Wie der Name unserer Institution, das Institut für Maternal-Fetal Medicine, vermuten lässt, konzentriert sich unsere Forschung hauptsächlich auf die weibliche Fortpflanzungsbiologie. Unser Ziel ist es, den Mechanismus von Fortpflanzungsstörungen zu verstehen und potenzielle Angriffspunkte für ihre Behandlung zu identifizieren. Ein wesentlicher Vorteil dieses Ansatzes ist die erhebliche Reduzierung von Zeit und Aufwand im Vergleich zu kommerziell erhältlichen Co-Kultur-Systemen.
Das selbstgebaute Gerüst ist aus leicht erhältlichen Materialien gebaut, was die Kosten für den Aufbau erheblich senkt. Diese mehrzelligen in vitro Modelle repräsentieren besser eine komplexe in vivo Anatomie der Implantationsregion. In Zukunft wird unser Labor andere Zelltypen in dieses gemischte Multizell-In-vitro-Modell einführen und sowohl Implantationsstudien als auch die Uterusfunktion bei der Pathogenese von Krankheiten wie Endometriumverletzungen und intrauteriner Adhäsion untersuchen.
Besorgen Sie sich zunächst das 3D-gedruckte Gerüst für den Modellbau. Legen Sie für die Zellkultur ein sauberes und steriles quadratisches 18-Millimeter-Deckglas an den Boden einer 12-Well-Platte. Beschichten Sie das Deckglas mit 200 Mikrolitern extrazellulärer Matrix in einer Konzentration von 200 bis 300 Mikrogramm pro Milliliter.
Halten Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie dann die extrazelluläre Matrix von der Platte. Untersuchen Sie als Nächstes die zuvor kultivierten menschlichen embryonalen Stammzellen und Ishikawa-Zellen unter einem Mikroskop, um die entsprechende Konfluenz zu bestätigen.
Entfernen Sie dann das verbrauchte Medium aus den Vertiefungen und waschen Sie die Zellen zweimal mit drei Millilitern PBS. Inkubieren Sie nun die Zellen mit zwei Millilitern Dissoziationsenzym bei 37 Grad Celsius für zwei Minuten, um sie zu lösen. Neutralisieren Sie die Reaktion mit einem vollständigen Nährmedium.
Stellen Sie dann eine einzellige Suspension her, indem Sie auf und ab pipettieren. Mischen Sie nun 100 Mikroliter der Zellsuspension mit Trypanblau und halten Sie dabei einen Verdünnungsfaktor von zwei ein. Schieben Sie dann das Deckglas über die Hämozytometerkammer.
Füllen Sie beide Seitenkammern mit der mit Trypanblau vermischten Zellsuspension. Zählen Sie die Anzahl der Zellen in Quadraten auf beiden Seiten unter einem 20-fachen Mikroskop und berechnen Sie die Zelldichte basierend auf den Zählungen. Nun säen Sie die menschlichen embryonalen Stammzellen in einer Konzentration von 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter in die vorbereitete Platte mit frischem Medium und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 24 Stunden.
Für die Ishikawa-Zelllinie säen Sie die Zellen am nächsten Tag ohne Deckglas in die Vertiefung. Weichen Sie die Gerüste zwei Tage lang gründlich mit Ethylalkohol und doppelt destilliertem Wasser ein. Entfernen Sie nach dem Einweichen das doppelt destillierte Wasser und verschließen Sie die Metalldose.
Anschließend werden die Gerüste mit einem Autoklaven bei 121 Grad Celsius sterilisiert. Lassen Sie sie danach trocknen. Geben Sie etwa zwei Milliliter Komplementärmedium in die Vertiefung mit den Ishikawa-Zellen.
Übertragen Sie das Deckglas mit den daran befestigten humanen embryonalen Stammzellen auf das Gerüst und positionieren Sie die Zellseite nach unten. Stecken Sie das Gerüst in die Vertiefung mit den Ishikawa-Zellen. Für den zweiten Aufbau legen Sie das Deckglas mit Ishikawa-Zellen auf das Gerüst und stecken es in die Vertiefung mit den embryonalen Stammzellen.
Inkubieren Sie die Co-Kultursysteme bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Entfernen Sie das Kulturmedium vorsichtig aus den Vertiefungen und spülen Sie die Zellen vorsichtig mit sterilem PBS aus. Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette oder Pinzette die Deckgläser mit den anhaftenden Zellen aus den Kulturschalen.
Legen Sie optional die Deckgläser in eine neue Schale mit PBS, um sie während des Transfervorgangs hydratisiert zu halten. Geben Sie einen Tropfen PBS auf einen sauberen Objektträger und übertragen Sie das Deckglas mit den Zellen vorsichtig auf den Tropfen, wobei Sie sicherstellen, dass die Zellen mit der Vorderseite nach unten auf den Objektträger zeigen. Positionieren Sie den vorbereiteten Objektträger auf dem Tisch eines inversen Mikroskops.
Wählen Sie das geeignete Objektiv aus und verwenden Sie die Grob- und Feinfokusknöpfe, um den Fokus einzustellen. Legen Sie Mikroskopparameter fest, einschließlich Beleuchtungsintensität und Kameraeinstellungen. Verwenden Sie die Mikroskopsoftware, um Bilder mit den gewünschten Vergrößerungen und Sichtfeldern aufzunehmen.
Die Dichte beider Zelltypen blieb in der Co-Kultur-Bedingung nach 72 Stunden niedrig, während die unabhängig voneinander kultivierten Zelldichten signifikant anstiegen. Die Länge von co-kultivierten humanen embryonalen Stammzellen war kürzer als die von unabhängig kultivierten.
