Diese Studie wurde durch das US Department of Veterans Affairs (Washington DC), Zuschüsse 0852048, 0731201, 0854430 und von der National Science Foundation (Arlington, VA), und Grant RO1 DK080897 von den National Institutes of Health (Bethesda, MD) unterstützt . Herr Khanna erhielt Unterstützung von einer großzügigen Spende von Herrn Edward Ross und Dr. Monica Moya von der Bill &amp; Melinda Gates Foundation (Seattle, WA).

Das Protokoll beschreibt hier ein dreistufiges Verfahren zur Erzeugung von vielschichtigen Alginat-Mikrokugeln (Abbildung 1). Zunächst werden Alginat-Mikrokugeln gebildet (Abbildung 2A). Dieses Verfahren wird in Abschnitt 1 beschrieben. Zellen oder Proteine ​​können die Mikrokügelchen in diesem Schritt zugegeben werden, um als ein Abgabesystem zu handeln. Der nächste Schritt beinhaltet die Bildung einer Schicht auf den permselektive Mikroperlen und wird in Abschnitt 2 beschrieben. Der letzte Schritt beinhaltet die Bildung einer zusätzlichen Schicht Alginat und wird in Kapitel 3 beschrieben. Diese Schicht bildet sich auf der Außenseite der Oberfläche der Kügelchen (2B) kann zum Kapseln und liefern therapeutische Moleküle (2C), um zelluläre Reaktion auf das System nach der Transplantation zu leiten. 1. Alginat Nichtmetallisches Vorbereitung <ol><li> Vorbereiten einer 1,5% (w / v) LVM Alginatlösung durch Auflösen von 15 g LVM Alginat in 1 mlInnenschicht Alginat-Lösung (25 mM HEPES-Puffer, 118 mM NaCl, 5,6 mM KCl und 2,5 mM MgCl 2 in DI-Wasser, eingestellt auf pH 7,4). Mischen Sie auf einem Vortexer, bis das Alginat Macht vollständig aufgelöst hat, um eine klare, viskose Lösung zu bilden. Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt Bedingungen optimal für Insel-Kapselung innerhalb Alginat-Mikrokapseln 1 Die Konzentration und Zusammensetzung der Alginat-Mikrokugeln verändert werden, um Eigenschaften für andere Anwendungen (z. B. Drug Delivery, Tissue Engineering, etc.) Hinweis abzustimmen. Für Inselchen Kapselung die Inseln Sie können der Alginatlösung in diesem Schritt vor dem Laden in der microencapsulator zugesetzt werden. </li><li> Bereiten Sie die Vernetzungslösung (22 mM CaCl 2 in DI-Wasser) durch Lösen von 100 mM CaCl 2 und 10 mM HEPES-Puffer in DI-Wasser und Einstellen auf pH 7,4. Hinweis: andere zweiwertige Kationen, wie Br 2 +, Sr 2 + usw. können anstelle von Ca 2 +, je nach Art von Alginat Gelierung d verwendet werdenesired. </li><li> Richten Sie die Zwei-Kanal-Luftmantel Alginat microencapsulator durch Zugabe einer 25-Gauge-Nadel mit einer Spritze, und passen Sie die Ventile auf jeder Seite um sicherzustellen, dass die Nadel in der Mitte des Luft-Jacke. Kanülen unterschiedlicher Größe kann für diesen Schritt verwendet werden, abhängig von der Größe der Alginat-Mikrokugeln ausgerichtet. Dieser Schritt kann mit einer Spritze durchgeführt werden, sollte ein microencapsulator nicht zur Verfügung. Fügen Sie die Alginat-Lösung mit der Spritze, und wählen Sie einen Nadelabstand von der Größe der gewünschten Mikroperlen basiert. </li><li> Stellen Sie ein Kolben, der 10 ml Vernetzungslösung direkt unterhalb der Nadel. Legen Sie einen Rührstab in der Lösung. </li><li> Spritzen Tröpfchen direkt in die CaCl 2-Lösung, um das Alginat zu vernetzen, um Mikrokügelchen zu bilden. Inkubieren der Kügelchen in der Vernetzungslösung zu mindestens fünfzehn Minuten härten, unter kontinuierlichem Rühren. </li><li> Übertragen der Perlen zu einer 15 ml-Zentrifugenröhrchen. Entfernen Sie die restliche Lösung,und führen Sie drei Waschungen mit einer 0,2% igen CaCl 2 in physiologischer Kochsalzlösung für zwei Minuten. </li></ol> 2. Die Beschichtung der Mikrokügelchen mit Poly-L-Ornithin <ol><li> Planen 3 ml einer 0,1% (w / v) Lösung von Poly-L-Ornithin (PLO) in normaler Kochsalzlösung. Legen Sie die Lösung auf einem Vortex, bis es vollständig gelöst ist, bildet eine klare Lösung. Poly-L-Lysin (PLL) kann anstelle der PLO für diesen Schritt, der in ähnlichen Niveaus von Permselektivität Ergebnissen verwendet werden. </li><li> Übertragen Sie die Alginat-Mikrokugeln in die PLO-Lösung. Platz auf einem Vortex für 30 Minuten, damit sich die PLO genügend Zeit, um mit dem Alginat interagieren