Wir haben diese Methode erfolgreich eingesetzt, um ein Mausmodell zu erstellen, das besser mit den pathologischen Veränderungen der Gallengangsatresie übereinstimmt. Mit dieser Technik können die Symptome einer akuten und chronischen Gallengangsatresie simuliert werden, was für die zukünftige Erforschung von Krankheitsmechanismen hilfreich ist. Nach dem Einsatz von Antikörpern wurde die Überlebenszeit der Mäuse verlängert und die Symptome gelindert, was auf die therapeutische Wirkung von Antikörpern bei Gallengangsatresie hindeutet.
Nach der Einteilung der neugeborenen Mäuse in verschiedene Gruppen, wie im Manuskript beschrieben, wird jede Maus vier Stunden vor der Rhesus-Rotavirus- oder RRV-Injektion mit einer intraperitonealen Injektion von fünf Mikrogramm Anti-Ly6G-Antikörpern vorbehandelt, um Gr1-positive Zellen zu depletieren. Innerhalb von 24 Stunden nach der Geburt injizieren Sie der neugeborenen Maus intraperitoneal 20 Mikroliter Rhesusrotaviren oder Kochsalzlösung. Verabreichen Sie nach der RRV-Injektion 20 Mikrogramm Anti-Ly6G-Antikörper in den Bauch der Maus.
Überprüfen und notieren Sie täglich das Aussehen, das Gewicht und das Überleben aller Mäuse. Für die intraperitoneale Injektion legen Sie den Bauch der jungen Maus frei, indem Sie die Halshaut mit Zeigefinger und Daumen einer Hand einklemmen und die Hinterbeine der Maus mit Ringfinger und Schwanzfinger sanft halten. Heben Sie die Spritzennadel in einer Neigung nach oben an und führen Sie die Nadel in einem 15-Grad-Winkel zur Haut in den mittleren Oberschenkel des rechten Hinterbeins der Maus ein.
Während Sie die Nadel entlang des subkutanen Pfades bewegen, bis sie den rechten Rippenrand der Maus erreicht, richten Sie die Nadel nach unten in die Bauchhöhle und injizieren Sie die Flüssigkeit unter die Leber der Maus. Ziehen Sie die Nadel sofort nach der Injektion heraus. Achten Sie auf Blutungen oder Undichtigkeiten an der Injektionsstelle.
Nachdem Sie die Maus am 12. Tag betäubt haben, sezieren Sie sie unter einem Mikroskop. Führen Sie eine Ein-Milliliter-Insulinspritze in die linke Herzkammer ein, um Blut zu entnehmen. Zentrifugieren Sie das Blut bei 400 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur und trennen Sie das Serum für Leberfunktionsmessungen.
Präparieren Sie die Leber und Milz der Maus mit einer Schere und Pinzette vom umgebenden Gewebe. Fotografieren Sie das allgemeine Erscheinungsbild der Leber und des Gallengangs. Nach der Inhalationsnarkose die Leber, die Gallenblase und die extrahepatischen Gallengänge mit einer Schere und Wattestäbchen freilegen.
Injizieren Sie unter einem Haltungsmikroskop fünf bis 10 Mikroliter des Fluoreszenzfarbstoffs Rhodamin 123 mit einer Ein-Milliliter-Insulinspritze in die Gallenblase und machen Sie Fotos. Tauchen Sie frisches Lebergewebe der Maus 24 Stunden lang in 10%Formalin. Sobald das Gewebe in Paraffin eingebettet ist, schneiden Sie den Paraffinblock mit einem Paraffinmikrotom in Abschnitte mit einer Dicke von vier Mikrometern und legen Sie zwei aufeinanderfolgende Abschnitte auf denselben Objektträger.
Legen Sie dann die Scheiben in ein Schneidegestell, entwachsen Sie sie in Xylol und hydratisieren Sie sie nacheinander fünf Minuten lang in absolutem Ethanol, 95 % Ethanol, 80 % Ethanol, 70 % Ethanol und destilliertem Wasser. Färben Sie die Abschnitte fünf Minuten lang mit Hämatoxylinlösung und weichen Sie sie fünf Sekunden lang in 1%iger Salzsäure und 75%igem Alkohol ein. Nachdem Sie die Abschnitte mit klarem Wasser abgespült haben, färben Sie sie eine Minute lang mit Eosinlösung.
