Viele Schwangerschaften scheitern früh in der entwicklung menschlicher Embryonen um die sieben oder acht Nachbefruchtung. Dieses Protokoll bietet den Forschern die Möglichkeit, während dieses mysteriösen Implantationsfensters menschliche Konzeptoren in vitro zu entwickeln. Dies ermöglicht es uns, die Mechanismen zu verstehen, die den Erfolg der menschlichen Implantation und frühen Plazentabildung untermauern.
Die Verwendung eines erweiterten Kultursystems zum Anbau von peri-implantationsweichen menschlichen Embryonen in vitro ist wahrscheinlich die einzige Möglichkeit, authentische Materialien zu erhalten, um Implantation und frühe Tropoblastdifferenzierung zu untersuchen. Diese einfache Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das es uns ermöglicht, viele grundlegende Fragen über die frühe Entwicklung des Menschen zu beantworten. Forschung mit der Verwendung dieses Protokolls durchgeführt wird weitgehend zum Verständnis des frühen Schwangerschaftsverlusts, wiederkehrendeim implantationsversagen und der Plazentapathologien beitragen.
Demonstriert wird das Verfahren von Deirdre Logsdon, dem Doktoranden eines Labors. Einen Tag vor der Erwärmung des Embryos bereiten Sie Medien und Rückgewinnungsplatten in einer sterilen laminaren Strömungshaube vor. Füllen Sie zwei Zentrum gut OrganKultur Waschgerichte mit 500 Mikroliter BM mit 10%SPS, dann decken Sie die BM mit 500 Mikroliter embryo Kultur Grade Öl.
In einer 16-Millimeter-Gewebekulturschale acht Milliliter Embryokulturöl schichten und 20 Mikroliter-Tropfen BM mit 10% SPS nach unten verankern. Gleichgewichten Sie die Waschschüsseln und die Rückgewinnungsplatte in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius, 6% Kohlendioxid und 5% Sauerstoff für mindestens vier Stunden. Aliquot etwa vier Milliliter IVC 1 in einem Fünf-Milliliter-Snap-Cap-Rohr und bereiten Sie eine Waschschale mit 500 Mikroliter IVC 1 ohne Öl-Overlay zu.
Die Schale und die Tube im Inkubator mindestens vier Stunden ausdemaieren. Fibronectin aus menschlichem Serum in PBS auf 30 Mikrogramm pro Milliliter verdünnen. Öffnen Sie die acht gut gekammerten Coverslip-Paket mit Pflege nicht die Brunnen berühren, dann sanft Pipette 250 Mikroliter des Fibronectin in jedem Brunnen.
Ersetzen Sie den Deckel auf dem Deckel und inkubieren Sie ihn bei vier Grad Celsius für 20 bis 24 Stunden. Bereiten Sie die erweiterte Kulturplatte am Morgen der Embryoerwärmung vor. Holen Sie den kammerierten Deckelschlupf mit Fibronectin und legen Sie ihn in die laminare Strömungshaube.
Dann entfernen Sie die Fibronectin-Mischung mit einer Ein-Milliliter-Pipette und entsorgen Sie sie. 300 Mikroliter des ausgeglichenen IVC 1 in jeden Brunnen geben und den Deckelinin in den Inkubator bis zur Entfernung der Zona pellucida legen. Nach der Erwärmung und Erholung der D5 menschlichen Embryonen, bewerten Sie sie für die Re-Expansion und fotografieren Sie jeden Embryo.
Bewegen Sie jeden Embryo auf 500 Mikroliter eines MOPS gepufferten Handhabungsmediums mit 5%FCS. Behandeln Sie sie dann mit der sauren Tyrodes Lösung, wie sie im Textmanuskript beschrieben ist. Den Embryo mit der sich auflösenden Zona sofort in 300 Mikroliter erwärmtes MOPS-gepuffertes Medium bewegen, um die Tyrodeslösung zu löschen.
Dann bewegen Sie den Embryo in eine zentrale Brunnenorgangewebeschale, die das gleichgestellte BM mit 10% SPS unter dem embryokultursen Öl enthält. Dann kehren Sie den Embryo zum 20-Mikroliter-Regenerationstropfen zurück. Bewegen Sie die Embryonen einzeln mit den gleichgezurrten IVC 1-Medien in die Waschschale, und bewegen Sie dann sorgfältig jeden Embryo in einen Brunnen des kammerkammerierten Deckellips, um den Überblick über die Embryo-Identifikation zu behalten.
Geben Sie den kammerierten Deckelrutsch für zwei Tage an einen Inkubator zurück, der auf 37 Grad Celsius, 6% Kohlendioxid und Luftsauerstoff eingestellt ist. Am zweiten Tag des Wachstums, untersuchen Sie sorgfältig die Anhaftung der Embryonen unter dem Mikroskop und tauschen Die Medien aus. Wissen Sie, welcher Embryo an der Schale befestigt ist, indem Sie sanft auf die Platte tippen.
