β-Lactamase-Expression Shigella flexneri BS176 AFAI mutierten Stamm oder M90T AFAI infiziert virulenten Stamm für 1 h 30 min und fest mit 4% Paraformaldehyd für 10 min. Dann werden die Zellen abgebildet mit einem Epifluoreszenzmikroskop mit einem 20x-Objektiv. Repräsentative Bilder wurden mit den folgenden Kanäle gewählt:. CCF4 intakte Sonde 535 nm (grün) und CCF4 geschnittenen Sonde 450 nm (blau) (B) Histogramm repräsentiert das Ergebnis unseres automatisierten Analyse mit dem MetaMorph Software. Die einzelnen Zellen werden in Abhängigkeit von ihrem Verhältnis der Intensitäten in den 450 und 535 nm Kanäle. ghres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50116/50116fig5.jpg &quot;/&gt; Abbildung 5. Tracking Mycobacterium bovis BCG und Mycobacterium tuberculosis phagosomalen Bruch in THP-1 Makrophagen mit Epifluoreszenzmikroskopie. (A, B) THP-1-Zellen mit β-Lactamase-exprimierenden Mycobacterium bovis BCG oder Mycobacterium tuberculosis 2 h infiziert und kultiviert für 3 bis 7 Tage . Nach dem Waschen werden die Zellen mit geladen CCF-4-AM für 2 Stunden oder Fest mit 4% Paraformaldehyd für 30 min vor der Belichtung mit Hilfe eines Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem 40x. . Gespalten CCF4, Sonde 450 nm (blau) (C, D) Histogramme präsentiert das Ergebnis unserer automatisierten Analyse mit MetaMorph Software intakt CCF4 Sonde, 535 nm (grün): Repräsentative Bilder wurden mit den folgenden Kanäle gewählt. Einzelne Zellen als Funktion des Verhältnisses zwischen der Intensität in der 450 und 535 nm Kanäle.

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Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Wir beschreiben ein Verfahren zum Verfolgen der endomembrane Bruch hervorgerufen durch die intrazelluläre Bakterien<em&gt; Shigella flexneri<em&gt;</em</em&gt; Und<em<em&gt;<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt;</em</em&gt; Auf Wirtszelle Invasion. Unsere Assay nutzt CCF4 FRET ein Host zytoplasmatischen Sonde in lebenden oder fixierten Zellen. Dieser Reporter abgebaut wird durch ein Enzym-Aktivität, die auf der bakteriellen Oberfläche.

Single Cell Messungen Vacuolar Rupture durch intrazelluläre Erreger verursacht

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K Aufrufe.  Institut Pasteur, Paris, France. Wir beschreiben ein Verfahren zum Verfolgen der endomembrane Bruch hervorgerufen durch die intrazelluläre Bakterien Shigella flexneri

Serie: Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an effective invasin for human epithelial and endothelial cells. We have identified endothelial surface-located integrins as major receptors for Opc, a process which requires Opc to first bind to integrin ligands such as vitronectin and via these to the cell-expressed receptors1. This process leads to bacterial invasion of endothelial cells2. More recently, we observed an interaction of Opc with a 100kDa protein found in whole cell lysates of human cells3. We initially observed this interaction when host cell proteins separated by electrophoresis and blotted on to nitrocellulose were overlaid with Opc-expressing Nm. The interaction was direct and did not involve intermediate molecules. By mass spectrometry, we established the identity of the protein as &alpha;-actinin. As no surface expressed &alpha;-actinin was found on any of the eight cell lines examined, and as Opc interactions with endothelial cells in the presence of serum lead to bacterial entry into the target cells, we examined the possibility of the two proteins interacting intracellularly. For this, cultured human brain microvascular endothelial cells (HBMECs) were infected with Opc-expressing Nm for extended periods and the locations of internalised bacteria and &alpha;-actinin were examined by confocal microscopy. We observed time-dependent increase in colocalisation of Nm with the cytoskeletal protein, which was considerable after an eight hour period of bacterial internalisation. In addition, the use of quantitative imaging software enabled us to obtain a relative measure of the colocalisation of Nm with &alpha;-actinin and other cytoskeletal proteins. Here we present a protocol for visualisation and quantification of the colocalisation of the bacterium with intracellular proteins after bacterial entry into human endothelial cells, although the procedure is also applicable to human epithelial cells.

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &amp;#945;-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (Nm), a gram negative human-specific respiratory pathogen, can bind to human &alpha;-actinin. Here we present a protocol for visualisation of colocalisation of the bacterium with intracellular &alpha;-actinin after bacterial entry into human brain microvascular endothelial cells (HBMECs).

Visualisierung und Quantifizierung der intrazellulären Wechselwirkungen von Neisseria meningitidis And Human α-Actinin durch konfokale Imaging

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

Die Infektion von Zebrafisch-Embryos mit Intrazelluläre bakterielle Krankheitserreger

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

Entdeckung neuer intrazelluläre Erreger von Amöben Amöben Cokultur und Enrichment Ansätze

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

Die Anwendung der Fluoreszenz-Nanopartikel zur Umgestaltung des Endo-lysosomalen System-Studie durch intrazelluläre Bakterien

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

Biolistischen Transformation einer Leuchtstoff Tagged-Gens in den Opportunistic Pilzpathogenentwicklung<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Die Quantifizierung der Cytosolic vs. Vacuolar<em&gt; Salmonellen</em&gt; In Primäre Makrophagen durch Differential Permeabilisierung

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Identifizierung von Rare bakteriellen Erregern von 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

Hochdurchsatz-Nachweis von Respiratory Pathogens in Tier Proben durch nanoskalige PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Visualisierung von intrazellulären SNARE Menschenhandel durch Fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...