Wir wollen vor allem Monique Nenniger Tosato für ihre hervorragende technische Unterstützung sowie Jean-Yves Chatton für seine wissenschaftliche Beratung und die Imaging-CIF-Plattform der UNIL für das Mikroskop Ausstattung zu danken. Die Finanzierung wurde von der Swiss National Science Foundation zur Verfügung gestellt.

1. Dissection der Maus VNO <ol><li> Verwenden erwachsenen Mäusen. Als Pheromon sensing in Multimodalitäten verwickelt ist, ist eine sorgfältige Unterscheidung zwischen Stämmen, Genotypen, Geschlechts und Alters wichtig und werden Ihre Ergebnisse beeinflussen. Hier wählen wir Erwachsenen VG Mäusen 30 zuvor für die Identifizierung einer Pheromon-Rezeptor-Paar (2-Heptanon-V1rb2) 31 (Abb. 1A) verwendet. </li><li> Vor Beginn der Dissektion, bereiten Sie frisches kaltes künstliche Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (ACSF; NaCl 118 mm, NaHCO 3 25 mM, D-Glucose 10 mM, KCl 2 mM, MgCl 2 2 mM, NaH 2 PO 4 1,2 mM, CaCl 2 2 mM, pH 7,4) mit oxycarbon (95% O 2 gesättigt: 5% CO 2). Dafür mischen alle ACSF Komponenten außer CaCl 2. Tränken Sie die Lösung direkt durch das Sprudeln es mit oxycarbon. Am Ende fügen Sie die CaCl 2 und stellen Sie mit ddH 2 0 bis die gewünschte Lautstärke. Halten Sie das ACSF-Lösung auf Eis, bis use. </li><li> Euthanasie der Maus sollte vorzugsweise durch Genickbruch oder durch CO 2-Inhalation werden, kurz bevor das Experiment durchgeführt. </li><li> Schneiden Sie die Maus den Kopf. Legen Sie sie unter einem Binokular in kalten ACSF kontinuierlich oxycarbonated. </li><li> Schneiden Sie den Unterkiefer und die Position des Kopfes, um den Gaumen (Abb. 1B) zu visualisieren. </li><li> Machen Sie einen Schnitt horizontal in den oberen Teil des Gaumens (Abb. 1B) mit Mikro-Schere und entfernen Sie den Gaumen Membran mit mikrofeinen Pinzette. Hydrate und reinigen ausgesetzt Hohlraum mit ACSF (Abb. 1C). </li><li> Schneiden Sie den oberen und den unteren Teil der Nasenscheidewand (Abb. 1C). Zart-Extrakt der Nasenscheidewand mit dem VNO und legen Sie es direkt in ACSF auf Eis (Abb. 1D). </li><li> Separate vertikal die beiden Teile des VNO mit Mikro Pinzette und zart entfernen Knorpelkapsel der VNO (Abb.. 1E). Stellen Sie sicher, dass alle die knorpeligen Stücke entfernt werden. </li></ol> 2. VNO Gewebeschnitt Vorbereitung Der VNO Gewebeschnitt Vorbereitung in diesem Abschnitt 2) beschrieben ist vor allem für Kalzium-Imaging Untersuchungen. VNO Scheiben können auch für immunohistostainings auf schwimmenden Scheiben verwendet werden, um die strukturelle Integrität des Gewebes (siehe Abschnitt 3) des Protokolls) zu überprüfen. <ol><li> Bereiten niedrig schmelzenden Agar (3% in Standard-PBS) und Ihrem Arbeitsplatz. Sie werden ACSF, ein Mikrotom und unterstützt, Mikro Pinzette braucht, Einbettformen (22 x 22 x 20 mm), Präzisions-Reinigungstücher, Pinsel, Zellkulturplatten, Cyanacrylat Klebstoff, Eis und ein Thermometer. </li><li> Füllen Sie den Einbettform mit 3% niedrig schmelzenden Agar. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur nicht höher als 41 ° C, bevor Sie vertikal die kurz abgewischt VNO (Abb. 2A) in der Lage sein koronalen Schichten zu erhalten. </li><li> Legen Sie die Einbettform auf Eisfür 1 min bis zur Erstarrung und dann trennen sie von der Agar-Block. Schneiden Sie die Agar-Block in Form einer Pyramide und legen Sie sie mit Kleber auf der Mikrotom-Unterstützung (Abb. 2B). </li><li> Cut koronalen VNO Scheiben mit dem Mikrotom mit einer Geschwindigkeit von 0,5 mm / s, einer Amplitude von 0,7 mm und eine Dicke von 100 um in kalten ACSF und sammeln Sie die Gewebeschnitte mit einer Bürste, bevor Sie sie in einer Gewebekultur Platte mit kaltem gefüllt ACSF. </li><li> Wenn Ihre Scheiben endogene Fluoreszenz wie GFP (in Gen-gezielte Neuronen) enthalten, können Sie sie unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop (Abb. 2C) zu wählen. </li></ol> 3. Immunhistochemie auf VNO schwimmende Scheiben Das Ziel dieses Verfahrens ist es, die Integrität des VNO Gewebeschnitten in Abschnitt 2) erhaltenen zu überprüfen. Acetyliertes-Tubulin ist ein Mikrotubuli / Zytoskelett-Marker in Dendriten und Mikrovilli der VNO sensorischen Neuronen exprimiert. Für Kalzium-Imaging Experimente, gehen RichtungTLY § 4) des Protokolls. Die immunhistochemischen Methode auf schwimmenden VNO Scheiben kann die Auswertung des Ausdrucks eines Proteins von Interesse angepasst werden. Zu diesem Zweck empfehlen wir Ihnen, fixieren die VNO für 1h bei 4 ° C in einer Fixierlösung (Paraformaldehyd 4% in PBS, pH 7,6) nach dem Punkt 1.7) des Protokolls und die Nutzung von diesem Punkt PBS bei pH 7,6 statt ACSF-Lösung. <ol><li> In der Gewebekultur Platte, fixieren Sie Ihre Scheiben Interesse an einer Fixierlösung (Paraformaldehyd 4% in PBS, pH 7,6) 1h bei 4 ° C. </li><li> Block Ihrer Gewebeschnitte über Nacht bei 4 ° C in einer PBS-Lösung mit NGS (normal Ziegenserum) 10% und Triton X-100 bei 0,5%. </li><li> Inkubieren Scheiben mit dem primären Antikörper (anti-acetylierte-Tubulin, Maus, 1:2000) für 16h bei Raumtemperatur (RT) in einer PBS-Lösung mit 5% NGS und Triton X-100 bei 0,25%. </li><li> 3 x je 5 Minuten mit einer PBS-Lösung mit NGS 2%. </li><li> Inkubieren im Dunkeln mit dem secondary Antikörper (Cy5-konjugierten Ziege anti-Maus, 1:200) in einer PBS-Lösung mit NGS 2% für 1h bei RT. </li><li> 3 x je 5 Minuten mit PBS, das NGS 2% NGS PBS 1% und PBS nur. </li><li> Befestigen Sie Ihren Scheiben in einem fluoreszierenden Eindeckmittel (enthalten oder nicht DAPI), indem Sie sie in der Mitte der hydrophoben abgegrenzten Zonen (mit einem hydrophoben Stift) und decken die Scheiben mit Deckgläsern. </li><li> Machen Sie Beobachtungen und Akquisitionen mit der konfokalen Mikroskopie und eine Software, mit 3D-Rekonstruktionen (Abb. 2D-F). </li></ol> 4. Kalzium-Imaging auf VNO Scheiben <ol><li> Die folgenden Verfahren findet im Dunkeln statt. Inkubieren VNO Scheiben für 1 Stunde bei 37 ° C in einem Laden Lösung von kalt ACSF mit Fura-2AM (7 uM; Stammlösung von 1 mM in DMSO) komponiert und Pluronic 0,1% (w / v; Stammlösung bei 20% in ddH 2 O). </li><li> Halten Sie die geladenen Scheiben auf Eis mit oxycarbonation bis zur Verwendung. Loaded Scheiben gehalten werden kann für sein3-4h. </li><li> Legen Sie die geladenen Scheiben mit einem Pinsel in einer Perfusionskammer mit ACSF und pflegen die Scheiben mit einem Gewebeschnitt Anker (Abb. 3A). </li><li> Legen Sie die Perfusionskammer auf der Bühne eines Kalzium-Imaging-Mikroskop (Abb. 3B) und kontinuierlich mit oxycarbonated ACSF perfuse bei RT. Die Temperatur kann mit der Verwendung eines bipolaren Temperaturregler angepasst werden. </li><li> Beobachtungen der geladenen VNO Scheiben (Abb. 3C-E) sind mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop durchgeführt, mit einem 25x-oder 63x Objektiv und einem kühlen SNAP-HQ-Kamera. Die Beleuchtung erfolgt sequentiell (340/380 nm) mit einem Polychromator Instrument gemacht und aufgezeichnet mit einer Rate von 5Hz. Gefilterte Emission bei 510 nm durchgeführt. Intrazellulären Calcium-Verhältnis ändert sich (AF = 340 nm/380 nm) werden mit einer entsprechenden Software überwacht. </li><li> Chemostimulation sollten nach Ihren eigenen experimentellen Zweck ausgewählt werden. Hier mit Infusionen von ACSF ein Pheromon mix (Isobutylamin, 2-Heptanon, 4-Heptanon, 2-Heptanol, pentylacetate, Dimethylpyrazin, α / β-Farnesen, 10 -6 M), 2-Heptanon (10 -6 M) oder frisch gesammelten männlichen und weiblichen (1: 1) Maus Urin (1:100) sind 32 durchgeführt. Perfusion von ATP (125 pM) wird als Lebensfähigkeit Test am Ende der Experimente verwendet werden (Abb. 3F) und sollte einen Anteil von etwa 80% lebensfähige Nervenzellen zeigen. Unter diesen Bedingungen können Scheiben bis zu 2 Stunden verwendet werden. </li><li> GFP-markierten Subpopulationen von sensorischen Neuronen werden durch spezielle Beleuchtung (hier die V1rb2 Ausdruck Neuronen) visualisiert und können genau analysiert werden (Abb. 3G-I). </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Um einen funktionellen Assay zu etablieren, um die multi duktionswegen statt in der Maus VNO oder neue Pheromon-Rezeptor-Paare identifizieren zu untersuchen, nutzen wir die VG-Maus-Linie (Abb. 1A </strong&gt;). In dieser Linie, einer von 240 V1Rs Rezeptoren, wird die V1Rb2 Rezeptor GFP-markierten erlaubt die einfache Visualisierung eines bestimmten Subpopulation von vomeronasalen sensorischen Neuronen. Nach der Extraktion und Präparation des VNO (Abb. 1E), bereiten wir akute VNO Scheiben (Abb. 2C). Wir fixieren ein Bruchteil von ihnen, um zu überprüfen und zu validieren Gewebs Integrität der Vorbereitung, indem immunohistostainings gegen die acetylierten-Tubulin-Proteinen (Abb. 2D-F). Die andere Fraktion der Scheiben ist für Kalzium-Imaging-Experimenten verwendet. Dafür sind Scheiben mit Fura-2 Uhr morgens (Abb. 3C-E) geladen und der intrazellulären Calcium-Ebene der einzelnen Neuron ist als AF-Verhältnis (Abb. 3F) überwacht. Die Lebensfähigkeit der Neuronen wird durch Perfusion von ATP (125 pM), bewertet nach dem schnellen und vorübergehenden Anstieg der AF-Verhältnis zu erwarten ist (Abb. 3F). Urin wird eine wichtige Quelle von Pheromonen, Perfusion von frischenly gesammelt Maus Urin (1:100) wird als eine endogene Kontrolle verwendet. Es löst Kalzium Transienten in etwa 50% der aufgenommenen Neuronen (Zelle 1 und 2, Abb.. 3F). Unter GFP Beleuchtung, sind V1Rb2 positive Neuronen zu beobachten, und die Durchblutung seiner bekannten Pheromone Liganden, 2-Heptanon, initiiert zelluläre Aktivierung (Zelle 1, Abb.. 3I). Interessanterweise sind neuronale Aktivierungen auch in einem Bruchteil der Neuronen, die nicht exprimieren die V1Rb2 Rezeptor (GFP negativen Neuronen) (Zelle 2, Abb.. 3I), was die Komplexität der Pheromon-Codierung im VNO zu beobachten. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig1.jpg" /> Abbildung 1. Dissection der Maus Vomeronasalorgan. (A) Eine Maus aus der VG Linie. (B) Nach der Euthanasie der Maus, ist die vollständige Kopf unter einem Binokular gelegt und der Unterkiefer ist entfernt, um den Gaumen zu visualisieren. Ein kleiner horizontaler Schnitt ist getan(Schwarz gestrichelte Linie). (C) Nach der Entfernung der Gaumen ist der Nasenscheidewand mit dem VNO gesäumt in der oberen geschnitten und der untere Teil (weiß gestrichelte Linien) zu VNO-Extraktion zu erleichtern. (D) Das VNO ist in ACSF-Lösung positioniert und voneinander getrennt (insert: höhere Leistung angesichts der beiden Teile). (E) Die knorpeligen Kapsel des VNO ist fein entfernt, und das VNO ohne Knorpelkapsel ist für den Rest der Experimente verwendet. Scale-Bars sind: BE, 1 mm. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig2.jpg" /> Abbildung 2. Maus vomeronasalen akuten Scheibe Vorbereitung und Gewebs Integrität. (A) Die Maus VNO ist vertikal in einem Agar-3%-Lösung eingebettet. Die Temperatur des Agar muss kleiner sein als 41 ° C. (B) Die Agar-Block wird in Form einer Pyramide geschnitten und 100 um VNO Abschnitte (schwarz gestrichelte Linie) sind in ACSF generiert. (C) VNO Scheiben können unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop ausgewählt werden, um eine spezifische visualisierenBevölkerung von markierten sensorischen Neuronen. (DF) Gewebs Integrität kann durch immunohistostainings gegen die acetylierten-Tubulin-Proteinen, einer höheren Macht angesichts der V1rb2 Gen gezielte Neuronen zeigen die perfekte Konservierung des Präparates ausgewertet werden. Neuronen mit ihren langen Dendriten Erreichen der Oberfläche des Lumens (E) sowie der Ausdruck der strukturellen Protein in den dendritischen Knöpfen und Mikrovilli zu beobachten (F) sein. Scale-Bars sind: B, 5 mm; C, 60 pm, D, 40 um; EF, 20 mm. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig3.jpg" /> Abbildung 3. Calcium Imaging und Pheromonwahrnehmung in vomeronasalen akuten Gewebeschnitten. (A) Nach einer Fura-2AM Ladephase sind VNO Scheiben in eine Perfusionskammer platziert und mit einer angepassten Anker (high power view) erhalten. (B) Die Experimente werden in den dunklen und VNO Scheiben durchgeführt werden kontinuierlich mit ACSF bei RT perfundierten mit einem Vakuum-System. Die Temperatur kann chos werdenen mit einer Temperatur-Controller-System durch eine bipolare Pelletier-Element und einer thermischen Sonde zusammen. Diese speziellen Experiment wurde bei RT durchgeführt. (CE) VNO Scheiben werden unter Hoffman Phasenkontrast (C, Hv) oder Fura 380 nm Beleuchtung vor (D) und während der neuronalen Aktivierung (E, hier mit ATP) zu beobachten. (F) Neuronale Lebensfähigkeit ist mit Perfusion von ATP (125 pM) ausgewertet. Hier ist chemostimulation mit Urin (Urin, 1:100) oder mit einer Mischung aus Maus Pheromone (mix ph., 10 -6 M) auf einem konstanten Volumenstrom von 165 ml / h. getan Intrazelluläre Calcium-Spiegel (AF) kann individuell für jede Zelle aufgenommen werden (Cell 1 bis 3). (G) A V1Rb2 Neuron visualisiert unter GFP-Beleuchtung (1). (H) Die Belastung dieses Neurons (1) sowie ein nicht-V1rb2 Ausdruck Neuron (2) angezeigt wird. (I) Die V1rb2 Neuron ist in der Lage, auf 2-Heptanon mit einem intrazellulären Calcium-Anstieg reagieren. Dies insbesondere nicht V1rb2 Ausdruck Neuron reagiert auch auf 2-Heptanon (Zelle 2). Scale-Bars sind: CE, 20 mm; GH,15 mu m; AF = 340 nm / 380 nm. (F und I) Dauer des Reizes Anwendung wird durch Balken unter jede Spur angezeigt. Die willkürliche Farbskala repräsentiert die Intensität der Fluoreszenz.

