Diese Arbeit wurde von der US National Institutes of Health NIH Zuschusses / NICHD # HD051998 (zum CAM) unterstützt.

1. Collagen Bead Vorbereitung <ol><li> Vor dem Laden EVTs für 3-D Zellkultur, muss man die Cytodex-3 Mikroträger Perlen vorzubereiten: <ol><li> Wiegen Sie die entsprechende Menge an Cytodex-3 Perlen für das Experiment erforderlich. Dieses Protokoll wird für die 10ml RCCS Schiffes angepasst, in dem 0,05 g Perlen benötigt werden. Für eine 50ml RCCS Schiff, entsprechend skalieren. In einem 50 mL autoklavierbar konischen Rohr, Mix 250 mg Cytodex-3 Perlen mit 12ml Dulbecco phosphatgepufferte Lösung (DPBS). Diese Menge reicht für 5 RCCS Schiffe. </li></ol></li><li> Für ausreichende Menge vorhanden ist, in dem konischen Rohr, das Autoklav-Verfahren in Verdunstung führt. Lose Kappe der Röhre und Autoklaven für 10 min bei 110 ° C. </li><li> Nehmen Sie die konische Rohr an der Fertigstellung des Autoklaven-Zyklus und damit die Cytodex-3 Bead-Lösung, um abzukühlen. </li><li> Nach dem konischen Rohr auf Raumtemperatur abgekühlt wurde, verwenden Sie sterile Technik, um das Gesamtvolumen auf 12,5 ml zu bringen mit 1X DPBS. </li><li> Cap und speichern Sie die vorbereiteten Cytodex-3 Kügelchen bei Raumtemperatur. Lassen Sie die vorbereiteten Perlen zu quellen und auf Raumtemperatur abkühlen vor zu bedienen. Die oben genannten Vorbereitung Cytodex-3 Perlen wird für fünf 10ml RCCS Schiffe bieten. Wir haben beobachtet, dass längere Lagerung von Cytodex-3 Kügelchen bei Raumtemperatur wird in verminderter Leistung führen, da das Kollagen nach etwa einem Monat zu destabilisieren wird. Cytodex-3 Perlen liegen in der Größenordnung von 133 bis 215 um. </li></ol> 2. Nährmedienzubereitung <ol><li> Bereiten Sie 1L RCCS optimiert GTSF-2-Medien (in Anlehnung an 22), die von 40% MEM alpha besteht, plus Beilagen und 60% L-15 Leibovitz Medien (in Anlehnung an 22). Zuerst bereiten in einem Gesamtvolumen von MEM alpha ergänzt mit 400 ml: 21,2 mm Natriumbicarbonat 0,06% Pepton 0,7 Fructose 1.4mm Galactose 5.6mm Glucose 1% HEPES 1% L-Glutamin 0,5% ITS 10% FBS </li><li> Zur Vorbereitung einer Stammlösung von ITS, in 5 ml sterile angesäuert H 2 O durch Zugabe von Eisessig (ca. 0,05 ml) vorbereitet auflösen. Swirl zu lösen, mit 45ml sterilem Wasser zu folgen. </li><li> Abwiegen genug L-15 Leibovitz Pulver für 600 ml Medium durch Lösen in Gewebe-culture grade H 2 O. </li><li> Bringen Sie das Gesamtvolumen der Zellkulturmedium auf 1L mit L-15 Leibovitz-Medium. Filter-sterilisiert und bei 4 ° C im Dunkeln. Add 1% Penicillin-Streptomycin individuell auf jedes Aliquot des verwendeten Mediums. </li><li> Viele Medien Formulierungen außer GTSF-2-Medien wurden erfolgreich in die RCCS getestet. Einzelne Laboratorien müssen für sich selbst entscheiden, welches Medium eignet sich optimal für das Experiment durchgeführt wird. </li></ol> 3. Cells und Bead Incubation <ol><li> Propagieren der EVTs um ~ 80% Konfluenz, trypsinize und zählen nach anerkannten Zellkultur Praktiken. </li><li> Suspend 1x10 6 EVTs in 4 ml warmemed Medien. </li><li> Vorsichtig mischen vorbereitet Cytodex-3 Perlen. Mit sterile Techniken, entfernen Sie 2,5 ml der vorbereiteten Beads mit einer breiten Spitze, 10 ml serologische Pipette und Transfer zu einem nicht verwendeten 15 ml konische Röhrchen. Beachten Sie, dass es möglicherweise einen kleinen Verlust von Beads werden, da sie Wert auf die Pipette. </li><li> Lassen Sie die Cytodex-3 Perlen auf dem Boden des Röhrchens zu begleichen. Nach der Sedimentation, verwenden Sie eine Pipette, um die