Wir bedanken uns bei Martine Emond und Isabel Brachmann für ihre Hilfe bei der Festlegung der organotypischen Kultur und Wolfgang Hübner und Liviu Gabriel Bodea für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Wir möchten Frank Costantini für die R26-Reporter Mäusen und Cliff Tabin für die Shh Creer Mäuse danken. Diese Studie wurde durch einen Forschungspreis aus dem Ministerium für Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen (Programm zur förderung der Rückkehr des Wissenschaftlichen Spitzennachwuchses Aus dem Ausland) gefördert.

Teile dieses Protokolls werden von Daza et al modifiziert., 2007 7. 1. Die Vorbereitungen <ol><li> Kann vorbereitet 1 Tag im Voraus <ol><li> Bereiten 1X Krebs-Puffer (1,5 L): 126 mm NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4: H 2 O, 1,2 mM MgCl 2, 2,5 mM CaCl 2, 11 mM Glukose, 25 mM NaHCO 3, pH-Wert auf 7,4. Filter sterilisieren (0,22 um Porengröße) und lagern bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie das Kulturmedium (20 ml): 5 ml HBSS, 9 ml DMEM high glucose, 850 ul von 30% Glucose, 5 ml Pferdeserum (25%). Geben Sie 200 ul 100X Penicllin / Streptomycin. Lagerung bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Bereiten Sie vor Beginn der Dissektion <ol><li> Es werden 100 ml 4% niedrig schmelzender Agarose (LMP Agarose) in 1X Krebs-Puffer: Mikrowelle die Lösung, bis die Agarose vollständig gelöst ist und dann die Agarose in einem 45 ° C Wasserbad. </li><li> Füllen Sie die Schwingungentome Pufferwanne mit eiskaltem 1X Krebs-Puffer und starten Sie das Kühlelement (halten bei 4 ° C). Fix einer Rasierklinge in den Messerträger und Set-up der Vibratom mit einem Skalpell, einem feinen Pinsel und eine Mini-perforierten Löffel zu holen die Scheiben. Bereiten Sie sterile Petrischalen (35 x 10 mm) mit 1x Krebs-Puffer zum Auffangen der Scheiben. Keep on ice. </li><li> Set-up der Dissektion mit sterilen Petrischalen (100 x 15 mm) für die Präparation und kleinere sterile Petrischalen (35 x 10 mm) für die Einbettung, eine kleine Schere, zwei feinen Pinzetten (Dumont 5), ein Mini-perforierten Löffel, ein Glas Pasteurpipette Feuer mit einem runden polierten geschlossene Spitze und 1 L 1X Krebs-Puffer auf Eis. Wischen Sie alle Dissektion Werkzeuge mit 70% Ethanol. </li><li> Add Kulturmedium in die Vertiefungen eines Sechs-Well-Platte (1,5 ml / well) und legen Sie sie in einem 37 ° C Inkubator. </li><li> Bereiten Sie einen Sechs-Well-Platte mit 1,5 ml / well sterile 1X Krebs-Puffer und 15 ul Penicilin / Streptomycin (100X) / well. Unter sterilen Bedingungen statt Millicell Cell Culture Inserts in die Vertiefungen. Setzen Sie den Sechs-Well-Platte neben dem Vibratom so dass das Gehirn Scheiben auf den Filter-Membranen können sofort nach Schneiden übertragen werden. </li></ol></li></ol> 2. Dissection und Einbettung von embryonalen Gehirnen <ol><li> Anesthetize eine schwangere Frau Maus mit Isofluran und Opfer der Maus durch Genickbruch (Embryonen im Stadium E12.5 werden). Dissect aus der Gebärmutter der Maus durch Hochziehen der Gebärmutter mit einer Pinzette. Verwenden Sie andere Zange die Mesometrium weg getrennt von der Gebärmutter. Legen Sie die Gebärmutter in eiskaltem 1X Krebs-Puffer. Verwenden einer feinen Pinzette, um die muskuläre Wand der Gebärmutter, Reichert-Membran und die viszerale Dottersack aus dem Embryo zu trennen. Entfernen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter. Setzen Sie den sezierten Embryonen in einem separaten Petrischale mit sterilem 1X Krebs-Puffer. </li><li> Dissect das Gehirn unter einem Stereomikroskop. Um das Gehirn zu sezieren, zuerst den Kopf abzuschneiden des Embryos. Befestigen Sie den Kopfdurch Einstechen feiner Pinzette durch den Kopf (Augenhöhe). Verwenden Sie eine andere Zange zu entfernen Sie vorsichtig die Haut und Schädel. Verwenden einer Pinzette vorsichtig heben das Gehirn aus und übertragen sie in eine Petrischale mit einem sterilen 1X Krebs-Puffer. Es ist sehr wichtig, dass die Integrität des gesamten Gehirns bei der Präparation wird beibehalten, da Schäden an Hirngewebe wird Probleme (z. B. Gewebe Schreddern) während des Schneidens auf der Vibratom erstellen. </li><li> Waschen Sie den Kopf einmal in 4% niedriger Schmelzpunkt (LMP) Agarose. Embed 2-3 Gehirne in einer Zeit, in frischer 4% LMP-Agarose. Legen Sie die Einbettung Gerichte auf Eis so gleichmäßig wie möglich. Verwenden Sie eine Pasteurpipette mit einem feuerpolierte runde Spitze auf das Gehirn anheben, bis der Boden der Agarose verfestigt. Die Gehirne sollten in einer flachen Position horizontal auf dem Boden des Agaroseblock begleichen. </li><li> Nach der Agarose vollständig verfestigt hat (nach ca. 3 min), schneiden Sie die Agarose rund um das Gehirn und kleben Sie die Agarose Block auf den Objekttischder Vibratom. Beim Kleben der Blöcke, stellen Sie sicher, dass die Bauchseite des Gehirns parallel zu der Plattform ist, da das Gehirn in einer horizontalen Schnittebene geschnitten werden sollte. </li></ol> 3. Vibratom sectioning <ol><li> Verwenden Sie eine Rasierklinge zum Schneiden. Um intakte Scheiben ist es sehr wichtig, um die Temperatur um 4 ° C zu halten während des Schneidens. </li><li> § 300 um dicke horizontale Scheiben mit einer Frequenz von 50 Hz, Klinge Amplitude von 1,1 mm und einer