Zecken sind hämatophagoe Ektoparasiten, Rhipicephalus microplus, im Volksmund bekannt als rinderzecken hat enorme negative wirtschaftliche Auswirkungen auf das Vieh in tropischen Gebieten. Darüber hinaus stimulieren zunehmende Sorgen über degradierte Umweltbedingungen und Sorgen um die öffentliche Gesundheit, die durch den unsachgemäßen Einsatz chemischer Akarizide und die zunehmende Resistenz von Zeckenpopulationen gegen traditionelle Parasiten verursacht werden, die Forschung über alternative Kontrollmethoden, wie die Verwendung von entomopathogenen Pilzen. Diese Entomopathogene infizieren aktiv Arthropodenwirte durch ihre Nagelhaut und besiedeln ihren Körper.
Der Arthropode kann unterschiedliche Reaktionen auf die Pilzinfektion haben. Arthropoden Immunsystem ist in humorale und zelluläre Reaktionen unterteilt. Die humorale Reaktion beinhaltet HemagglutinationSprozess und Produktion von antimikrobiellen Molekülen, während Hämozyten die zelluläre Immunantwort vermitteln.
Die meisten Studien über Arthropoden Immunantwort werden mit Insekten berichtet, während Zeckenreaktionen weniger erforscht bleiben. Auch Pathogen-Inokulation und Zeckenhämäule-Sammlung sind schlecht weit verbreitete Techniken notwendig, um die Immunantwort des Arthropoden besser zu verstehen. Dementsprechend wird in diesem Video die Techniken zur Verfilmung der Impfung, der Hämolympheund-Sammlung und -Verarbeitung verwendet.
Da Zeckenhämozyten Ernte mit einigen Einschränkungen konfrontiert, wie Zellen Disruption, niedrigen Hämolymph-Wert erhalten, und niedrige Konzentration der wiedergewonnenen Zellen. Direkte Infizierung auf Zellenkonfiguration und -analyse. Nach dem Zeckensammeln, waschen engorged Weibchen.
Verwenden Sie Leitungswasser und tauchen Sie sie in 0,5% Natriumhypochloritlösung für drei Minuten in einem 500 Milliliter Glasbecher Empfänger. Teilen Sie die Weibchen für die Nagelhauthygiene in homogene Gruppen mit jeweils 20 Weibchen auf. Es wurden drei Repliken jeder Gruppe durchgeführt.
Metarhizium robertsii blastospores wurden im Impfprozess verwendet. Fügen Sie auf eine Flüssigkeit von fünf Mikroliter metarhizium blastospores Suspension an die Oberfläche einer Kunststoff-Paraffinfolie. Um den Impfprozess zu beschleunigen, können der Kunststoff-Paraffinfilmoberfläche mehrere Blasen hinzugefügt werden, jede Blase entspricht fünf Mikrolitern.
Verwenden Sie eine ein Millimeter ultrafeine Insulinspritze und eine 0,3 Millimeter Nadel, um eine Suspension zu setzen und in die Zecke zu impfen. Denken Sie daran, die gesamte Luft aus der Spritze zu nehmen, bevor Sie sie verwenden. Impfen Sie 5 Mikroliter Pilzsuspension in die Zeckenhündin zwischen scutum und capitulum.
Ein kleines Volumen von Hämolympium kann auf der Rahmung nach dem Nadelschnitt vorhanden sein. Achten Sie darauf, keine Luft zu impfen. Impfen Sie Weibchen mit Pilzsuspension zwischen dem Oberschenkel und dem Körper des Weibchens mit einer ein Milliliter ultrafeinen Insulinspritze, die an eine 0,3-Millimeter-Nadel gekoppelt ist.
Wenn die Metarhizium blastospores Impfung zwischen dem Oberschenkel und dem Körper des Zeckenweibchens durchgeführt wird, kann nach dem Einsetzen der Nadel ein kleines Volumen hämäulend auf dem Oberschenkel vorhanden sein. Achten Sie darauf, keine Luft zu impfen. Verwenden Sie den Gummiteil einer geflügelten Infusion, die ein 0,3-Millionen-Meter-Kapillarrohr und eine Filterspitze für die Hemolymph-Sammlung verwendet.
Stören Sie die weibliche dorsale Nagelhaut mit einer 0,3 Millimeter Nadel. Nach der Störung sanften Druck auf den anterialen Teil des Zeckenkörpers ausüben. Beobachten Sie eine nahezu transparente Flüssigkeit, die sich aus der Disruptionsstelle herausbündelt.
Sammeln Sie die Hämolymphe, indem Sie die Flüssigkeit durch die Filterspitze saugen, die an einen Gummiteil eines geflügelten Infusionssets und ein 0,3-Millimeter-Kapillarrohr gekoppelt ist. Drücken Sie den Körper der Zecke während der Immobilisierung kaum, da dies das Mittelgut stören und die Hämolymphe kontaminieren kann. Warten Sie, bis der sanfte Druck die Flüssigkeit ohne Kontamination vertreiben kann.