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grueneberg+ganglion+cells+mediate+alarm+pheromone+detection+in+mice.">Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice.</a> Science. 321, 1092-1095 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Kalzium-Imaging hier vorgestellte Methode ermöglicht zu erfassen, in einer akuten Scheibe Vorbereitung, die Pheromone Reaktionen der Maus VNO Neuronen. Mit diesem Ansatz ist Dissektion vom Tier auf den vomeronasalen Neuronen, mit etwas Übung leicht zu erreichen und bietet eine lange lebendes Gewebe Vorbereitung. Es ermöglicht zeitaufwendige Experimente wie pharmakologische Untersuchungen oder die Untersuchung der Pheromone Codierung. Mit dieser physiologischen Technik können große Populationen sowie präzise neuronale Subpopulationen gezielt analysiert werden. Darüber hinaus kann diese Methode leicht auf immunhistochemischer Ansätze oder Versuche an anderen Kalzium-Farbstoffen angepasst werden. Der Einsatz dieser kombinierten Methoden wird sicherlich ermöglichen die Identifizierung von neuen Pheromone Liganden für die vielen Waisen Chemorezeptoren in der Maus Vomeronasalorgan ausgedrückt.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Adenosin-5&#39;-Triphosphat Dinatriumsalz-Lösung (ATP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6559-25UMO </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7002-100G </td><td> Bevorzugt für die Immunhistochemie </td></tr><tr><td> Agar (niedrigschmelzende) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701-25G </td><td> Vorzugsweise für Kalzium-Imaging </td></tr><tr><td> CL-100 Bipolar-Temperaturregler </td><td> Warner Instruments </td><td> W64-0352 </td><td></td></tr><tr><td> Konfokalmikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> SP5 AOBS </td><td></td></tr><tr><td> Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 115-175-071 </td><td> Vor Licht schützen </td></tr><tr><td> DMSO (Dimethylsulfoxid) </td><td> Merck </td><td> 317275-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Einbettformen, Peel-A-Way </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td> 22 x 22 x 20 mm </td></tr><tr><td> Fluorescent Eindeckmittel (Vectashield mit DAPI, 10 ml) </td><td> Rectolab </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> FURA-2AM </td><td> Teflabs </td><td> 0103 </td><td> Vor Licht schützen </td></tr><tr><td> Glisseal N (Vakuum Fett, 60 g) </td><td> Borer Chemie </td><td> Glisseal N </td><td></td></tr><tr><td> Großes Bad Aufzeichnung Kammer (RC-26G) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0235 </td><td></td></tr><tr><td> MetaFluor (Software für Kalzium-Imaging; v.7.6.5.0) </td><td> Visitron Systems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Monoklonale Anti-Tubulin, acetylierend Maus-Antikörper </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6793-.2ML </td><td></td></tr><tr><td> Normalem Ziegenserum (NGS, 10 ml) </td><td> Interchim </td><td> UP379030 </td><td></td></tr><tr><td> Plattform für Kammern (P-1) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0277 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127, 2 g </td><td> Invitrogen </td><td> P-6867 </td><td></td></tr><tr><td> Roti Coll (Dosierflasche, 10 g) </td><td> Carl Roth </td><td> 0.258,1 </td><td></td></tr><tr><td> SC-20 Dual In-line-Lösung Heizer / Kühler </td><td> Warner Instruments </td><td> W64-0353 </td><td></td></tr><tr><td> Slice-Anker (SHD-26GKIT) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0266 </td><td></td></tr><tr><td> Stereofluorescence Mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> MZ16FA </td><td></td></tr><tr><td> Super-PAP PEN (hydrophobenpen) </td><td> Pelco Internationalen </td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fluka </td><td> 93420-250ML </td><td></td></tr><tr><td> Vibrierender Klinge Mikrotom VT 1200S </td><td> Leica Microsystems </td><td> 14048142066 </td><td></td></tr><tr><td> VisiChrome hoher Geschwindigkeit Polychromator System </td><td> Visitron Systems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3D-Datenvisualisierung (Imaris; v.6.3.1) </td><td> Bitplane Scientific Software </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging pheromone sensing in a mouse vomeronasal acute tissue slice preparation