Geschwindigkeit von 25 mm / sec. </li><li> Verwenden Sie den feinen Pinsel, um die Scheibe in eine Mini-perforierten Löffel schieben den Hirnschnitten sammeln und übertragen Sie sie in eine Schale mit sterilem eiskaltem 1X Krebs-Puffer. Wählen Sie das Slice, das ventrale Mittelhirn Gewebe enthält (siehe Abbildung 1). In einem E12.5 Maushirn gibt es nur eine 300 um horizontale Scheibe, die ventralen Mittelhirn Gewebe enthält, einschließlich dopaminergen Neuronen. </li></ol> 4. Slice-Kultur Steps 4,2-4,5 sind unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. <ol><li> Übertragen Sie die Hirnschnitten auf eine Millicell Zellkultur Membran Insert in einem Sechs-Well-Platte mit 1x Krebs-Puffer (siehe Punkt 1.2.5). Zur Übertragung der Scheibe mit dem Mini-Schaumlöffel (Fine Science Tools) und einem feinen Pinsel. Bis zu 3 Scheiben können auf einer Membran platziert werden. </li><li> Übertragen Sie die Membran mit der Scheibe zu den Sechs-Well-Platte mit Kulturmedium (siehe Punkt 1.2.5). Der obere Teil der Membran sollte nicht durch Mittel bedeckt sein. Das Gehirn erhält Scheibe Medium von unten und in der Luft von oben. </li><li> Setzen Sie den Sechs-Well-Platte in einem Inkubator mit 5% CO 2 bei 37 ° C. Es ist sehr wichtig, dass die Scheiben in den Inkubator sind innerhalb von 2 Stunden nach dem ersten Schritt der Präparation gelegt. Eine längere Vorbereitungszeit kann in schlechten Überlebensraten der Scheiben führen. </li><li> Slices können in vitro bis zu 3 Tage aufrechterhalten werden. Ändern Sie 50% des Kulturmediums am 2. Tag. </li></ol><ol><li> Lassen Sie die Scheiben in den Inkubator wieder für 4-5 Stunden vor Beginn der Zeitraffer-Bildgebung. </li><li> Für Zeitraffer-Imaging, halten Sie die Scheiben auf die Membran eingefügt und übertragen Sie die Einlage in ein 35 mm ibidi μ-Dish (der Boden der Schale besteht aus Material mit hoher optischer Qualität). </li><li> 1 ml Kulturmedium plus 1,5 ul Ascorbinsäure (200 mM) in die Schale. Ascorbinsäure schützt die Scheiben gegen Phototoxizität. </li><li> Inkubieren Scheiben in einer Klimakammer bei 37 ° C mit 5% CO2 bei Zeitraffer-Bildgebung. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1 illustriert die Herstellung von organotypischen Kulturen von E12.5 Maus Gehirn. Abbildung 2 zeigt die horizontale organotypischen Slices (akuten und nach einigen Tagen in Kultur) erhalten Form E12.5 Gehirn der Maus. Zum Vergleich, gefroren Hirnschnitten bei den entsprechenden Entwicklungsstufengezeigt werden. Mittelhirn dopaminergen Neuronen visualisiert mit Immunhistochemie für Tyrosin-Hydroxylase (TH). Mittelhirn dopaminergen Neuronen Projekt, um Ziele im Vorderhirn. Diese Projektionen beginnen am E12.5 Form und erstrecken sich in Richtung Vorderhirn während der folgenden Tage. Wir betrachten die Entwicklung des Vorderhirns Projektionen als ein guter Indikator für die normale Entwicklung von dopaminergen Neuronen in Kultur. In der horizontalen Scheiben Mittelhirn dopaminergen Neuronen zu erweitern Projektionen auf ihre ordnungsgemäße Vorderhirn Zielgebiet. Nach 3 DIV (days in vitro) oder wenn das Vorderhirn Zielgebiete sind beschädigt, aberrante Projektionen in Richtung der dorsalen Mittelhirn zu verlängern. Beispiele für koronare Scheiben E12.5 Mittelhirn sind in Abbildung 3 dargestellt. Dopaminergen Neuronen visualisiert mit Immunfärbung für TH verlängern aberrante Projektionen zum dorsalen Mittelhirn. Abbildung 4 zeigt eine Analyse der proliferierenden, nekrotischen und apoptotischen Zellen in der organotypischen Kulturen. BrdU immunostaining zu proliferierenden Zellen visualisieren zeigt, dass Zellen unter Kulturbedingungen vermehren nach 1 DIV. Proliferation ist nach 4 DIV reduziert. Nach 3 DIV, durchlaufen viele Zellen im ventralen Mittelhirn Nekrose (Propidiumiodid-Färbung) und apotosis (Immunfärbung für gespaltene Caspase-3). Abbildung 5 zeigt Zugwege YFP-markierten Neuronen in einem Zeitraffer-Imaging-Experiments in einer akuten Scheibe überwacht . <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Herstellung von organotypischen Kulturen. 300 um horizontale Hirnschnitten werden durch Schneiden ein E12.5 Gehirn mit einem Vibratom vorbereitet. (A) Schematische sagittale Ansicht eines E12.5 Gehirn der Maus. Levels von Abschnitten angegeben sind. Das Gebiet mit dopaminergen Neuronen in rosa dargestellt ist, sind Projektionen in blau angegeben. (B) Schematische Darstellung der drei Scheiben, die von dorsal nach ventral erhalten werden können und that enthalten sowohl Vorderhirn (Fb) und Mittelhirn (Mb). Beachten Sie, dass nur eine Scheibe dopaminergen Neuronen (slice b) enthält. Die entsprechenden Scheibe kann auf der Grundlage der Position der Kammern und die Kontinuität des Mittelhirns und Vorderhirns Gewebe (Pfeile, vgl. Abschnitt b § a und c) identifiziert werden. Das Gebiet mit dopaminergen Neuronen in rosa angezeigt wird, ist der Bereich mit dopaminergen Vorstufen in grüne, blaue Pfeile dargestellt zeigen die Entwicklung Projektionen. (C) Die Scheibe enthält dopaminergen Neuronen auf Membran-Einsätze kultiviert. Abkürzungen: VMB, ventralen Mittelhirn, DMB, dorsalen Mittelhirn; Hyp, Hypothalamus, Hb, Hinterhirn. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig2.jpg" /> Abbildung 2. Projektionen des Mittelhirns dopaminergen Neuronen in organotypischen Kulturen sind abhängig von der Integrität des Vorderhirns. Immunhistochemie für Tyrosin-Hydroxylase (TH) zu dopaminergen Neuronen Etikett. (A) Akute slice (0 DIV)zeigt die normale Lage der dopaminergen Neuronen im ventralen Mittelhirn. Der weiße Pfeil zeigt das Gebiet, das in höherer Vergrößerung im Einschub gezeigt wird. Projektionen auf das Vorderhirn noch nicht entwickelt. Nach 1 DIV, starten Projektionen zum Vorderhirn zu bilden. Projektionen erstrecken sich in das Vorderhirn bei 2-3 DIV. Weiße Pfeile zeigen die Position der Zellkörper in höherer Vergrößerung in den Einschüben (weißer Rahmen) angezeigt. Gelbe Pfeile markieren den normalen Projektionen in intakten Scheiben in höherer Vergrößerung in den Einschüben (gelber Rahmen) dargestellt. Aberrant Projektionen entwickeln in Scheiben mit beschädigtem Vorderhirn. Rote Pfeile zeigen die aberrante Projektionen zum dorsalen Mittelhirn in höherer Vergrößerung in den Einschüben (roter Rahmen) dargestellt. Der Schaden wird mit roten Sternchen gekennzeichnet. Nach 3 DIV, die meisten Scheiben (n = 7.5) hatte aberrante Projektionen in Richtung der dorsalen Mittelhirn. (B) TH Immunfärbung auf horizontalen eingefroren Hirnschnitten in verschiedenen Entwicklungsstadien zeigen die Entwicklungdopaminerger Projektionen in vivo. Weiße Pfeile zeigen die Position der Zellkörper in höherer Vergrößerung in den Einschüben (weißer Rahmen) angezeigt. Gelbe Pfeile markieren die Position der Projektionen in hoher Vergrößerung in den Einschüben (gelber Rahmen) dargestellt. Die Höhe der Gefrierschnitte wurde gewählt, um genau das Niveau der organotypischen Kulturen. Beachten Sie, dass eine einzige Gefrierschnitten (12 um) repräsentiert nicht die gesamte organotypischen (300 um). Deshalb waren die Prognosen bei E13.5 und E14.5 gezeigt auf § § 120 um mehr ventral als der Abschnitt mit dem Zellkörper (gelb Sternchen) beobachtet. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig3.jpg" /> Abbildung 3. Mittelhirn koronalen Schnitt Kulturen für Tyrosin-Hydroxylase (TH) als Marker für dopaminerge Neuronen gefärbt. (AC) Scheiben nach 1, 2 oder 3 DIV. Dopaminergen Neuronen entwickeln aberrante Projektionen in Richtung der dorsalen Mittelhirn (red Pfeile). Pfeilspitzen zeigen die Lage der dopaminergen Zellkörper. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig4.jpg" /> Abbildung 4. Zellproliferation und Zellvitalität in Mittelhirn organotypischen Kulturen. (A) Proliferierende Zellen wurden durch die Zugabe von BrdU (50 ng / mL, Sigma) in das Kulturmedium für 18 h beschriftet Scheiben wurden anschließend für BrdU immungefärbt. Nach 1 DIV sind BrdU-markierte Zellen in der ventrikulären Zonen (rote Pfeile) entfernt. Nach 4 DIV, sind proliferierenden Zellen mehr zerstreut und eine ausgeprägte ventrikuläre Zone wird nicht mehr gepflegt. (B) nekrotische Zellen wurden durch Zugabe von Propidiumiodid (1μg/μL, Sigma) in das Kulturmedium für 2 Stunden markiert und mit Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Nach 1 DIV ist der ventralen Mittelhirn (VMB) nicht nekrotisch, aber viele Propidiumjodid markierten Zellen können in der dorsalen Mittelhirn und Vorderhirn zu sehen. Nach 3 DIV die Lebensfähigkeit der Zellen verringert sich in der ventralen midbrain. Maßstabsbalken: 500 pm (C) Immunostaing für gespaltene Caspase-3 um apoptotische Zellen sichtbar zu machen. Auf 1 oder 2 DIV, sind nur wenige dopaminergen Neuronen (TH) apoptotisch. Nach 3 DIV, starten dopaminergen Neuronen zur Apoptose. Panels in der Mitte und auf der rechten Seite sind höhere Vergrößerungen der eingerahmten Bereich in der linken Panels. Die höheren Vergrößerungen Bilder sind Maximum Intensity Projections der z-Stacks von 14-16 Frames. Die Bilder wurden alle 0,5 mu m mit einem Zeiss Apotome Set-up übernommen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig5.jpg" /> Abbildung 5. Zugweg von YFP-markierten Neuronen in einer akuten Scheibe. (A) Horizontal-Slice für Zeitraffer-Aufnahme von YFP-markierten Neuronen verwendet. Die Scheibe wurde für 5 Stunden vor der Bildgebung inkubiert. Die Zellen wurden beschriftet mit einem induzierbaren Cre / loxP-System 6. Shh Creer Mäusen 8 und ROSA loxP-STOP-loxP-EYFP Reporter Mäusen 9 haben wirre eingesetzt. Die Rekombination der ROSA-Reporter-Allels (und EYFP Ausdruck) ist in Zellen induziert, die ausdrückliche Creer (Shh-exprimierenden Zellen), aber nur bei Verabreichung von Tamoxifen (Sigma). In diesem Beispiel wurde Tamoxifen (3 mg/40 g Körpergewicht) an trächtige Mäuse an E8.5 verwaltet. Dieser experimentelle Aufbau resultiert in erster Linie in der Etikettierung von Vorstufen von dopaminergen Neuronen und ihre Nachkommen in der ventralen Mittelhirn 10,11. Maßstab: 500 um. (B) Auf den Spuren der Zugweg von YFP-markierten Neuronen in einer akuten Scheibe. Zeitraffer-Bilder von YFP-markierten Schicksal abgebildet Neuronen wurden alle 30 min für eine Gesamtzeit von 5 Stunden und 30 min auf einem Zeiss Axio Observer-Mikroskop (Objektiv EC PlnN 10x / 0,3) erworben. Scheiben wurden in einer Klimakammer (Inkubator XLS1 Pecon) bei 37 ° C bebrütet und geliefert mit 5% CO 2 während der Bildgebung. Die Ausgangslage der Zellen ist mit roten Pfeilen markiert, Migration Positionen sind mit roten Sternchen gekennzeichnet.