und bilden eine Polykation-Polyanion-Komplex. Am Ende der 30 Minuten, sollte es eine deutlich sichtbare weiße Beschichtung um die Alginat-Mikrokugeln sein. </li><li> Entfernen Sie die PLO-Lösung, und führen Sie drei Waschungen mit 0,2% CaCl 2 in normaler Kochsalzlösung für zwei Minuten. </li></ol> 3. Erstellen der Outer Alginat LayER <ol><li> Planen einer Alginatlösung einer gewünschten Konzentration, die verwendet werden, um die äußere Schicht zu erzeugen ist. Die Lösung wird hergestellt, wie in (1.1) beschrieben. Die Größe der äußeren Schicht wird durch die Zusammensetzung und Konzentration von Alginat verwendet (3) beeinflusst. </li><li> Übertragen der Alginat-Mikrokugeln auf eine Zelle-Sieb. Mit einem Kimwipe um überschüssige Lösung zu absorbieren, um die Mikroperlen so weit wie möglich zu trocknen. </li><li> Übertragen Sie die Mikrokugeln zu einem Parafilm Oberfläche. Andere glatten Oberflächen wie Glas oder einer Kunststoff-Petrischale für Parafilm substituiert sein kann, falls gewünscht. </li><li> Übertragen Sie die Alginat-Lösung in (3,1) auf die Alginat-Mikrokugeln vorbereitet. Das Volumen der Alginat-Lösung werden sollte vollständig abdecken Alginat-Mikrokugeln. Wir bleiben die Mikrokügelchen in der Alginat-Lösung für 45 Minuten. </li><li> Mit einer Pipette, um die überschüssige Alginat-Lösung nicht auf die Mikroperlen gebunden zu entfernen. </li><li> Übertragen Sie die Mikrokügelchen inZu einer Lösung von 22 mm CaCl 2. Diese vernetzt das Alginat-Lösung in der Umgebung der Mikrokügelchen, was zur Bildung der verschiedenen äußeren Schicht Alginat. </li><li> Führen Sie drei Wäschen mit 22 mM CaCl 2 in normaler Kochsalzlösung für zwei Minuten. Anzeigen der Mikrokügelchen unter einem Mikroskop sollte für eine bestimmte äußere Alginat zu bildende Schicht um den Kern Mikrokügelchen gesehen werden können. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/3388/3388fig1.jpg" alt="1" /> 1. Eine schematische Darstellung des Verfahrens zum Erstellen mehrschichtigen Alginat-Mikrokugeln. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung von Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95 (2), 632-40 (2010). <img src="/files/ftp_upload/3388/3388fig2.jpg" alt="2" /> 2. (A) und (B) Phasenkontrastaufnahmen der Alginat-Mikrokugeln. (A) zeigt eine Mikroperlenach der Synthese der Schritt (1.7), während (B) zeigt eine deutliche äußeren Alginatschicht vorliegenden nach Beendigung des Schrittes (3,7). (C) ein FITC Bild von fluoreszenzmarkierten BSA-Protein in der äußeren Schicht eingekapselt. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung von Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95 (2), 632-40 (2010). <img src="/files/ftp_upload/3388/3388fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> 3. Die Größe des äußeren Alginat-Schicht kann bezogen auf die Zusammensetzung und Konzentration von Alginat variiert werden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass für LVM und LVG Alginat, die äußere Schicht Größe zunehmen Alginatkonzentration, und daß LVG Alginat dickeren äußeren Schichten liefert als LVM Alginat bei gleichen Konzentrationen. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung von Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95 (2), 632-40 (2010). <img src="/files/ftp_upload/3388/3388fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/&gt; 4. Freigabe von FGF-1, einem angiogenen Wachstumsfaktor-Proteins, von der äußeren Schicht variiert Alginat bezogen auf die Konzentration der LVM und LVG Alginat verwendet. (A) und (B) zeigen prozentuale Freisetzung, und (C) und (D) bezeichnen die entsprechende Masse Freisetzung von FGF-1 gegen die Zeit für verschiedene äußere Schicht Formulierungen. Es gibt eine Burst-Release für alle Bedingungen innerhalb der ersten 5 h (A und C) ausgestellt, und niedrig dosierte kontinuierliche Freisetzung für bis zu 30 Tage (B und D). Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung von Khanna et al. J Biomed Mater Res A. November;. 95 (2), 632-40 (2010) <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3388/3388fig4large.jpg" target="_blank">Hier klicken, um größere Abbildung anzuzeigen</a> .