Peter Karlson und Martin Lüscher den Begriff Pheromon zum ersten Mal in 1959 1 gegen Chemikalien für den Intra-Spezies-Kommunikation verwendet zu beschreiben. Pheromone sind flüchtige oder nichtflüchtige kurzlebige Moleküle 2 sezerniert und / oder enthalten in biologischen Flüssigkeiten 3,4, wie Urin, einer Flüssigkeit bekannt, dass eine Hauptquelle der Pheromone 3 sein. Pheromone Kommunikation ist in einer Vielzahl von wichtigen Tier-Modalitäten wie kin Interaktionen 5,6, hierarchischen Organisationen 3 und sexuelle Interaktionen 7,8 verwickelt und sind somit direkt mit dem Überleben einer bestimmten Art 9,10,11 korreliert. Bei Mäusen ist die Fähigkeit, Pheromone erkennen hauptsächlich durch die Vomeronasalorgan (VNO) 10,12, einem gekoppelten Struktur an der Basis der Nasenhöhle befindet vermittelt, und in eine knorpelige Kapsel. Jeder VNO hat eine Röhrenform mit einem Lumen 13,14 sodass der Kontakt mit den externenchemischen Welt. Die sensorische Neuroepithel besteht im Wesentlichen aus vomeronasalen bipolaren sensorischen Neuronen (VSNs) 15 zusammen. Jeder VSN erstreckt sich eine einzelne Dendriten zum Lumen, in eine große dendritische Knopf trägt bis zu 100 Mikrovilli in chemischen Nachweis 16 verwickelt. Zahlreiche Subpopulationen von VSNs vorhanden sind. Sie werden von den Chemorezeptoren sie ausdrücken, und damit möglicherweise durch den Liganden (n) sie erkennen, 17,18 differenziert. Zwei wesentliche vomeronasalen Rezeptor Familien, V1Rs und V2Rs 19,20,21,22 sind jeweils um 240 23 und 120 24 Mitgliedern zusammen und werden in getrennten Schichten der Neuroepithel ausgedrückt. Olfaktorische Rezeptoren (OR) 25 und formyl Peptid-Rezeptoren (FPRs) 26,27 sind auch in VSNs ausgedrückt. Ob diese neuronalen Subpopulationen verwenden die gleiche Downstream-Signalweg zur Erfassung Pheromone, ist unbekannt. Trotz einer bedeutenden Rolle, die ein Kalzium-permeable Kanal gespielt werden (TrpC2) in den Mikrovilli der reifen Neuronen 28 trpC2 unabhängige Transduktion Kanäle wurden 6,29 vorgeschlagen. Aufgrund der hohen Anzahl von neuronalen Subpopulationen und die besondere Morphologie der Orgel, sind pharmakologische und physiologische Untersuchungen der Signalelemente in der VNO-Komplex. Hier präsentieren wir eine akute Gewebeschnitt Vorbereitung der Maus VNO für die Durchführung von Kalzium-Imaging Untersuchungen. Dieser physiologische Ansatz ermöglicht Beobachtungen in der Natur eines lebenden Gewebes, der allgemeine oder individuelle Subpopulationen von VSNs zuvor mit Fura-2 Uhr, ein Calcium-Farbstoff beladen. Diese Methode wird auch für das Studium keine GFP-markierten Pheromonrezeptor bequem und eignet sich sowohl für die Verwendung von anderen fluoreszierenden Kalzium-Sonden. Als Beispiel verwenden wir hier eine VG Maus line 30, in der die Übersetzung der Pheromon V1rb2 Rezeptor zur Expression von GFP durch eine polycistronischen Strategie verknüpft ist. </p&gt;