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	<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases.">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat. Neurosci. 7 (2), 136-136 (2004).</li><li>Martini, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+selection+of+leading+process+branches+mediates+chemotaxis+during+tangential+neuronal+migration.">Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration.</a> Development. 136 (1), 41-41 (2009).</li><li>Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+neuronal+cell+migrations.">Guiding neuronal cell migrations.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (2), a001834-a001834 (2010).</li><li>Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trekking+across+the+brain:+the+journey+of+neuronal+migration.">Trekking across the brain: the journey of neuronal migration.</a> Cell. 128 (1), 29-29 (2007).</li><li>Smidt, M. P., Burbach, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+mesodiencephalic+dopaminergic+neuron.">How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 21-21 (2007).</li><li>Legue, E., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+fate+mapping+using+site-specific+recombinases.">Genetic fate mapping using site-specific recombinases.</a> Methods. Enzymol. 477, 153-153 (2010).</li><li>Daza, R. A., Englund, C., Hevner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+of+embryonic+brain+tissue.">Organotypic slice culture of embryonic brain tissue.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Harfe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+expansion-based+temporal+Shh+gradient+in+specifying+vertebrate+digit+identities.">Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities.</a> Cell. 118 (4), 517-517 (2004).</li><li>Srinivas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Dev. Biol. 1, 4-4 (2001).</li><li>Joksimovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+separable+Shh+domains+in+the+midbrain+define+distinct+dopaminergic+progenitor+pools.">Spatiotemporally separable Shh domains in the midbrain define distinct dopaminergic progenitor pools.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (45), 19185-19185 (2009).</li><li>Blaess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-spatial+changes+in+Sonic+Hedgehog+expression+and+signaling+reveal+different+potentials+of+ventral+mesencephalic+progenitors+to+populate+distinct+ventral+midbrain+nuclei.">Temporal-spatial changes in Sonic Hedgehog expression and signaling reveal different potentials of ventral mesencephalic progenitors to populate distinct ventral midbrain nuclei.</a> Neural. Dev. 6 (1), 29-29 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biol. 3 (5), e159-e159 (2005).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die organotypischen Kultur hier vorgestellte Methode stellt ein System für die kurzfristige In-vitro-Analyse der Entwicklung von dopaminergen Neuronen und ihre Migrations-und Projektions-Strecken in der embryonalen ventralen Mittelhirn. Wir fanden, dass es eine Reihe von kritischen Schritte in das Protokoll, das sorgfältig gepflegt werden sollte, um Scheiben, die die normale Entwicklung des ventralen Mittelhirn dopaminergen Neuronen ermöglichen zu erhalten. Der wichtigste Schritt ist die Zerlegung des embryo...

Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte <table border="1"><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D6429 </td><td></td></tr><tr><td> Glucose 30% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528-250 </td><td></td></tr><tr><td> Pferdeserum </td><td> Invitrogen </td><td> 26050-088 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM (4,5 g / L Glc., Mit L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D6429-500 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin 100x </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4333-20 </td><td></td></tr><tr><td> L-Ascorbinsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4403 </td><td> Vorbereitung 200mM Lager und bei -20 ° C </td></tr><tr><td> UltraPure LMP-Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15517-022 </td><td></td></tr><tr><td> Millicel Einsätze </td><td> Millipore </td><td> PICMORG50 </td><td></td></tr><tr><td> μ-Dish 35 mm, niedrige </td><td> Ibidi </td><td> 80136 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratom </td><td> Microm </td><td> HM 650V </td><td></td></tr><tr><td> Rasierklinge </td><td> Plano GmbH </td><td> 121-6 </td><td></td></tr><tr><td> Histoacryl Kleber </td><td> BRAU9381104 </td><td> Braun Aesculap </td><td></td></tr><tr><td> Perforierte Löffel Dia Durchmesser 15 mm </td><td> Feine Science Tools </td><td> 10370 -18 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzetten 5 Dumoxel </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11252 bis 30 </td><td></td></tr></table> Antikörper für Immunofärbungen verwendet: <table border="1"><tr><td&gt; Name des Antikörpers </td><td> Firma </td><td > Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Rabbit anti-Tyrosin-Hydroxylase </td><td> Millipore </td><td> AB152 </td><td> Verdünnung 1:500 </td></tr><tr><td> Maus anti-Tyrosin-Hydroxylase </td><td> Millipore </td><td> MAB318 </td><td> Verdünnung 1:500 </td></tr><tr><td> Maus anti-BrdU </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555627 </td><td> Verdünnung 1:200 </td></tr><tr><td> Kaninchen-anti-Caspase-3 gespalten </td><td> Cell Signaling Technology </td><td> 9661 </td><td> Verdünnung 1:200 </td></tr><tr><td> Donkey anti-Kaninchen-IgG-Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A21206 </td><td> Verdünnung 1:500 </td></tr><tr><td> Donkey anti-Maus-IgG-Cy3 </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 715-165-150 </td><td> Verdünnung 1:200 </td></tr></table>

