Wir danken Andrea Moran zusammen mit Mitgliedern der Lab Tier-Service Facility (LaSF) bei Stowers Institute für ihre hervorragende Unterstützung bei der Tierhaltung und technische Dienstleistungen. Diese Arbeit wird durch Mittel aus Stowers Institute und die NIH (NIDCD 008003) zu CRY unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Institute on Taubheit und andere Kommunikationsstörungen oder die National Institutes of Health. US patent pending für die tetO-G-camp2 Mäuse für Stowers Institute, CRY und LM.

1. Zubereitung der Lösung <ol><li> Bereiten 10X R1, R2 10X und 10X R3 Lösungen entsprechend der Tabelle. R1 <table border="1"><tbody><tr><td> Chemicals </td><td> MW (g / mol) </td><td> mm (1x) </td><td> 10fach (g / L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,44 </td><td> 125 </td><td> 73,05 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,55 </td><td> 2,5 </td><td> 1,86 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M lieferbar </td><td> 1 </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> 147,02 </td><td> 2 </td><td> 2,94 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 · H 2 O </td><td> 137,99 </td><td> 1,25 </td><td> 1,72 </td></tr></tbody></table> R2 <table border="1"><tbody><tr><td> Chemikalie </td><td> MW (g / mol) </td><td> mm (1x) </td><td> 10fach (g / L) </td&gt; </tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84,01 </td><td> 25 </td><td> 21 </td></tr></tbody></table> R3 <table border="1"><tbody><tr><td> Chemicals </td><td> MW (g / mol) </td><td> mm (1x) </td><td> 10fach (g / L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,44 </td><td> 125 </td><td> 73,05 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,55 </td><td> 2,5 </td><td> 1,86 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M lieferbar </td><td> 2 </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> 147,02 </td><td> 2 </td><td> 2,94 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1 M lieferbar </td><td> 5 </td><td> 50 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Machen Sie 1 Liter Maus künstliche Cerebrospinalflüssigkeit (MACSF) am Tag des Experiments durch Mischen von 100 ml 10X R1 und 100 ml 10X R2 in doppelt destilliertem Wasser (DDW) und Ad-d 1,8 g Dextrose (final 10 mM). Diese Herstellungsmethode verhindert Calciumcarbonat Niederschläge bei hohen pH-Wert. Die Osmolarität MACSF ist etwa 310-315 mOsm / L. Passen Sie die Osmolarität mit Dextrose oder Wasser, wenn nötig. Aerate die Lösung mit Carboxygen Gas (95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid) für mindestens 30 Minuten vor der pH-Wert der Lösung auf 7,2-7,4. </li><li> Machen Sie 1 Liter Ringer-Lösung auf den Tag des Experiments durch Mischen von 100 ml 10X R2 und 100 ml 10X R3 in DDW und fügen 1,8 g Dextrose (10 mM). Die Osmolarität und pH-Wert von Ringer-Lösung sollte so ähnlich wie die des MACSF. Aerate die Lösung mit Carboxygen Gas. </li><li> Bereiten Sie 4% niedrig schmelzender Agarose (LMA) in entweder MACSF oder Ringer-Lösung. Aliquot der geschmolzenen Agarose in Eppendorf-Röhrchen und lagern bei 4 ° C bis verwenden. LMA, die von gereinigtem Polysaccharid besteht, bleibt flüssig bei 37 ° C und erstarrt schnell bei Temperaturen unter 25 ° C. Diese Eigenschaften machen es ideal für die Einbettung von VNO und lebendem Gewebe Physiologie. Andere unreine Materialien, wie Agar, sollte nicht die erste Wahl für lebendes Gewebe Experiment als charakterisierte Komponenten können mit neuronalen Reaktion stören. </li><li> Bereiten Pheromon Reize in Ringerlösung. Für Maus Urin, geben 1:100 Verdünnung entstehen robuste Antworten. </li></ol> 