oberste Schicht der DPBS ohne die Cytodex-3 Perlen zu entfernen. </li><li> Mischen Sie die 1x10 6 hergestellt EVTs in Medien mit dem vorbereiteten Cytodex-3 Perlen. </li><li> Inkubieren Sie die Zell-Bead-Mischung bei Raumtemperatur für 30 min. Von Zeit zu Zeit vorsichtig mischen. Inkubieren für weitere 30 min bei 37 ° C und 5% CO 2. Von Zeit zu Zeit vorsichtig mischen. </li></ol> 4. Das Laden der RWV <ol><li> In einer laminaren Strömung Schrank, entfernen Sie einen 10 mL RCCS aus der Verpackung und legen Sie sie in einem sterilen, 6-well Mikrotiterplatte für Stabilität. Siehe Abbildung 1 für eine markierte Diagramm des RC AbbildungCS. </li><li> Entfernen Sie den großen Stopfen aus dem Hafen. </li><li> Bringen Sie das Gesamtvolumen der Inkubation Zell-Bead-Mischung auf 10 ml mit erwärmten Medien. </li><li> Laden Sie die Zelle / Bead-Mischung in die RCCS durch den großen Hafen. Die RCCS sollte gekippt werden im 45 ° Winkel (großer Hafen up) beim Laden um die Entfernung des möglichen Luftblasen zu unterstützen. Prevent Aufbau von Überdruck durch Befüllen des Behälters langsam und stetig. </li><li> Ersetzen Sie den Stopfen in den großen Hafen. </li><li> Entfernen Sie den Kolben aus dem 3-ml-Spritzen und Ort der leeren Spritzen auf die kleinen Häfen. Add 1-3 ml Medium zu jeder Spritze. Langsam öffnen sich die beiden Ventile. Ersetzen Sie die Spritze Kolben auf die Spritzen sanft. Fügen Sie Medien aus einer Spritze, bis alle Luft aus dem Innenraum entfernt werden. </li><li> Nehmen Sie den RCCS und klopfen Sie leicht die Seite beim Drehen sie vor Ihnen, um Luftblasen zu überprüfen. Wenn es irgendwelche Blasen sind, müssen Sie sie aus der Kammer, wie Luftblasen unter Bildung o störenf Zellaggregate und stellen Scherkräfte. Entfernen Sie Luftblasen durch Drehen des RCCS bis die Blasen unter dem kleinen Hafen sind. Dann vorsichtig nach unten auf die Spritze auf der gegenüberliegenden Seite, um die Luftblasen in den Hafen und aus der Kammer zu erzwingen. </li><li> Schließen einer Seite Port. Drücken Sie vorsichtig auf die andere Spritze Kolben eine kleine Menge von positivem Druck in den Behälter, die Blasen verhindert die Bildung von einzuführen. Close zweite Ventil. </li><li> Laden Sie die RCCS auf den Rotor. Starten Sie die Rotation bei 19rpm in einem 37 ° C CO 2-Inkubator. </li></ol> 5. Ändern der Medien <ol><li> Ändern Sie die Medien jeden zweiten Tag für die ersten drei Tage, dann jeden Tag danach. </li><li> Schalten Sie den Rotor und entfernen Sie die RCCS. Ziehen Sie den Kolben bis zu einigen Sog erzeugen, entfernen Sie die Spritze aus jedem kleinen Hafen und Ort der RCCS auf einem Winkel, so dass die Perlen Gegenteil von dem großen Hafen zu begleichen. </li><li> Nachdem die Perlen alle niedergelassen haben, öffnen Sie eine der kleinen Ventile undermöglichen die Medien fließen aus dem RCCS und in einen Abfallbehälter. Nehmen Sie 2 / 3 der Medien auf diese Weise. Achten Sie darauf, nicht stören die Perlen und nicht verwerfen Aggregate. </li><li> Schließen Sie das kleine Ventil und öffnen Sie den großen Hafen. Add Medien wieder in die RCCS durch den großen Hafen. Ersetzen Sie den Stopfen in den großen Hafen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 4,6 bis 4,9. </li><li> Da die Aggregate an Größe zunehmen, müssen Sie die Drehzahl erhöhen, um sie in der Schwebe zu halten jederzeit, idealerweise in einem kleinen Kreislauf Muster mit optimaler Geschwindigkeit. Generell erhöht die Geschwindigkeit zwischen 0,3 bis 0,7 min nach jeder Fütterung, wenn die Aggregate zusehends