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	<li>Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+Poly-L-+Ornithine-coated+alginate+microcapsules.">Characteristics of Poly-L- Ornithine-coated alginate microcapsules.</a> Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).</li><li>Yamagiwa, K., Kozawa, T., Ohkawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+alginate+composition+and+gelling+conditions+on+diffusional+and+mechanical+properties+of+calcium-alginate+gel+beads.">Effects of alginate composition and gelling conditions on diffusional and mechanical properties of calcium-alginate gel beads.</a> J. Chem. Eng. Jpn. 28, 462-467 (1995).</li><li>Amsden, B., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+characteristics+of+calcium+alginate+gels.">Diffusion characteristics of calcium alginate gels.</a> Biotechnol. Bioeng. 65, 605-610 (1999).</li><li>Uriel, S., Brey, E. M., Greisler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+low+levels+of+fibroblast+growth+factor-1+promote+persistent+microvascular+network+formation.">Sustained low levels of fibroblast growth factor-1 promote persistent microvascular network formation.</a> Am. J. Surg. 192, 604-609 (2006).</li><li>Moya, M. L., Lucas, S., Francis-Sedlak, M., Liu, X., Garfinkel, M. R., Huang, J. J., Cheng, M. H., Opara, E. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+delivery+of+FGF-1+increases+vascular+density+in+comparison+to+bolus+administration.">Sustained delivery of FGF-1 increases vascular density in comparison to bolus administration.</a> Microvasc. Res. 78, 142-147 (2009).</li><li>Moya, M. L., Cheng, M. H., Huang, J. J., Francis-Sedlak, M. E., Kao, S. W., Opara, E. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+FGF-1+loaded+alginate+microbeads+on+neovascularization+and+adipogenesis+in+a+vascular+pedicle+model+of+adipose+tissue+engineering.">The effect of FGF-1 loaded alginate microbeads on neovascularization and adipogenesis in a vascular pedicle model of adipose tissue engineering.</a> Biomaterials. 31, 2816-2826 (2010).</li><li>Khanna, O., Moya, M. L., Greisler, H. P., Opara, E. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayered+Microcapsules+for+the+Sustained-Release+of+Angiogenic+Proteins+From+Encapsulated+Cells.">Multilayered Microcapsules for the Sustained-Release of Angiogenic Proteins From Encapsulated Cells.</a> Am. J. Surg. 200, 655-658 (2010).</li><li>Khanna, O., Moya, M. L., Opara, E. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+multilayered+alginate+microcapsules+for+the+sustained-release+of+fibroblast+growth+factor-1.">Synthesis of multilayered alginate microcapsules for the sustained-release of fibroblast growth factor-1.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 95, 632-640 (2010).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Alginat ist ein natürliches, saures Polysaccharid aus Algen extrahiert und aus Einheiten von 1,4 &#39;-β-D-Mannuronsäure (M) und α-L-Guluronsäure (G) 2,3 besteht. Einfache Gelierung auftritt, wenn zweiwertigen Kationen, wie Ca 2 +, Sr 2 + oder Ba 2 + interagieren mit G-Monomeren unter Bildung ionischer Brücken zwischen benachbarten Alginatketten. Mikrokugeln aus Alginat verwendet worden, um eine Vielzahl von Proteinen, einschließlich Fibroblasten-Wachstumsfaktor-1 (FGF-...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Pronova Ultrapure LVG Alginat </td><td> Nova-Matrix </td><td> 4200006 </td><td> Eine Vielzahl von Alginat Formulierungen zur Verfügung. Die Wahl von Alginat beeinflusst die Eigenschaften der End-Mikroperlen, einschließlich Größe, mechanische Eigenschaften, und Transport. Zusammensetzung verwendet werden für eine gegebene Anwendung optimiert werden. </td></tr><tr><td> Pronova Ultrapure LVM Alginat </td><td> Nova-Matrix </td><td> 4200206 </td><td> Eine Vielzahl von Alginat Formulierungen zur Verfügung. Die Wahl von Alginat beeinflusst die Eigenschaften der End-Mikroperlen, einschließlich Größe, mechanische Eigenschaften, und Transport. Zusammensetzung verwendet werden für eine gegebene Anwendung optimiert werden. </td></tr><tr><td> Poly-L-Ornithin-hydrochlorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2533 </td><td></td></tr></tbody></table>