2. Vorbereitung der VNO Scheibe <ol><li> Bevor das Tier zu opfern, legte zwei Röhren von LMA auf einem Heizblock und die Temperatur auf&gt; 60 ° C, um die Agarose zu schmelzen. Sobald das Gel verflüssigt, übertragen Sie die Rohre zu einem 37 ° C Hitze zu blockieren. </li><li> Enthaupten einen G-camp2 Maus folgende CO 2 Euthanasie. Schneiden Sie den Unterkiefer Knochen mit einer Schere, um den Unterkiefer zu entfernen. Ziehen Sie die ridged oberen Gaumen Gewebe zu entlarven die Nasenhöhle (Abbildung 1A). Trennen Sie die Kieferknochen durch das Einfügen eines Skalpells zwischen den beiden vorderen Schneidezähne. Entfernen Sie vorsichtig die Kieferknochen zu VNO aussetzen. An dieser Stelle kann die gesamte VNO aus dem n angehoben werdenasal Hohlraum, indem auf dem Steißbein (Abbildung 1B). Übertragen Sie die VNO zu kalt Sauerstoff MACSF Lösung sofort. </li><li> Unter Dissektion Umfang, trennen die beiden VNOs mit der Spitze # 5 Pinzette vorsichtig entlang der Wand des Septum Knochen (Abbildung 1C) schieben. Lösen Sie den Vomers, dass die VNO Gewebe ummantelt. Heben Sie den gesamten VNO Gewebe aus der Knochenhöhle. Extreme Vorsicht ist bei diesem Schritt werden nicht auf die Neuroepithel Schäden. Kleine Knochenfragmente auf der Gewebeoberfläche links muss vollständig vor dem Einbetten entfernt werden. Fragments auf das Gewebe nach links durch das Schneidmesser gefangen werden, um das Gewebe zu ziehen aus dem Agarose-Block. </li><li> Verwenden Sie die Pinzette, um das hintere Ende des VNO Gewebe und sanft tauchen Sie es in das geschmolzene Agarose (Abbildung 1D) zu halten. Rasche Abkühlung der Röhrchen auf Eis, um die Agarose zu festigen. Die Einbettung und Kühlung sollte weniger als 2 Minuten. </li><li> VF300 Gewebe Allesschneider (Precisionary Instruments, Greenville, NC) wird verwendet, um Abschnitte zu machen. Schneiden Sie die Agarose Block mit dem VNO in Form und kleben Sie es auf das Gewebe Halter (Abb. 1E und F). Legen Sie die Papierrollenhalter in den Metallzylinder und füllen die restlichen Raum mit zusätzlichen LMA. Sobald die LMA erstarrt auf dem Eis, um sofort Schneiden fortzufahren. Versorgung kalte Sauerstoff MACSF in die Schnitte Kammer und fang an zu schneiden bei 180-200 mu m Dicke pro Scheibe. Passen Sie die Vorschubgeschwindigkeit und Schwingungsfrequenz, so dass das Gewebe nicht während des Schneidens und VNO fällt nicht aus dem Agarose komprimiert. Sammeln Sie und übertragen Sie die geschnittenen Scheiben zu MACSF Inkubationskammer (Abbildung 2A). Die Scheiben sind für 6-8 Stunden in Sauerstoff MACSF bei Raumtemperatur lebensfähig. 2B und C zeigen, DIC und 2-Photonen-Bilder von einem G-camp2 VNO Scheibe bzw.. </li></ol> 3. Imaging Kammer eingerichtet <ol><li> Legen Sie die VNO Scheibe in der Mitte der PerfusionKammer (Siskiyou, Grants Pass, OR) und halten Sie die Scheibe nach unten mit einer Scheibe Anker (Warner Instruments, Hamden, CT) (Abbildung 3A). Die Gewinde der Anker sollte nur gegen die LMA Teil der Scheibe, nicht aber die VNO Gewebe drücken. Oxygeniertes MACSF ist es, die Perfusionskammer durch die Einlassöffnung bei ~ 100 ul / sec geliefert und die Flüssigkeit wird durch eine Saug-Nadel über die Auslaßöffnung abgelassen werden, um einen kontinuierlichen Fluss von frischen MACSF (Abbildung 3A und B) sind. </li><li> Füllen Sie eine 30 ml Spritze mit Ringer-Lösung und klemmen Sie die Spritzenpumpe (New Era Pump Systems, Farmingdale, NY). Stellen Sie die Drehzahl der Pumpe auf 300-600 ml / min zu einem kontinuierlichen Fluss von Ringer-Lösung über die Scheibe (Abbildung 3C) bieten. </li><li> Verbinden Sie den Ausgang der Ringer