Um die Medien zu wechseln, entfernen Sie den Deckel und saugen Sie sorgfältig 150 Mikroliter IVC 1 an, wobei Darauf zu achten ist, dass der angeschlossene Embryo nicht gestört wird. Wenn ein Embryo noch nicht an der Platte befestigt ist, tauschen Sie die Medien nicht aus, da das Serum in IVC 1 bei der Befestigung hilft. Langsam Pipette 150 Mikroliter ausgleich verlängerte Kulturmedien, IVC 2 in jeden Brunnen und Ersetzen Sie den Deckel auf dem Deckel.
Sorgfältig den kammerierten Deckelschlupf an den Inkubator zurück. Wiederholen Sie den Medienaustausch und die Anhaftungsprüfung jeden Tag, bis die Embryonen zur Fixierung oder zur einzelzelligen Verdauung bereit sind. Wenn die Sammlung der verbrauchten Medien für die weitere Analyse erforderlich ist, fangen Sie die 150 Mikroliter entfernten IVC 1 in ein steriles 0,5 Milliliter-Rohr ein.
Waschen Sie jeden Embryo einmal mit 200 Mikroliter PBS, dann fügen Sie 200 Mikroliter Trypsin-Lösung zu jedem Brunnen. Geben Sie den kammerierten Deckelrutsch für fünf Minuten an den Inkubator zurück. Verwenden Sie eine kleine Pipette oder eine fein gezogene Mundpipette, um ein einzelnes MTB aufzunehmen und dann eine größere Pipette zu verwenden, um den Embryo sanft zu dissoziieren, indem Sie nach oben und unten suchen.
Den Embryo vorsichtig und wiederholt mit einer Pipettenspitze mit kleinerem Durchmesser weiter anheben, bis der Embryo insgesamt 10 Minuten lang in Trypsin inkubiert wurde. Um eine Einzelzellauswahl durchzuführen, bewegen Sie die dissoziierten Zellen durch 320 Mikroliter Waschtropfen PBS und 0,1%PVP unter Embryokulturöl, wobei darauf geachtet wird, keine Zellen zu verlieren. Nach dem Waschen der Zellen verwenden Sie eine fein gezogene Glaspipette, um eine Zelle auszuwählen.
Pipetten Sie die Einzelzelle vorsichtig in ein steriles 0,2 Milliliter Low-Bind-Rohr mit einem minimalen Volumen von PBS und PVP. Schnappen Sie freie Einzelzellen in flüssigem Stickstoff und speichern Sie sie bei negativen 80 Grad Celsius für die weitere Verwendung. Gesunde Embryonen zeigten im Laufe einer ausgedehnten Kultur eine anhaltende Proliferation, während abnorme Embryonen begannen, sich von ihren äußeren Rändern zurückzuziehen und sich aufzulösen.
Am achten Tag nach der Befruchtung waren die meisten Zellen in den Embryonen Zytotrophoblasten oder CTBs, die positiv für den Trophoblastenmarker GATA-3 waren. An der Peripherie des Embryos unterschieden sich die CTBs bereits in mehrkernige Synzytiotrophoblasten, die ein blattähnliches Aussehen hatten und positiv für den Menschen CGB gefärbt waren. Am 10. Tag war die Bildung von CGB-positiven wandernden Trophoblastzellen maximal, was durch den Anstieg der HCG-Produktion zu diesem Zeitpunkt bestätigt wurde.
Wandernde Trophoblasten, die für HLA-G positiv gefärbt wurden, begannen ebenfalls zu entstehen und aus dem Embryokörper wegzuwandern. Am 12. Tag war die STB-Differenzierung rückläufig und die MTB-Produktion wurde stärker, was auf eine Verlagerung der Schwerpunkte von der Hormonproduktion am 10. Tag auf die Zellmigration am 12. Tag hindeutet. Diese Veränderungen können in einem Zeitraffervideo der Peri-Implantationszeit beobachtet werden.
Das Video zeigt den Zusammenbruch des Blastoceles, die Bildung des STB und die eventuelle Differenzierung und Migration von MTB. Das Wichtigste, was Sie bei Abschluss dieses Verfahrens beachten sollten, ist, dass Sie mit lebenden Embryonen arbeiten, die empfindlich auf Temperatur-, Osmolalitäts- und pH-Wert-Änderungen reagieren. Die Minimierung der Zeit, die die Gerichte ageniert aus dem Brutkasten sind, ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Gesundheit des Embryos.
Nach Abschluss dieses Verfahrens können die Forscher isolierte Einzelzellen für nachgeschaltete einzelzellige Omics-Assays wie die sequenziumierende RNA-Sequenzierung einzelner Zellen und die vollständige Genom-Bisulfit-Sequenzierung verwenden, um epigenetische und transkriptomische Veränderungen während der menschlichen Implantation und frühen Plazentabildung besser zu verstehen.