beginnen. </li></ol> 6. Sammeln propagierten Cells <ol><li> Entfernen Sie die RCCS aus dem Rotor. Entfernen Sie die Spritze aus jedem kleinen Hafen und Ort der RCCS auf einem Winkel, so dass die Perlen Gegenteil von dem großen Hafen niederlassen kann. </li><li> Nachdem die Perlen alle niedergelassen haben, öffnen Sie eine der kleinen Ventile und lassen Sie die Medien heraus zu fließender RCCS und in einen Abfallbehälter. Nehmen Sie 1 / 3 der Medien auf diese Weise. </li><li> Schließen Sie das kleine Ventil und öffnen Sie den großen Hafen. Vorsichtig schwenken das Schiff, um die Aggregate wieder in Lösung zu zerstreuen. Leere flüssige Mischung in ein steriles 50 ml konischen Röhrchen. Lassen Sie die gesammelten Aggregate in den konischen Rohr, bevor Sie Überstand gründlich waschen Kulturgefäß zur Wiederaufnahme der Aggregate zu maximieren begleichen. Die Aggregate können für nachfolgende Tests sofort verwendet werden, z. B. Durchflusszytometrie, Invasionsassays, Immunfluoreszenz und andere. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für EVT-ähnlichen Zellen (SGHPL-4 Trophoblasten-Zelllinie) in der RCCS auf Cytodex-3 Perlen gewachsen ist in Abbildung 2 dargestellt. Das EVT-like-Zelllinie zeigt Vorsprünge entfernt von den wichtigsten Cluster und verbundenen benachbarten Clustern. Viele der Beads sind vollständig mit Zellen bedeckt propagieren. Einmal aus dem RCCS und pla entferntTed auf einer extrazellulären Matrix, die EVT-like 3-D gewachsenen Zellen aggressiv in und / oder zu migrieren (Abbildung 3). RT-PCR Daten bestätigen die erhöhte Expression von MMPs in 3-D-Aggregate gesehen zu traditionellen Zellkultur Monoschichten (Abbildung 4) entgegen. Interessanterweise sind Gene nicht mit Invasion assoziiert auch in der RCCS hochreguliert (Tabelle 1) und kann bei der Abgrenzung dieser Gebiete als immun Interaktionen mit eindringenden Trophoblasten-Zellen zu unterstützen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig1.jpg" /> Abbildung 1. Cartoon Darstellung der Rotating Cell Culture System (RCCS). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig2.jpg" /> Abbildung 2. Phasenkontrast-Aufnahme von einem Vertreter Aggregat nach 5 Tagen Wachstum in einem RCCS. Die Pfeile zeigen die eindringenden Zellen und * bezeichnet das Cytodex-3 Mikroträger Perlen. <imgalt = &quot;Bild 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3367/3367fig3.jpg&quot; /&gt; Abbildung 3. RCCS Grown Aggregate wurden in Fibringele eingebettet. Invasion durch die Fibrin-Gel wurde so früh wie (A) 24 Stunden nach der Fibrin Einbettung beobachtet und (B) über 48 Stunden fortgesetzt. Die Pfeile zeigen die eindringenden Zellen und * bezeichnet das Cytodex-3 Mikroträger-Beads (Adaptiert mit Erlaubnis aus Lit.. 7). <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig4.jpg" /> Abbildung 4. Vergleichende Gelatine Zymogramm von Mono-und RCCS propagiert SGHPL-4 EVT-ähnliche Zellen. Pro-und aktiven Formen von MMP-2 und MMP-9 wurden von den RCCS gewachsen Trophoblastzellen (Übernommen mit freundlicher Genehmigung aus Lit.. 7) ausgeschieden. <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/3367/3367table1.jpg" /> Tabelle 1. Zusammenfassung der Microarray-Ergebnisse aus SGHPL-4-Zellen in einem RCCS gewachsen (Übernommen mit freundlicher Genehmigung aus Lit.. 7). <ol class="lalpha"><liNormierte 3-D-Gen-Wert / normalisierend monlayer Gen-Wert:&gt; fache Induktion in der 3-D-Aggregate wurde wie folgt berechnet. </li><li> Zeigt an, Gene, die unterhalb der Nachweisgrenze in Monoschichten wurden. </li></ol>

