In diesem Protokoll demonstrieren wir ein effektives Verfahren zur Herstellung von PLGA-basierten hochoffenporigen Mikrosphären, die mehrere Vorteile wie den Komfort der Verpackung von Zellen, verbesserte Zellretention und minimale Invasivität bieten. Die resultierenden monodispersen PLGA-basierten hochporösen Mikrokugeln besaßen Partikelgrößen von etwa 400 Mikrometern und offene Poren von etwa 50 Mikrometern mit miteinander verbundenen Fenstern für eine verbesserte Zellretentionswirksamkeit. Diese minimalinvasiven Mikroträger können eine Plattform eines komplizierten 3D-Tumormodells für das Arzneimittelscreening und einfache Werkzeuge zum Aufbau von zellbeladenem Mikrogewebe für die Geweberegeneration unterstützen.
Dieser Ansatz ist recht einfach, da das mikrofluidische Gerät aus Polyvinylchloridrohren, einer Glaskapillare und einer Nadel zusammengesetzt werden kann. Das Verfahren wird von Sheng-Chang Luo, einem Doktoranden im Labor, demonstriert. Beginnen Sie mit dem Bau eines mikrofluidischen Co-Flow-Generators mit einer Glaskapillare, Polyvinylchloridrohren und einer 26-Gauge-Dosiernadel.
Verbinden Sie dann die Glaskapillare mit dem Ende des Polyvinylchloridrohrs und durchstechen Sie die Verbindung zwischen den beiden mit einer Nadel. Für die Tröpfchenerzeugung legen Sie das andere Ende des Polyvinylchloridrohrs in die kontinuierliche Phase und härten mit dem UV-Kleber aus, um die Lücken an der Verbindung abzudichten. Nehmen Sie nun eine 50-Milliliter-Spritze, um die kontinuierliche Phase zu laden, und eine Fünf-Milliliter-Spritze für die Emulsionsbildung.
Stellen Sie dann die Durchflussraten der kontinuierlichen Phase auf zwei Milliliter pro Minute und die Dispergierphasen auf 0,08 Milliliter pro Minute ein. Stellen Sie ein 500-Milliliter-Becherglas in ein Eisbad und füllen Sie es mit einer vorgekühlten wässrigen Polyvinylalkohollösung. Um die Emulsion herzustellen, dekantieren Sie sofort die wässrige Gelatinelösung in die DCM-Lösung von PLGA und emulgieren Sie mit dem Ultraschallgerät.
Stellen Sie dann die Ultraschallleistung auf 400 Watt und die Gesamtverarbeitungszeit auf 90 Sekunden ein und ändern Sie ständig die Position der Sonde manuell. Stabilisieren Sie die resultierende Emulsion für Spritzenabsaugung und Tröpfchenerzeugung in ca. 20 Minuten. Nach der Ultraschallbehandlung die vorbereitete Emulsion schnell in die Fünf-Milliliter-Spritze in der mikrofluidischen Plattform laden und die instabile Wasserölemulsion als diskontinuierliche Phase in die mikrofluidische Vorrichtung einführen.
Gleichzeitig wird die wässrige Lösung von Polyvinylalkohol als kontinuierliche Phase verwendet. Nachdem Sie die richtigen Teile der Emulsion in die mikrofluidische Vorrichtung injiziert haben, sammeln Sie die Mikrokugel mit der Emulsion am Boden des Auffangbechers und legen Sie die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius zur weiteren Stabilisierung. Normalisieren Sie die gelagerten Mikrokugeln auf Raumtemperatur und eliminieren Sie das restliche DCM durch Rühren mit einem Glasstab für eine Stunde bei 60 U/min.
Anschließend wird die Sammelphase vorsichtig in einem 500-Milliliter-Becherglas dekantiert und der restliche Polyvinylalkohol dreimal mit entionisiertem Wasser von der Oberfläche poröser Mikrokugeln abgewaschen. Lösen Sie die im PLGA-Rückgrat eingewickelte Gelatine auf, indem Sie die PLGA-Mikrokugeln 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in das Wasserbad legen. Dann entfernen Sie die Restgelatine, indem Sie die resultierenden Mikrokugeln zweimal mit dem entionisierten Wasser spülen, und kühlen Sie sie für die Lyophilisation bei minus 80 Grad Celsius für 24 Stunden vor.
Die PLGA-basierten hochoffenen porösen Mikrosphären zeigten Größen von 350 bis 500 Mikrometern mit einer beliebig großen Pore von 10 bis 100 Mikrometern und miteinander verbundene Fenster, die eine hohe Effizienz beim Transport von Sauerstoffstoffwechselabfällen ermöglichen könnten. Die mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks, die in den PLGA-basierten hochporösen Mikrosphären kultiviert wurden, hafteten an einem Tag an den Gerüsten und repräsentierten umfangreiche Adhäsions- und Migrationsfähigkeiten der Zellen. Die Calcium-AM- und Propidiumiodid-Färbung zeigte, dass die Zellen lebend und gleichmäßig verteilt sind.
Es ist wichtig, die Ultraschallleistung und die Position der Sonde einzustellen. Die reproduzierbare Herstellung von PLGA-basierten hochoffenporigen Mikrokugeln wird den Weg für die Erstellung von Standardgraphen ebnen, um Regeneration oder Drogenscreening zu induzieren.