organotypic slice cultures of embryonic ventral midbrain: a system to study dopaminergic neuronal development in vitro

Die Maus ist ein ausgezeichnetes Modell Organismus von Säugetieren die Entwicklung des Gehirns aufgrund der Fülle von molekularen und genetischen Daten zu studieren. Allerdings ist die Entwicklung von Gehirn der Maus nicht für einfache Handhabung und Bildgebung in vivo geeignet, da die Maus-Embryo ist unzugänglich und undurchsichtig. Organotypischen Kulturen von embryonalen Gehirne sind daher häufig verwendet, um murine die Entwicklung des Gehirns in-vitro-Studie. Ex-vivo Manipulation oder die Verwendung von transgenen Mäusen ermöglicht die Änderung der Genexpression, so dass Subpopulationen von Neuronen oder Gliazellen mit fluoreszierenden Proteinen markiert werden können. Das Verhalten der markierten Zellen können dann beobachtet, wenn Zeitraffer-Bildgebung werden. Zeitraffer-Bildgebung hat sich besonders zur Untersuchung von Zell Verhaltensweisen, die die Entwicklung der Hirnrinde am späten embryonalen Stadien 1-2 zugrunde liegen. Embryonale organotypischen Kultur-Systemen im Gehirn Regionen außerhalb des Vorderhirns sind weniger gut established. Daher ist der Reichtum der Zeitraffer-Imaging-Daten zur Beschreibung neuronaler Zellmigration auf das Vorderhirn 3,4 beschränkt. Es ist noch nicht bekannt, ob die Grundsätze für die dorsale Gehirn entdeckt wahr halten ventralen Hirnbereiche. In der ventralen Gehirn sind Nervenzellen in neuronalen Clustern statt Schichten organisiert und sie haben oft zu kompliziert wandernde Bahnen zu unterziehen, um ihre endgültige Position zu erreichen. Die ventralen Mittelhirn ist nicht nur ein gutes Modell für ventrale Entwicklung des Gehirns, sondern enthält auch neuronale Populationen wie dopaminergen Neuronen, die relevant sind in Krankheitsprozesse. Während die Funktion und die Degeneration von dopaminergen Neuronen ist sehr detailliert in das erwachsene und alternde Gehirn untersucht worden, ist nur wenig über das Verhalten dieser Neuronen während ihrer Differenzierung und Migration Phase 5 bekannt. Wir beschreiben hier die Generation der Scheibe Kulturen aus dem embryonalen Tag (E) 12,5 Maus ventralen Mittelhirn. Diese Scheibe Kultnahmen sind potentiell geeignet für die Überwachung der dopaminergen Neuronen Entwicklung über mehrere Tage in vitro. Wir beleuchten die wichtigsten Schritte bei der Erzeugung von Hirnschnitten in diesen frühen Stadien der embryonalen Entwicklung und besprechen die notwendigen Voraussetzungen für die Aufrechterhaltung der normalen Entwicklung von dopaminergen Neuronen in vitro. Wir präsentieren auch Ergebnisse aus Zeitreihen Imaging Experimente. In diesen Experimenten wurden ventralen Mittelhirn Vorstufen (einschließlich dopaminerge Vorstufen) und ihre Nachkommen in einem Mosaik Weise unter Verwendung eines Cre / loxP Basis induzierbaren Schicksal Mapping-System 6 gekennzeichnet.