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	<li>Knofler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+growth+factors+and+signalling+pathways+controlling+human+trophoblast+invasion.">Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion.</a> Int. J. Dev. Biol. 54, 269-269 (2010).</li><li>Cartwright, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+at+the+maternal-fetal+interface:+relevance+to+human+pregnancy+disorders.">Remodelling at the maternal-fetal interface: relevance to human pregnancy disorders.</a> Reproduction. 140, 803-803 (2010).</li><li>Harris, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFPA+Gabor+Than+Award+lecture:+Transformation+of+the+spiral+arteries+in+human+pregnancy:+key+events+in+the+remodelling+timeline.">IFPA Gabor Than Award lecture: Transformation of the spiral arteries in human pregnancy: key events in the remodelling timeline.</a> Placenta. 32, S154-S154 (2011).</li><li>Whitley, G. S., Cartwright, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophoblast-mediated+spiral+artery+remodelling:+a+role+for+apoptosis.">Trophoblast-mediated spiral artery remodelling: a role for apoptosis.</a> J. Anat. 215, 21-21 (2009).</li><li>Apps, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+profile+of+first+trimester+villous+and+extravillous+human+trophoblast+cells.">Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells.</a> Placenta. 32, 33-33 (2011).</li><li>Bilban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophoblast+invasion:+assessment+of+cellular+models+using+gene+expression+signatures.">Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures.</a> Placenta. 31, 989-989 (2010).</li><li>LaMarca, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+growth+of+extravillous+cytotrophoblasts+promotes+differentiation+and+invasion.">Three-dimensional growth of extravillous cytotrophoblasts promotes differentiation and invasion.</a> Placenta. 26, 709-709 (2005).</li><li>Jovanovic, M., Stefanoska, I., Radojcic, L., Vicovac, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-8+(CXCL8)+stimulates+trophoblast+cell+migration+and+invasion+by+increasing+levels+of+matrix+metalloproteinase+(MMP)2+and+MMP9+and+integrins+alpha5+and+beta1.">Interleukin-8 (CXCL8) stimulates trophoblast cell migration and invasion by increasing levels of matrix metalloproteinase (MMP)2 and MMP9 and integrins alpha5 and beta1.</a> Reproduction. 139, 789-789 (2010).</li><li>Husslein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+regulation+and+functional+characterization+of+matrix+metalloproteinase-3+of+human+trophoblast.">Expression, regulation and functional characterization of matrix metalloproteinase-3 of human trophoblast.</a> Placenta. 30, 284-284 (2009).</li><li>Barrila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+3D+cell+culture+models:+using+the+rotating+wall+vessel+to+study+host-pathogen+interactions.">Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 791-791 (2010).</li><li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+suspension+culture:+the+rotating-wall+vessel.">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 281, 12-12 (2001).</li><li>Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+tissues+in+microgravity.">Growing tissues in microgravity.</a> Nat. Med. 4, 901-901 (1998).</li><li>Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue-specific+signaling+and+organ+function+in+three+dimensions.">Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions.</a> J. Cell. Sci. 116, 2377-2377 (2003).</li><li>Bentrup, H. ?. ?. n. e. r. z. u., K, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+models+of+human+colonic+epithelium+to+study+the+early+stages+of+enteric+salmonellosis.">Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis.</a> Microbes. Infect. 8, 1813-1813 (2006).</li><li>Carterson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A549+lung+epithelial+cells+grown+as+three-dimensional+aggregates:+alternative+tissue+culture+model+for+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infect. Immun. 73, 1129-1129 (2005).</li><li>Myers, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+phenotypic+gap+between+transformed+neuronal+cell+lines+in+culture+and+untransformed+neurons.">Closing the phenotypic gap between transformed neuronal cell lines in culture and untransformed neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 174, 31-31 (2008).