zu einem HPLC Injektionsschleife (Chromtech, Apple Valley, MN) (Abbildung 3D). Verschiedene Schleife Größe kann für eine präzise Steuerung des Volumens der Auslieferung ausgewählt werden. Wir verwenden ein 20 ul-Schleife in our Experimente. Die Injektion Steuerung verfügt über zwei Strecken fließen (Abbildung 3E). An der &quot;load&quot;-Position, können die Proben in die Probenschleife mit einer Hamilton Präzisionsspritze geladen werden. Überschüssige Probe verlässt die Probenschleife durch Schmutzablass. Ringer-Lösung durch die Spritzenpumpe injiziert umgeht die Probenschleife und geht direkt an die Steckdose, die auf die Perfusion Spitze (Abbildung 3A und E) angeschlossen ist. Bei &quot;injection&quot;-Position, fließt der Pumpe Lösung durch die Probenschleife und drücken Sie die Reize in die Steckdose (Abbildung 3E). Vor der Imaging Experiment sollte Luftblasen verjagt werden, um den reibungslosen Ablauf der Perfusionsflüssigkeit gewährleisten. Andere kommerzielle oder custom made-Einspritzsystemen kann auch für Impulse Lieferung umgesetzt werden. </li><li> Passen Sie die Perfusion Spitze unter einem 5x oder 10x Objektiv, so dass die Spitze etwa 1 mm entfernt von der VNO in Scheiben schneiden. </li><li> Wenn eine neue Perfusion System-Setup, ist es ratsam, die Probe Verzögerungszeit und dur messenarbeit mit Fluoreszenzfarbstoff. Legen Sie 0,1% Rhodamin 6G Farbstoff in die Probenschleife und schalten das Ventil auf Position bei 5 Sekunden spritzen nach dem Start der Bildaufnahme (Abbildung 3F). Das Fluoreszenzsignal ist zwischen 10-30 Sekunden erkannt. Die glatte Kurve der Fluoreszenz-Signal zeigt auch, dass es wenig Turbulenzen unter dem Eintauchen Objektiv und eine ausreichende Perfusion von mit Sauerstoff angereichertem MACSF erreicht die Scheibe erzeugt. </li></ol> 4. Zeitraffer-Aufnahme <ol><li> Wir nutzen die Zeiss AxioSkope FS2 Mikroskop mit einem 10x-oder 20x Wasser-Tauchen-Objektiv für Zeitraffer-Bildgebung. Standard-GFP Bandpassfilter (450-490nm) ist für die G-camp2 Signale verwendet. Die epifluoreszenten Bilder werden von einer CCD-Kamera (Zeiss HRM) mit 1x1 oder 2x2 Binning abhängig von der Expression von G-camp2 erworben. </li><li> Stellen Sie die Aufnahmegeschwindigkeit auf 1 Frame pro Sekunde. Passen Sie die Intensität des Lichtes zu minimieren Ausbleichen der G-camp2 Signale und Foto-Schäden an den Zellen. Für jedes abperiment, die wir normalerweise gewinnen ein 60-Frame-Bildstapel (~ 60-70 Sekunden). Schalten Sie das Ventil der Injektion Position zu einem bestimmten Zeitpunkt (z. B. 5 Sekunden in Abbildung 3F) für eine Gruppe von Experiment, um konsistente zeitliche Verzögerung in allen Studien zu erhalten. </li><li> Führen Sie einen Testlauf mit Ringer-Lösung als Stimulus. Re: Passen Sie die Perfusion Setup, wenn Bewegung Artefakt während der Probenaufgabe eingeführt wird. </li><li> Führen Sie eine positive Kontrolle mit Maus Urin bei 1:100 in Ringer-Lösung verdünnt laufen. Die typische maximale &amp;Dgr; F / F-Wert von G-camp2 Reaktion auf Maus Urin ist um 20-40%. Bei Bedarf kann man die Lebensfähigkeit der Scheibe durch Abgabe von 10 mM KCl in Ringer auf die Scheiben am Ende der Experimente stimulieren bestätigen. </li><li> Waschen Sie die Hamilton-Spritze in Ringer-Lösung mindestens drei Mal nach dem Laden ein Stimulus. Waschen Sie die Probenschleife mit Ringer-Lösung mindestens dreimal zwischen verschiedenen Reizen. Diese Schritte verhindern Kreuzkontamination zwischen different Proben. </li><li> Warten Sie für 4-10 min für die VSNs auf, bevor der nächste Reiz zu erholen. </li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Führen