generation of alginate microspheres for biomedical applications

Alginat-Basis-Werkstoffe haben beträchtliche Aufmerksamkeit für biomedizinische Anwendungen aufgrund ihrer hydrophilen Natur, Biokompatibilität und physikalischen Architektur erhalten hat. Zu den Anwendungen gehören der Verkapselung von Zellen, Drug-Delivery-, Stammzellen-Kultur, und Tissue Engineering Scaffolds. In der Tat sind derzeit klinische Studien durchgeführt, in dem Inselchen in PLO beschichteten Alginat-Mikrokugeln werden als eine Behandlung von Typ-I-Diabetes eingeschlossen. Allerdings sind eine große Anzahl von kleinen Inseln auf Wirksamkeit aufgrund der schlechten Überleben nach der Transplantation erforderlich. Die Fähigkeit, lokal anregen mikrovaskulären Netzwerk Formation um den verkapselten Zellen können ihre Lebensfähigkeit durch verbesserte Transport von Sauerstoff, Glukose und anderen lebenswichtigen Nährstoffen zu erhöhen. Fibroblasten-Wachstumsfaktor-1 (FGF-1) ist ein natürlich vorkommendes Wachstumsfaktor, der in der Lage, die Bildung von Blutgefäßen fördern und zu verbessern Sauerstoffgehalt im ischämischen Gewebe ist. Die Wirksamkeit von FGF-1 wird verbessert, wenn es in einem sust geliefert wirdained Weise statt eines einzelnen großen Bolus-Verabreichung. Der lokale langfristige Freisetzung von Wachstumsfaktoren aus Inselchen Verkapselung Systeme könnten das Wachstum von Blutgefäßen stimulieren direkt gegenüber den transplantierten Zellen, die möglicherweise die Verbesserung der funktionellen Ergebnisse Transplantat. In diesem Artikel beschreiben wir Verfahren zur Herstellung von Alginat-Mikrokugeln für den Einsatz in biomedizinischen Anwendungen. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode, die wir zur Erzeugung von vielschichtigen Alginat-Mikrokugeln entwickelt. Die Zellen können in der inneren Alginat Kern und angiogenen Proteine ​​in der äußeren Schicht Alginat verkapselt werden. Die Freisetzung von Proteinen aus dieser äußeren Schicht würde die Bildung von lokalen Netzwerken mikrovaskulären direkt stimulieren gegenüber den transplantierten Inseln.