</li><li>Hjelm, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+three-dimensional+organotypic+human+vaginal+epithelial+cell+model.">Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model.</a> Biol. Reprod. 82, 617-617 (2010).</li><li>Straub, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+culture+infectivity+assay+for+human+noroviruses.">In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses.</a> Emerg. Infect. Dis. 13, 396-396 (2007).</li><li>Nickerson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissue+assemblies:+novel+models+for+the+study+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+pathogenesis.">Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis.</a> Infect. Immun. 69, 7106-7106 (2001).</li><li>Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+tissue+culture+model+for+the+study+of+attach+and+efface+lesion+formation+by+enteropathogenic+and+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli.">A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli.</a> Cell. Microbiol. 7, 1771-1771 (2005).</li><li>Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Huh7+cell+culture+system+for+the+study+of+Hepatitis+C+virus+infection.">Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection.</a> Virol. J. 6, 103-103 (2009).</li><li>Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTSF-2:+a+new,+versatile+cell+culture+medium+for+diverse+normal+and+transformed+mammalian+cells.">GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).</li><li>Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTSF-2:+a+new,+versatile+cell+culture+medium+for+diverse+normal+and+transformed+mammalian+cells.">GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).</li><li>GE Healthcare. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier+Cell+Culture+-+Principles+and+Methods.">Microcarrier Cell Culture - Principles and Methods.</a> Handbooks. , (2005).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die Kultur hier vorgestellte Technik bietet den Ermittlern sehr invasiv EVT-ähnliche Zellen. Es wurde nun erkannt, dass ein Verlust der Differenzierung in Monoschichten durch die Hemmung der zellulären Reaktionen auf chemische und molekulare Signale in drei Dimensionen (apikalen, basalen und lateralen Zelloberflächen) 10,13 auftritt. Diese Technik spiegelt Eigenschaften in utero auf eindringende EVT-Zellen festgestellt. Da das Verfahren ahmt konventionelle Monolayer Zellkultur Zeitkinetik, bietet ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Cytodex Mikroträger Perlen </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3275 </td><td></td></tr><tr><td> Rotierende Cell Culture System (RCCS) </td><td> Synthecon </td><td> RCCS-D </td><td> Inklusive Rotorgrundkörper, Stromversorgung, 4 Einweg RCCS Einheiten </td></tr><tr><td> RCCS Einweg-Units </td><td> Synthecon </td><td> Kontakt Synthecon </td><td></td></tr><tr><td> 3ml Luer-Lock Spritze </td><td> BD </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> 10ml breit Spitze serologischen Pipetten </td><td> BD </td><td> 357504 </td><td></td></tr><tr><td> MEM Alpha </td><td> Invitrogen </td><td> 12561-072 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz L-15-Medium, Pulver </td><td> Invitrogen </td><td> 41300-039 </td><td></td></tr><tr><td> H 2 O, Endotoxin frei </td><td> Fischer </td><td> MT-25 bis 055-CM </td><td></td></tr><tr><td> Natriumbikarbonat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-7795 </td><td></td></tr><tr><td> Pepton </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1420-100 </td><td></td></tr><tr><td> Fructose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F3510-100 </td><td></td></tr><tr><td> Galactose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5388-100 </td><td></td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528-250 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Insulin-Transferrin-Natriumselenit (ITS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I1884 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10437 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