Bereiten Sie die Gewebeschnitte für die Färbung vor, wie zuvor gezeigt, und führen Sie eine Antigenreparatur mit Tris-EDTA-Puffer durch. Erhitzen Sie die Abschnitte 10 Minuten lang in der Mikrowelle bei 95 Grad Celsius, nehmen Sie sie dann heraus und kühlen Sie sie auf Raumtemperatur ab. Um die endogene Peroxidase zu entfernen, legen Sie die Gewebeschnitte für 10 Minuten in 3%iges Wasserstoffperoxid und behandeln Sie die Scheiben mit 5%igem Ziegenserum, um die unspezifische Bindung zu blockieren.
Als nächstes wird der primäre Anti-Maus-Antikörper Cytokeratin 19 der Ratte oder der monoklonale Anti-Maus-Antikörper F4/80 der Ratte in die Schnitte gegeben und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert. Inkubieren Sie die Schnitte mit geeigneten Sekundärantikörpern für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Verwenden Sie 3,3-Prime-Diaminobenzidin als chromogenes Mittel, um die chromogene Reaktion unter dem Mikroskop zu beobachten.
Betrachten Sie die Schichten unter einem 40-fachen Mikroskop, um Bilder zu erhalten und sie bei Bedarf zu analysieren. Sobald die Gewebeschnitte präpariert und mit Hämatoxylin gegengefärbt sind, bedecken Sie jedes Gewebe eine Stunde lang mit 50 Mikrolitern Sirius-Rot-Farbstofflösung bei Raumtemperatur. Trocknen Sie die Objektträger vier Stunden lang auf natürliche Weise bei Raumtemperatur, geben Sie einen Tropfen neutralen Gummi auf jeden Objektträger und verwenden Sie ein Deckglas, um das Taschentuch abzudecken, um Blasen zu vermeiden.
Lassen Sie die Objektträger 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen, um das neutrale Zahnfleisch zu festigen. Beobachten Sie die Details der Kollagenablagerung mit Hilfe der Polarisationskontrastlichtmikroskopie. Wählen Sie ein klares und geeignetes Sichtfeld und passen Sie die Helligkeit und den Weißabgleich des Gesichtsfelds des Mikroskops an.
Erfassen Sie Bilder und analysieren Sie diese bei Bedarf unter einem 40-fachen Mikroskop. Nach RRV-Injektion betrug die mediane Überlebenszeit in der RRV-Gruppe 13 Tage. Die meisten Mäuse, die mit dem Antikörper behandelt wurden, entwickelten eine leichte Gelbsucht und es wurde kein Gewichtsverlust beobachtet.
Die Lebern von BA-Mäusen zeigten nekrotische Läsionen und ein extrahepatisches Segment der Gallengangsatresie. Die Größe der Leber ist kleiner als die der Kontrollen. Die histologische Analyse zeigte, dass eine niedrig dosierte Anti-Ly6G-Therapie die Pfortaderentzündung verringerte.
In den Leberschnitten wurde auch an Tag 42 noch eine entzündliche Zellansammlung beobachtet. An Tag 12 kam es zu einem leichten Anstieg der Kollagenablagerung in der Pfortaderregion. An Tag 42 war die Kollagenexpression signifikant erhöht, und es wurde eine erhebliche Kollagenablagerung im BA-Gewebe festgestellt.
Die CK19-positiven Zellen wurden an Tag 12 beobachtet. An Tag 42 vermehrten sich CK19-positive Zellen, aber es gab nur wenige reife Gallengänge. Der extrahepatische Gallengang in chronisch BA-Mäusen war blockiert und wies entzündliche Infiltrate von Mikrophagen auf.
Die ALT- und ALP-Spiegel in der Leber waren in der chronischen BA-Gruppe höher als in der normalen Kontrollgruppe. Der Gesamtbilirubinspiegel, das direkte Bilirubin und das indirekte Bilirubin waren erhöht, was darauf hindeutet, dass die Leberfunktion im Stadium der chronischen Fibrose der BA signifikant reduziert war. Die Injektion sollte mit Vorsicht erfolgen, um die Mäuseleber nicht zu durchstechen. Nach der Injektion sollten wir uns etwa 10 Sekunden Zeit nehmen, um den Zustand der Maus zu beobachten und das Blut aus der Wunde zu entfernen.