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Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

In den folgenden Abschnitten beschreiben wir Verfahren zur Herstellung von Alginat-Mikrokugeln für den Einsatz in biomedizinischen Anwendungen. Wir illustrieren speziell eine Technik zur Erstellung mehrschichtiger Alginat-Mikrokugeln für den doppelten Zweck der Zell-und Protein-Kapselung als potenzielle Therapie für Typ 1 Diabetes.

Erzeugung von Alginat-Mikrokugeln für biomedizinische Anwendungen

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

20.6K Aufrufe.  Illinois Institute of Technology. In den folgenden Abschnitten beschreiben wir Verfahren zur Herstellung von Alginat-Mikrokugeln für den Einsatz in biomedizinischen Anwendungen. Wir illustrieren speziell eine Technik zur Erstellung mehrschichtiger Alginat-Mikrokugeln für den doppelten Zweck der Zell-und Protein-Kapselung als potenzielle Therapie für Typ 1 Diabetes.

Serie: Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Generation of Comprehensive Thoracic Oncology Database - Tool for Translational Research

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer specimens and clinical data to be available to researchers within the Thoracic Oncology Research Program. This database also captures a large volume of genomic and proteomic data obtained from various tumor tissue studies. A team of clinical and basic science researchers, a biostatistician, and a bioinformatics expert was convened to design the database. Variables of interest were clearly defined and their descriptions were written within a standard operating manual to ensure consistency of data annotation. Using a protocol for prospective tissue banking and another protocol for retrospective banking, tumor and normal tissue samples from patients consented to these protocols were collected. Clinical information such as demographics, cancer characterization, and treatment plans for these patients were abstracted and entered into an Access database. Proteomic and genomic data have been included in the database and have been linked to clinical information for patients described within the database. The data from each table were linked using the relationships function in Microsoft Access to allow the database manager to connect clinical and laboratory information during a query. The queried data can then be exported for statistical analysis and hypothesis generation.

A thoracic oncology database was developed to serve as a comprehensive repository for clinical and laboratory data for the purposes of translational research. The database will serve translational cancer researchers within the Thoracic Oncology Research Program. This database is adaptable to other cancer models, as well as other human diseases.

Generation umfassender Thoracic Oncology Database - Tool für Translational Research

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer ...

Forschung

Medizin

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Halbautomatische Anpassung der Umlauftumorzellen (CTC)-Assays für die klinische und vorklinische Forschungsanwendungen

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.

DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

Sammlung und Extraktion von DNA-Speichel für Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolation, Kryokonservierung und Kultur der Menschen Amnion Epithelzellen für Klinische Anwendungen

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present here a protocol for elevating intraocular pressure (IOP) in the rat, by injecting magnetic microspheres into the anterior chamber of the eye. The use of magnetic particles allows the user to manipulate the beads into the iridocorneal angle, thus providing a very effective blockade of fluid outflow from the trabecular meshwork. This leads to long-lasting IOP rises, and eventually neuronal death in the ganglion cell layer (GCL) as well as optic nerve pathology, as seen in patients with the disease. This method is simple to perform, as it does not require machinery, specialist surgical skills, or many hours of practice to perfect. Furthermore, the pressure elevations are very robust, and reinjection of the magnetic microspheres is not usually required unlike in some other models using plastic beads. Additionally, we believe this method is suitable for adaptation for the mouse eye.