rotating cell culture systems for human cell culture: human trophoblast cells as a model

Das Feld der menschlichen Trophoblasten Forschung erleichtert das Verständnis der komplexen Umgebung während Plazentation gegründet. Aufgrund der Natur dieser Studien ist die menschliche In-vivo-Experimente unmöglich. Eine Kombination aus primären Kulturen, Explantation Kulturen und Trophoblasten Zelllinien 1-Unterstützung unser Verständnis der Invasion der Gebärmutterwand 2 und Umbau des Uterus Spiralarterien 3,4 von extravillösen Trophoblastzellen (EVTs), die für die erfolgreiche Etablierung einer Schwangerschaft erforderlich ist. Trotz der Fülle an Wissen aus solchen Modellen entnommen, ist es akzeptiert, dass in vitro Zellkultur-Modellen mit EVT-like-Zelllinien Display zellulären Eigenschaften verändert, wenn ihre in vivo Pendants 5,6 verglichen. Cells in den rotierenden Zellkultursystem (RCCS) kultiviert Display morphologische, phänotypische und funktionelle Eigenschaften von EVT-like-Zelllinien, die mehr genau imitieren Differenzierung in utero EVTs mit einer erhöhten Expression von Genen vermitteln Invasion (zB Matrix-Metalloproteinasen (MMPs)) und Trophoblast Differenzierung 7,8,9. The Saint Georges Hospital Plazenta-Zelllinie-4 (SGHPL-4) (freundlicherweise von Dr. Guy Whitley und Dr. Judith Cartwright gespendet) ist ein EVT-like-Zelllinie, die für die Prüfung in der RCCS verwendet wurde. Das Design des RCCS Kulturgefäß basiert auf dem Prinzip, dass Organe und Gewebe in einer dreidimensionalen (3-D-Umgebung) Funktion. Aufgrund der dynamischen Kulturbedingungen in dem Behälter, einschließlich der Bedingungen der physiologisch relevanten Scher-, Zellen in drei Dimensionen gewachsen bilden Aggregate auf Basis natürlicher zellulärer Affinitäten und differenzieren sich in organotypischen Gewebe-like Baugruppen 10,11,12. Die Wartung einer Flüssigkeit Bahn bietet eine Low-Shear, turbulenzarme Umgebung ähnlich Bedingungen in vivo gefunden. Sedimentation der kultivierten Zellen durch Anpassung der Drehung entgegenGeschwindigkeit des RCCS, um eine konstante freien Fall der Zellen zu gewährleisten. Der Gasaustausch erfolgt durch eine durchlässige hydrophobe Membran auf der Rückseite des Bioreaktors befinden. Wie ihre Eltern Gewebe in vivo sind RCCS-gewachsenen Zellen in der Lage, chemische und molekulare Gradienten in drei Dimensionen (dh an ihrem apikalen, basalen und seitlichen Flächen) zu reagieren, weil sie auf der Oberfläche des porösen Mikroträger Perlen gezüchtet werden. Wenn als zweidimensionale Monolagen auf versiegelten Oberflächen wie Kunststoff gewachsen sind die Zellen dieser wichtigen Kommunikationsmittel, über die basale Fläche entzogen. Folglich ist die räumliche Beschränkungen durch die Umwelt stark beeinflussen, wie Zellen Sinn und decodieren Signale aus dem umgebenden Mikroumgebung, was darauf schließen lässt eine wichtige Rolle für die 3-D Milieu 13. Wir haben die RCCS verwendet werden, um biologisch sinnvolle 3-D Modelle der verschiedenen menschlichen epithelialen Geweben 7,14,15,16 Ingenieur. Tatsächlich haben viele frühere Berichte DMonstrated, dass Zellen in der RCCS kultiviert werden können physiologisch relevanten Phänotypen, die nicht mit anderen Modellen 10,17-21 möglich zu übernehmen. Zusammenfassend stellt Kultur in der RCCS eine einfache, reproduzierbare, High-Throughput-Plattform, die eine große Anzahl von differenzierten Zellen, die zugänglich für eine Vielzahl von experimentellen Manipulationen bietet. In dem folgenden Protokoll, mit EVTs als ein Beispiel, wir eine klare Beschreibung der erforderlichen Schritte, um dreidimensional Kultur adhärenter Zellen in der RCCS.