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Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Eine Methode zur organotypischen Slices aus dem E12.5 murinen embryonalen Mittelhirns zu erzeugen, ist beschrieben. Die organotypischen Kulturen verwendet, um das Verhalten von dopaminergen Neuronen oder anderen ventralen Mittelhirn Nervenzellen zu beobachten.

Organotypischen Kulturen von embryonalen ventralen Mittelhirn: Ein System zur Dopaminerge Neuronale Development Study In-vitro-</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

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Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

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Serie: Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Die Organotypische hippokampalen Slice-Kultur-Modell für die Prüfung neuronaler Schädigung

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

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Neurowissenschaften

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multi-Elektroden-Array Recordings neuronaler Lawinen in organotypischen Kulturen

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

Die Analyse von Purkinje Zelle Dendritische Morphologie in organotypischen Kulturen

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

In ovo Elektroporation in Mittelhirn-Küken für Studien über Genfunktion in dopaminergen Neuronen Entwicklung

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

In ovo Expression von microRNA in ventralen Mittelhirn-Küken

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Schnittstellen 3D Engineered neuronalen Kulturen auf Mikroelektrodenarrays: ein innovatives<em&gt; In-vitro-</em&gt; Experimental Modell

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

Zuverlässige Identifikation von Wohn dopaminerge Neurone in Mittelhirns Kulturen unter Verwendung von RNA-Sequenzierung und TH-Promotor getriebene eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...