Bildregistrierung aller Bilder aus einem Stück erworben. Wir verwenden eine speziell geschriebenen VBA-Skript in AxioVision (Carl Zeiss, Nordamerika), um diesen Prozess zu automatisieren. Alle Einzelbilder innerhalb des gleichen Experiments sind gegen einen gemeinsamen Bezugsrahmen gewählt mit elastischen Registrierung (Abbildung 4A) registriert. Elastic-Registrierung, die auch als nichtlineare Registrierung bekannt, ist eine Kategorie der Bildregistrierung Technik betont die Transformation von einem Zielbild nicht starr an einem Referenzbild. Hier haben wir die Umsetzung von AxioVision. Dieses Bezugssystem wird willkürlich aus dem Bildstapel gewählt. </li><li> Führen Bildsubtraktion der reagierenden Zellen zu identifizieren. Wir verwenden eigens geschriebenen Makros in ImageJ v1.42 ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> , NIH, Bethesda, MD), um diesen Prozess zu automatisieren. Eine minimale Projektion Bild ist für jeden Stapel erzeugt. Reagierenden Zellen entstehen nach dem minimalen Vorsprung von der Roh-Stacks (Abbildung 4B) subtrahiert wird. </li><li> Identifizieren region of interest (ROI) aus dem Stapel abgezogen und erhalten die ROI-Koordinaten mit Multi-Measure-Plugin von ImageJ. Bearbeiten Sie alle Stacks für ein Experiment, und speichern Sie alle ROI-Koordinaten in einer ROI-Master-Liste (Abbildung 4C). </li><li> Verwenden Sie die ROI-Master-Liste zu-Zell-Antworten von Roh-Image-Stacks mit speziell geschriebenen Makro-und Multi-Measure-Plugin von ImageJ (Abbildung 4D) zu messen. Plot-Wirkungs-Kurven und Heatmap in Matlab (Mathworks Inc., Natick, MA). </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für die VNO Imaging Experiment mit Urinproben von vier einzelnen Mäusen gesammelt ist in Abbildung 5 dargestellt. Die Scheibe reagiert auf Urin Stimulation mit unterschiedlichen patterns der Aktivierung. Über 80 Zellen identifiziert, welche Antwort auf mindestens eine der Urin Reize und ihre Reaktion &amp;Dgr; F / F-Werte in der Heatmap (Abbildung 5A) aufgetragen sind. Die Antwort Spuren von Zellen 1, 2 und 3 sind in Abbildung 5B zeigt den zeitlichen Verlauf Aktivierung durch Urin Reize aufgezeichnet. Cell 1 zeigt als Reaktion auf weibliche Urinproben, nicht aber die männlichen Proben, während die Zelle 2 zeigt das Gegenteil Muster der Aktivierung und reagiert sowohl auf männliche Proben. Cell 3 wird sowohl von einzelnen männlichen und weiblichen Muster aktiviert. Zellen 1 und 2 zeigen typische Reaktion auf geschlechtsspezifische Hinweise in den Urin 15. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig1.jpg" /> Abbildung 1 Schematische Darstellung des VNO Dissektion Prozess. A. Die anatomische Lage des VNO in der Maus den Kopf. Der Kopf eines G-camp2 Maus wurde seziert und auf den Kopf mit dem weichen t gelegtFrage aus dem Gaumen des VNO freizulegen. Inlet zeigt ein fluoreszierendes Bild das gleiche Bild. Die neuroepithelia des VNO sind leuchtend grün. B. eine Seitenansicht des isolierten VNO, dass in der Vomers (oben) und die Fluoreszenz-Bild der gleichen VNO (unten) umschlossen ist. C. A koronale Ansicht der VNO und Dissektion Prozess. Ein VNO ist von der Scheidewand getrennt und die Vomers kann dann entfernt werden, um die Neuroepithel zu befreien. D. VNO ist in LMA. E. embedded Der Embedded-Block, um das Gewebe Halter ist für das Schneiden geklebt. Der Papierrollenhalter ist bei 180-200 um pro Stück schieben die Agarose Block aus der Metall-Fass zum Schneiden fortgeschritten. Die Schneide ist eng mit dem Metallschaft positioniert. F. Seitenansicht des VF300 Gewebe Hobel-System. BV, Blutgefäß. NE, Neuroepithel. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig2.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 2 VNO Scheiben schneiden. A. VNO Scheiben sind in Sauerstoff MACSF bei Raumtemperatur gehalten. B. A DIC Bild von der VNO in Scheiben schneiden. C. A 2-Photonen-Bild des VNO von G-camp2 Maus. Scale-bar, 50 um. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig3.jpg" /> Abbildung 3 Illustration der Perfusion System-Setup. A. Eine typische Perfusionskammer mit Ein-und Auslass. VNO Scheibe befindet sich im Zentrum der Kammer positioniert und drückte sich mit einem Gewebe zu verankern. Die mittlere Gewinde sind aus dem Gewebe Anker entfernt, so dass das VNO Gewebe nicht gedrückt wird. B. Die Perfusionskammer auf Mikroskoptisch unter dem Eintauchen Ziel gesetzt. Die MACSF Einlass-, Saug-Steckdose und Perfusion Spitze angezeigt. C. Die Single Barrel Spritzenpumpe bietet kontinuierlichen Ringer durch die Perfusion Spitze. D. Die HPLC injection-Loop-System ist für die bequeme Stimulus Probe Be-und Injektion angenommen. E. Schematische Darstellung der Fließrichtung beim Be-und Injektion Positionen. Ringer, grün. Stimulus Probe, magenta. Die Pfeile zeigen die Richtung des Flusses. F. Delay und abwaschen Zeitmessung der Perfusion System. Rhodamin 6G Fluoreszenzfarbstoff ist es, die Probenschleife geladen und das Ventil ist, um die Injektion Position bei der 5. Sekunde, die mit einem Pfeil gekennzeichnet ist eingeschaltet. Das Fluoreszenzsignal Änderung wird zwischen 10-30 Sekunden und nimmt danach erkannt. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig4.jpg" /> Abbildung 4 Bild-Verarbeitungs-Pipeline. A. Alle Bildrahmen für eine Scheibe gegen einen Bezugsrahmen registriert. B. Subtraktion der minimalen Vorsprung von einem Stapel von seiner rohen Frames. Reagierenden Zellen werden prominente nach Abzug. C. ROIs werden ausgewählt und ihre Koordinaten werden in Master-Liste zusammengestellt. D. Messung der reagierenden Zellen mit ROI-Master-Liste aus rohen Stapel. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig5.jpg" /> Abbildung 5 Ein Vertreter G-camp2 VNO Imaging Experiment. A. Die AF / F Antwort Heatmap aus einer Scheibe mit einzelnen männlichen und weiblichen Urin angeregt. Urinproben sind von einzelnen männlichen und weiblichen Mäusen gesammelt. X-Achse, reagiert Zellen aus dem Stück identifiziert. Y-Achse, Urinproben in dem Experiment verwendet. Farbbalken zeigt die AF / F-Wert. B. Reaktionszeit innerhalb von 3 repräsentativen Zellen in A. Pfeilen markiert zeigen die Zeit der Reiz-Anwendung. F-FVB, weibliche FVB; F-CBA, weibliche CBA; M-FVB, männlichen FVB; M-BL6, männlichen C57BL / 6. Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte: <table border="1"><tbody><tr><td> Name derReagens </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Perfusionskammer </td><td> Siskiyou </td><td> PC-H </td><td> horizontal </td></tr><tr><td> slice Niederhalter </td><td> Warner Instruments </td><td> SHD-22CL </td><td></td></tr><tr><td> Perfusion Port Halterung </td><td> ALA wissenschaftlichen, Inc. </td><td> MPIOH-S </td><td></td></tr><tr><td> Spritzenpumpe </td><td> New Era Pump Systems, Inc. </td><td> NE-300 </td><td></td></tr><tr><td> Niederdruck-Einspritzventil </td><td> Chromtech </td><td> V-451 </td><td></td></tr><tr><td> PEEK-Schlauch </td><td> Chromtech </td><td> 1531 </td><td> 1 / 16 &quot;OD, 0,25 mm ID </td></tr><tr><td> PEEK-Probenschleife </td><td> Chromtech </td><td> 1803 </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> Hamilton-Spritze </td><td> Chromtech </td><td> 80630 </td><td> 100 ul </td></tr></tbody></table>