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Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Traditional, zweidimensionalen Zellkultur-Techniken oft in veränderten Eigenschaften in Bezug auf die Differenzierung Marker, Zytokine und Wachstumsfaktoren führen. Dreidimensionale Zellkulturen in den rotierenden Zellkultursystem (RCCS) wiederherstellt Expression vieler dieser Faktoren, wie hier mit einem extravillösen Trophoblasten-Zelllinie gezeigt.

Rotierende Cell Culture Systems für Human Cell Culture: Human Trophoblastzellen als Modell

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

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JoVE Journal

Bioengineering

16.4K Aufrufe.  Tulane University Medical School. Traditional, zweidimensionalen Zellkultur-Techniken oft in veränderten Eigenschaften in Bezug auf die Differenzierung Marker, Zytokine und Wachstumsfaktoren führen. Dreidimensionale Zellkulturen in den rotierenden Zellkultursystem (RCCS) wiederherstellt Expression vieler dieser Faktoren, wie hier mit einem extravillösen Trophoblasten-Zelllinie gezeigt.

Serie: Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Forschung

Biotechnik

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent shape upon the application of a stimulus such as heat1-5. In a typical shape memory cycle, the SMP is first deformed at an elevated temperature that is higher than its transition temperature, Ttrans [either the melting temperature (Tm) or the glass transition temperature (Tg)]. The deformation is elastic in nature and mainly leads to a reduction in conformational entropy of the constituent network chains (following the rubber elasticity theory). The deformed SMP is then cooled to a temperature below its Ttrans while maintaining the external strain or stress constant. During cooling, the material transitions to a more rigid state (semi-crystalline or glassy), which kinetically traps or "freezes" the material in this low-entropy state leading to macroscopic shape fixing. Shape recovery is triggered by continuously heating the material through Ttrans under a stress-free (unconstrained) condition. By allowing the network chains (with regained mobility) to relax to their thermodynamically favored, maximal-entropy state, the material changes from the temporary shape to the permanent shape.
Cells are capable of surveying the mechanical properties of their surrounding environment6. The mechanisms through which mechanical interactions between cells and their physical environment control cell behavior are areas of active research. Substrates of defined topography have emerged as powerful tools in the investigation of these mechanisms. Mesoscale, microscale, and nanoscale patterns of substrate topography have been shown to direct cell alignment, cell adhesion, and cell traction forces7-14. These findings have underscored the potential for substrate topography to control and assay the mechanical interactions between cells and their physical environment during cell culture, but the substrates used to date have generally been passive and could not be programmed to change significantly during culture. This physical stasis has limited the potential of topographic substrates to control cells in culture.
Here, active cell culture (ACC) SMP substrates are introduced that employ surface shape memory to provide programmed control of substrate topography and deformation. These substrates demonstrate the ability to transition from a temporary grooved topography to a second, nearly flat memorized topography. This change in topography can be used to control cell behavior under standard cell culture conditions.

A method for developing cell culture substrates with the ability to change topography during culture is described. The method makes use of smart materials known as shape memory polymers that have the ability to memorize a permanent shape. This concept is adaptable to a wide range of materials and applications.

Formgedächtnis-Polymere für Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

Dreidimensionale Zellkultur-Modell zur Messung der Auswirkungen der interstitiellen Flüssigkeit Flow auf Tumorzellinvasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Zelle Co-Kultur Strukturierung mit wässrigen Zwei-Phasen-Systeme

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to model well differentiated human airway epithelium and heart muscle cells. This could be an invaluable tool to study the deleterious effects of toxic inhaled chemicals, such as chlorine, that can normally interact with the cell surfaces, and form various byproducts upon reacting with water, and limiting their effects in submerged cultures. Our model using well differentiated human airway epithelial cell cultures at air-liqiuid interface circumvents this limitation as well as provides an opportunity to evaluate critical mechanisms of toxicity of potential poisonous inhaled chemicals. We describe enhanced loss of membrane integrity, caspase release and death upon toxic inhaled chemical such as chlorine exposure. In this article, we propose methods to model chlorine exposure in mammalian heart and airway epithelial cells in culture and simple tests to evaluate its effect on these cell types.