We present a method for inducing elevated intraocular pressure (IOP), by injecting magnetic microspheres into the rat eye, to model glaucoma. This leads to strong pressure rises, and extensive neuronal death. This protocol is easy to perform, does not require repeat injections, and produces stable long-lasting IOP rises.

Experimentelle Glaukom von Ocular Injektion von magnetischen Mikrokügelchen Induzierte

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Dreidimensionale Alginat-Perle Kultur der Menschen Hypophysenadenom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Die Erzeugung von Microtumors Mit 3D Human Biogel Kultursystem und Patienten stammGlioblastomZellen für Kinomic Profilieren and Drug Response-Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Generation of Organ-conditioned Media and Applications for Studying Organ-specific Influences on Breast Cancer Metastatic Behavior

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused on identifying factors inherent to breast cancer cells that are responsible for this observed metastatic pattern (termed organ tropism), however much less is known about factors present within specific organs that contribute to this process. This is in part because of a lack of in vitro model systems that accurately recapitulate the organ microenvironment. To address this, an ex vivo model system has been established that allows for the study of soluble factors present within different organ microenvironments. This model consists of generating conditioned media from organs (lymph node, bone, lung, and brain) isolated from normal athymic nude mice. The model system has been validated by demonstrating that different breast cancer cell lines display cell-line specific and organ-specific malignant behavior in response to organ-conditioned media that corresponds to their in vivo metastatic potential. This model system can be used to identify and evaluate specific organ-derived soluble factors that may play a role in the metastatic behavior of breast and other types of cancer cells, including influences on growth, migration, stem-like behavior, and gene expression, as well as the identification of potential new therapeutic targets for cancer. This is the first ex vivo model system that can be used to study organ-specific metastatic behavior in detail and evaluate the role of specific organ-derived soluble factors in driving the process of cancer metastasis.

This manuscript describes an ex vivo model system comprised of organ-conditioned media derived from the lymph node, bone, lung, and brain of mice. This model system can be used to identify and study organ-derived soluble factors and their effects on the organ tropism and metastatic behavior of cancer cells.

Die Erzeugung von Orgelanlage Medien und Anwendungen für das Studium Organspezifische Einflüsse auf Brustkrebs Metastasiertem Verhalten

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused ...

Drug Repurposing Hypothesis Generation Using the "RE:fine Drugs" System

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The goal of computational methods for drug repurposing is to enable solutions for safer, cheaper and faster drug discovery. Towards this end, we developed a novel method that integrates genetic and clinical phenotype data from large-scale GWAS and PheWAS studies with detailed drug information on the concept of transitive Drug-Gene-Disease triads. We created "RE:fine Drugs," a freely available, interactive dashboard that automates gene, disease and drug-based searches to identify drug repurposing candidates. This web-based tool supports a user-friendly interface that includes an array of advanced search and export options. Results can be prioritized in a variety of ways, including but not limited to, biomedical literature support, strength and statistical significance of GWAS and/or PheWAS associations, disease indications and molecular drug targets. Here we provide a protocol that illustrates the functionalities available in the "RE:fine Drugs" system and explores the different advanced options through a case study.

Drug Repurposing Hypothesis Generation Using the &quot;RE:fine Drugs&quot; System

Here we describe a protocol using the web-based drug repurposing hypothesis generation tool: "RE:fine Drugs." This protocol can be modified to a user's preferences at the level of the query type (gene, drug or disease) and/or the range of available advanced options.

Drug Repurposing Hypothesengenerierung Mit der &quot;RE: Fein Drugs&quot; System

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

Probenahmestrategien und Verarbeitung der Biobank Gewebeproben von porcinen biomedizinische Modelle

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...