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	<li>Birch, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pheromones. , (1974).</li><li>Wyatt, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromones+and+animal+behaviour+:+communication+by+smell+and+taste.">Pheromones and animal behaviour : communication by smell and taste.</a> , (2003).</li><li>Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vomeronasal+organ+mediates+interspecies+defensive+behaviors+through+detection+of+protein+pheromone+homologs.">The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection of protein pheromone homologs.</a> Cell. 141, 692-703 (2010).</li><li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons.">Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Nature. 405, 792-796 (2000).</li><li>Dulac, C., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+family+of+genes+encoding+putative+pheromone+receptors+in+mammals.">A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 83, 195-206 (1995).</li><li>Herrada, G., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+family+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals+with+a+topographically+organized+and+sexually+dimorphic+distribution.">A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographically organized and sexually dimorphic distribution.</a> Cell. 90, 763-773 (1997).</li><li>Matsunami, H., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multigene+family+encoding+a+diverse+array+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals.">A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 90, 775-784 (1997).</li><li>Ryba, N. J., Tirindelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+multigene+family+of+putative+pheromone+receptors.">A new multigene family of putative pheromone receptors.</a> Neuron. 19, 371-379 (1997).</li><li>Pantages, E., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+family+of+candidate+pheromone+receptors+in+mammals.">A novel family of candidate pheromone receptors in mammals.</a> Neuron. 28, 835-845 (2000).</li><li>Zhang, X., Rodriguez, I., Mombaerts, P., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+and+vomeronasal+receptor+genes+in+two+mouse+genome+assemblies.">Odorant and vomeronasal receptor genes in two mouse genome assemblies.</a> Genomics. 83, 802-811 (2004).</li><li>Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formyl+peptide+receptors+are+candidate+chemosensory+receptors+in+the+vomeronasal+organ.">Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).</li><li>Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formyl+peptide+receptor-like+proteins+are+a+novel+family+of+vomeronasal+chemosensors.">Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors.</a> Nature. 459, 574-577 (2009).</li><li>Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+evolution+of+the+V2r+vomeronasal+receptor+gene+repertoire+in+mice+and+rats.">Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats.</a> Genomics. 86, 306-315 (2005).</li><li>Rodriguez, I., Punta, D. e. l., Rothman, K., Ishii, A., T, ., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+new+and+isolated+families+within+the+mouse+superfamily+of+V1r+vomeronasal+receptors.">Multiple new and isolated families within the mouse superfamily of V1r vomeronasal receptors.</a> Nat. Neurosci. 5, 134-140 (2002).</li><li>He, J., Ma, L., Kim, S., Nakai, J., Yu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+gender+and+individual+information+in+the+mouse+vomeronasal+organ.">Encoding gender and individual information in the mouse vomeronasal organ.</a> Science. 320, 535-538 (2008).</li><li>Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+vomeronasal+neurons+to+natural+stimuli.">Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli.</a> Science. 289, 1569-1572 (2000).</li><li>Chamero, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein+pheromones+that+promote+aggressive+behaviour.">Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour.</a> Nature. 450, 899-902 (2007).</li><li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides.">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li><li>Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+peptides+from+exocrine+glands+stimulate+mouse+vomeronasal+sensory+neurons.">Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons.</a> Nature. 437, 898-901 (2005).</li><li>Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+three-dimensional+fluorescence+imaging+of+activity+in+neural+populations+by+objective-coupled+planar+illumination+microscopy.">Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy.</a> Neuron. 57, 661-672 (2008).</li><li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+I+peptides+as+chemosensory+signals+in+the+vomeronasal+organ.">MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ.</a> Science. 306, 1033-1037 (2004).</li><li>He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+signals+conveyed+by+pheromone+concentrations+to+the+mouse+vomeronasal+organ.">Distinct signals conveyed by pheromone concentrations to the mouse vomeronasal organ.</a> J. Neurosci. 30, 7473-7483 (2010).</li><li>Haga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+male+mouse+pheromone+ESP1+enhances+female+sexual+receptive+behaviour+through+a+specific+vomeronasal+receptor.">The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor.</a> Nature. 466, 118-122 (2010).</li><li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor.">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nat. Neurosci. 5, 1261-1262 (2002).</li><li>Hendel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+changes+of+genetic+calcium+indicators+and+OGB-1+correlated+with+neural+activity+and+calcium+in+vivo+and+in.">Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in.</a> 28, 7399-7411 (2008).</li><li>Pologruto, T. A., Yasuda, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+neural+activity+and+[Ca2+]+with+genetically+encoded+Ca2++indicators.">Monitoring neural activity and [Ca2+] with genetically encoded Ca2+ indicators.</a> J. Neurosci. 24, 9572-9579 (2004).</li><li>Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+a+genetically+encoded+optical+sensor+of+neural+activity+using+electrophysiology+in+intact+adult+fruit+flies.">Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies.</a> Front Neural Circuits. 1 (3), (2007).</li><li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Mehrheit der vomeronasalen Rezeptoren (VRS) bleiben als Orphan-Rezeptoren seit ihrer Entdeckung durch Dulac und Axel 5. Die Pheromon-Liganden für diese Chemosensoren und ihre Rollen bei der Vermittlung von Tieren Verhaltensweisen sind nicht gut verstanden. Bis jetzt hat nur ein Paar von Ligand / Rezeptor, der ESP1 Peptid und seinem verwandten Rezeptor, Vmn2r116 (V2Rp5), wurden identifiziert und gezeigt, dass bestimmte soziale Informationen 19,23 vermitteln. Ein weiterer Rezeptor, V1rb2, hat si...