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

This protocol is designed to demonstrate exposure method of cell cultures to inhaled toxic chemicals. Exposure of differentiated air-liquid&#160;interface (ALI) cultures of airway epithelial cells provides a unique model of airway exposure to toxic gases such as chlorine. In this manuscript we describe effect of chlorine exposure on air-liquid&#160;interface cultures of epithelial cells and submerged culture of cardiomyocytes. In vitro exposure systems allow important mechanistic studies to evaluate pathways that could then be utilized to develop novel therapeutic agents.

In-vitro-Zellkulturmodell für Toxic Inhalative Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies of endothelial-epithelial bilayers have traditionally relied on permeable support models that enable bilayer culture, but permeable supports are limited in their ability to replicate the diversity of human basement membranes. In contrast, hydrogel models that require chemical synthesis are highly tunable and allow for modifications of both the material stiffness and the biochemical composition via incorporation of biomimetic peptides or proteins. However, traditional hydrogel models are limited in functionality because they lack pores for cell-cell contacts and functional in vitro migration studies. Additionally, due to the thickness of traditional hydrogels, incorporation of pores that span the entire thickness of hydrogels has been challenging. In the present study, we use poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels and a novel zinc oxide templating method to address the previous shortcomings of biomimetic hydrogels. As a result, we present an ultrathin, basement membrane-like hydrogel that permits the culture of confluent cellular bilayers on a customizable scaffold with variable pore architectures, mechanical properties, and biochemical composition.

Current bilayer culture models do not allow for functional in vitro studies that mimic in vivo microenvironments. Using polyethylene glycol and a zinc oxide templating method, this protocol describes the development of an ultrathin biomimetic basement membrane with tunable stiffness, porosity, and biochemical composition that closely mimics in vivo extracellular matrices.

Ultradünne derzei-elastischen Hydrogele als eine biomimetische Basalmembran für Dual Zellkultur

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by several researchers. However, most of these investigators have used polyacrylamide hydrogels for stem cell culture in their studies. Therefore, their results are controversial because those results might originate from the specific characteristics of the polyacrylamide and not from the physical cue (stiffness) of the biomaterials. Here, we describe a protocol for preparing hydrogels, which are not based on polyacrylamide, where various stem, cells including human embryonic stem (ES) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells, can be cultured. Hydrogels with varying stiffness were prepared from bioinert polyvinyl alcohol-co-itaconic acid (P-IA), with stiffness controlled by crosslinking degree by changing crosslinking time. The P-IA hydrogels grafted with and without oligopeptides derived from extracellular matrix were investigated as a future platform for stem cell culture and differentiation. The culture and passage of amniotic fluid stem cells, adipose-derived stem cells, human ES cells, and human iPS cells is described in detail here. The oligopeptide P-IA hydrogels showed superior performances, which were induced by their stiffness properties. This protocol reports the synthesis of the biomaterial, their surface manipulation, along with controlling the stiffness properties and finally, their impact on stem cell fate using xeno-free culture conditions. Based on recent studies, such modified substrates can act as future platforms to support and direct the fate of various stem cells line to different linkages; and further, regenerate and restore the functions of the lost organ or tissue.

A protocol is presented to prepare polyvinyl alcohol-co-itaconic acid hydrogels with varying stiffness, which were grafted with and without oligopeptides, to investigate the effect of the stiffness of biomaterials on the differentiation and proliferation of stem cells. The stiffness of the hydrogels was controlled by the crosslinking time.

Menschlichen pluripotenten Stammzelle-Kultur auf Polyvinyl Alkohol-Co-Itaconic Säure Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit Xeno-freien Bedingungen

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Ein menschliches 3D extrazelluläres Matrix-Adipozyten-Kulturmodell zum Studium der Matrix-Zell Metabolischen Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...