Immobilisieren Sie die Zecke. Schneiden Sie ein Stück eines Vorderbeins. Ein oder mehrere Beine können geschnitten werden, und das gleiche Bein kann mehr als einmal geschnitten werden.
Tragen Sie sanften Druck auf den hinteren Körperteil der Zecke auf. Beobachten Sie, wie eine transparente Flüssigkeitsblase auf der geschnittenen Seite auftaucht und mit dem Kapillarrohr sammelt. Drücken Sie den Körper der Zecke nicht kaum, während der Mobilisierung, weil dies das Mittelgut stören und die Hämolymphe kontaminieren kann.
Warten Sie, bis der sanfte Druck die Flüssigkeit ohne Kontamination vertreiben kann. Nach der Hämolymphe-Sammlung in 1,5-Milliliter Mikrotube, die zuvor mit 30 Mikroliter Protease-Cocktail und 82 Mikroliter-Saline-Puffer gefüllt waren, hinterlegen. Halten Sie die Mikroröhren während der gesamten Hämolymph-Sammlung auf Eis.
Zentrifugenproben und das weiche Pellet von Hämozyten werden nach der Hämolymphzentrifugation gebildet. Für die Hämolymphquantifizierung, quantifizieren Sie das Hämolymphvolumen erhalten, indem Sie das Gesamtvolumen innerhalb des Mikroröhrens und Diskontierung des Volumens von Protease-Cocktail und Saline-Puffer erhalten. Entfernen Sie vorsichtig die überstande zellfreie Hämolymphe und hängen Sie die Zellen vorsichtig wieder auf.
Quantifizieren Sie die Hämozyten, indem Sie 10 Mikroliter re-suspended Hämozyten in der Neubauer-Kammer platzieren. Für Zellen wurde ein Kulturmedium verwendet. Schneiden Sie das Vorderbein der Zecke, wenden Sie sanften Druck auf den hinteren Körperteil der Zecke an, beobachten Sie eine transparente Flüssigkeitsblase, die auf der Schnittstelle auftaucht.
Tragen Sie die Hämlymphtropfen direkt auf saubere Mikroskopschlitten auf. Danach verwenden Sie geeignete Methoden, um die Zellen zu färben. Die Impfung zwischen dem Oberschenkel und der Zeckenweibliche Körper kann auch Zecken innere Organe wie Midgut und die malpighian Tubuli beschädigen.
Wenn die Zecke Midgut durch die Nadel bei der dorsalen Hämolymph-Sammlung gestört wird, ist die erhaltene Flüssigkeit rot, nicht transparent. Dies weist auf eine falsche Hämolympheinsammlung hin. In diesem Fall ist die Hämolympium zu entsorgen, da sie kontaminiert ist.
Hämolymphkontamination kann auch beobachtet werden, wenn die Zecke auf natürliche Weise mit hohen Belastungen von Krankheitserregern infiziert ist, oder in den letzten Schritten nach dem Todprozess durch geimpfte Krankheitserreger verursacht. Das hemlymphe Volumen, das nach der dorsalen Sammlung erhalten wird, ist höher als das Volumen, das bei der Sammlung durch das Bein erhalten wird. Trotz der Leichtigkeit der Kontamination ist in der ersten Sammelmethode höher.
Auch bei der Dorsal-Sammlung war die Hämozytenkonzentration deutlich höher. Wenn richtige Hämozyten Sammlung durchgeführt wird, kann ein guter Abstrich erhalten werden und es ist möglich, verschiedene Hämozyten nach der Färbung zu unterscheiden. Dieses Video lieferte Informationen über Methoden zur Impfung von Erregern, insbesondere entomopathogenen Pilzen, in Zecken und sammeln deren Hämolymphe.
Die hier vorgestellten Techniken erfordern sehr geringe technologische Ressourcen in unseren klassischen Schritten für Studien über Zeckenphysiologie, Zeckenpathologie und Zeckenimmunantwort. Die korrekte Ernte der Arthropodenzellen und die zellfreie Hämolympium ist entscheidend, um zuverlässige Informationen für nachfolgende Studien zu ermöglichen. Aus diesem Grund ist es auch wichtig, sich der häufigsten Fehler bewusst zu sein, die bei der Ausführung dieser Techniken beobachtet werden.
Darüber hinaus müssen die Vorschläge dieser Studie den geeigneteren Ort für die Hämolympium-Sammlung durch Verformung oder Schneiden der Beine unter Berücksichtigung des Unterschieds in der erhaltenen Menge und der Wahrscheinlichkeit einer Kontamination bestimmen.