imaging neuronal responses in slice preparations of vomeronasal organ expressing a genetically encoded calcium sensor

Die Vomeronasalorgan (VNO) erkennt chemosensorischen Signale, die Informationen über die sozialen, sexuellen und reproduktiven Status der Individuen innerhalb der gleichen Spezies 1,2 tragen. Diese innerartliche Signale, die Pheromone, sowie Signale von einigen Räubern 3, aktivieren Sie die vomeronasalen sensorischen Neuronen (VSNs) mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit 4. Mindestens drei verschiedene Familien von G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, V1R, V2R und FPR 5-14, sind in VNO Neuronen exprimiert, um den Nachweis der chemosensorischen Cues zu vermitteln. Um zu verstehen, wie Pheromone Informationen des VNO codiert ist, ist es entscheidend, um die Antwort Profile einzelner VSNs auf verschiedene Reize zu analysieren und die spezifischen Rezeptoren, die diese Reaktionen zu vermitteln. Die neuroepithelia des VNO sind in ein Paar Vomer Knochen umschlossen. Die halb-blind röhrenförmige Struktur des VNO hat ein offenes Ende (das vomeronasale Kanal) eine Verbindung zuder Nasenhöhle. VSNs erweitern ihre Dendriten zum Lumen Teil des VNO, wo die Pheromon-Signale sind in Kontakt mit den Rezeptoren auf der dendritischen Knöpfen zum Ausdruck gebracht. Die Zellkörper der VSNs Form pseudo-geschichteten Lagen mit V1R und V2R in den apikalen und basalen Schichten jeweils 6-8 ausgedrückt. Verschiedene Techniken wurden verwendet, um Antworten VSNs auf Sinnesreize 4,12,15-19 überwachen. Unter diesen Techniken bietet akuten Scheibe Vorbereitung mehrere Vorteile. Erstens, im Vergleich zu trennen VSNs 3,17 pflegen Scheibe Vorbereitungen der Neuronen in ihrem nativen Morphologie und die Dendriten der Zellen bleiben relativ intakt. Zweitens sind die Zellkörper der VSNs leicht zugänglich in koronare Schicht des VNO zu elektrophysiologischen Studien-und Imaging-Experimente ermöglichen, um die ganze Epithel-und Ganzkörper-Mount-Präparaten 12,20 verglichen. Drittens kann diese Methode mit molekularen Klonierungstechniken kombiniert werden, um Rezeptor-Identifizierung zu ermöglichen. Sensorische Stimulation löst starke Ca 2 +-Einstrom in VSNs, die indikativ für Rezeptor-Aktivierung 4,21 ist. Wir entwickeln so transgene Mäuse, die zum Ausdruck G-camp2 in den Riechzellen, einschließlich der VSNs 15,22. Die Empfindlichkeit und der genetischen Beschaffenheit der Sonde erheblich erleichtern Ca 2 +-Imaging Experimente. Diese Methode hat den Farbstoff Ladevorgang in früheren Studien 4,21 verwendet eliminiert. Darüber hinaus setzen wir ein Ligand Delivery System, Anwendung verschiedener Reize ermöglicht, die VNO Scheiben schneiden. Die Kombination der beiden Techniken ermöglicht es uns, mehrere Neurone gleichzeitig überwachen in Reaktion auf eine große Anzahl von Reizen. Schließlich haben wir eine semi-automatisierte Analyse-Pipeline für die Bildverarbeitung unterstützen soll.

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Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Die Vomeronasalorgan (VNO) erkennt Intraspezies chemischen Signalen, die sozialen und reproduktiven Informationen zu vermitteln. Wir haben Ca2 +-Imaging durchgeführt Experimente mit transgenen Mäusen, die G-camp2 in VNO Gewebe. Dieser Ansatz erlaubt es uns, die komplizierten Reaktionsmuster des vomeronasalen Neuronen eine große Anzahl von Pheromon-Stimuli zu analysieren.

Imaging neuronalen Antworten in Scheiben Zubereitungen von Vomeronasalorgan Ausdruck eines genetisch kodierte Kalzium-Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

imaging-neuronal-responses-slice-preparations-vomeronasal-organ

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K Aufrufe.  Stowers Institute for Medical Research. Die Vomeronasalorgan (VNO) erkennt Intraspezies chemischen Signalen, die sozialen und reproduktiven Informationen zu vermitteln. Wir haben Ca2 +-Imaging durchgeführt Experimente mit transgenen Mäusen, die G-camp2 in VNO Gewebe. Dieser Ansatz erlaubt es uns, die komplizierten Reaktionsmuster des vomeronasalen Neuronen eine große Anzahl von Pheromon-Stimuli zu analysieren.

Serie: Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Calcium Imaging von geruchs-evozierte Potentiale in der Drosophila Antennallobus

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Forschung

Neurowissenschaften

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Akute Gewebeschnitt Vorbereitung

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo Zubereitungen der Intact Vomeronasalorgan und akzessorischen olfaktorischen Bulbus

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.

Abbildungsintrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in Striatal Astrozyten von erwachsenen Mäusen mit gentechnisch-kodierte Kalzium Indikatoren

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Recording Licht-evozierte Postsynaptische Antworten in Neuronen im Dunkel-adaptierten, Maus retinalen Scheibe Vorbereitungen Verwendung Patch-Clamp-Techniken

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate goal is to image neuronal activity in vivo, one must be able to image activity of a single cell to ensure successful in vivo preparations. This procedure will describe how to image membrane potential in a single cell to provide a foundation to eventually image in vivo. Here we describe methods for imaging GEVIs consisting of a voltage-sensing domain fused to either a single fluorescent protein (FP) or two fluorescent proteins capable of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) in vitro. Using an image splitter enables the projection of images created by two different wavelengths onto the same charge-coupled device (CCD) camera simultaneously. The image splitter positions a second filter cube in the light path. This second filter cube consists of a dichroic and two emission filters to separate the donor and acceptor fluorescent wavelengths depending on the FPs of the GEVI. This setup enables the simultaneous recording of both the acceptor and donor fluorescent partners while the membrane potential is manipulated via whole cell patch clamp configuration. When using a GEVI consisting of a single FP, the second filter cube can be removed allowing the mirrors in the image splitter to project a single image onto the CCD camera.

A method for imaging changes in membrane potential using genetically encoded voltage indicators is described.

Imaging Membrane Potential mit zwei Arten von genetisch kodierten Fluorescent Spannungssensoren

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Optische Kontrolle eines Neuronal Protein eine genetisch kodierter unnatürliche Aminosäure in Neurons Verwendung

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

Längerer Inkubation von Akute neuronales Gewebe für Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebung

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.