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Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Bei Mäusen ist die Fähigkeit, Pheromone erkennen hauptsächlich durch die Vomeronasalorgan (VNO) vermittelt. Hier ist eine akute Gewebeschnitt Vorbereitung der VNO für die Durchführung von Kalzium-Imaging beschrieben. Dieser physiologische Ansatz ermöglicht Beobachtungen von Subpopulationen und / oder einzelner Neuronen in einem lebenden Gewebe und ist für Rezeptor-Ligand-Identifikation bequem.

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Akute Gewebeschnitt Vorbereitung

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

imaging-pheromone-sensing-mouse-vomeronasal-acute-tissue-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.1K Aufrufe.  University of Lausanne. Bei Mäusen ist die Fähigkeit, Pheromone erkennen hauptsächlich durch die Vomeronasalorgan (VNO) vermittelt. Hier ist eine akute Gewebeschnitt Vorbereitung der VNO für die Durchführung von Kalzium-Imaging beschrieben. Dieser physiologische Ansatz ermöglicht Beobachtungen von Subpopulationen und / oder einzelner Neuronen in einem lebenden Gewebe und ist für Rezeptor-Ligand-Identifikation bequem.

Serie: Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Multielektroden Array Recordings der Vomeronasal Epithel

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Forschung

Neurowissenschaften

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Chronische Imaging of Mouse Visual Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

Slice-Vorbereitung, Organotypische Gewebekulturen und Luciferase Aufzeichnung von Clock Gen-Aktivität in den Nucleus suprachiasmaticus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-Maus Neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Imaging neuronalen Antworten in Scheiben Zubereitungen von Vomeronasalorgan Ausdruck eines genetisch kodierte Kalzium-Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural progenitor cells with astrocytic features (called SVZ astrocytes), neuroblasts, and intermediate progenitor cells. Neuroblasts born in the SVZ tangentially migrate a great distance to the olfactory bulb, where they differentiate into interneurons. Intercellular signaling through adhesion molecules and diffusible signals play important roles in controlling neurogenesis. Many of these signals trigger intercellular calcium activity that transmits information inside and between cells. Calcium activity is thus reflective of the activity of extracellular signals and is an optimal way to understand functional intercellular signaling among SVZ cells.
Calcium activity has been studied in many other regions and cell types, including mature astrocytes and neurons. However, the traditional method to load cells with calcium indicator dye (i.e. bath loading) was not efficient at loading all SVZ cell types. Indeed, the cellular density in the SVZ precludes dye diffusion inside the tissue. In addition, preparing sagittal slices will better preserve the three-dimensional arrangement of SVZ cells, particularly the stream of neuroblast migration on the rostral-caudal axis.
Here, we describe methods to prepare sagittal sections containing the SVZ, the loading of SVZ cells with calcium indicator dye, and the acquisition of calcium activity with time-lapse movies. We used Fluo-4 AM dye for loading SVZ astrocytes using pressure application inside the tissue. Calcium activity was recorded using a scanning confocal microscope allowing a precise resolution for distinguishing individual cells. Our approach is applicable to other neurogenic zones including the adult hippocampal subgranular zone and embryonic neurogenic zones. In addition, other types of dyes can be applied using the described method.

A method to load subventricular zone (SVZ) cells with calcium indicator dyes for recording calcium activity is described. The postnatal SVZ contains tightly packed cells including neural progenitor cells and neuroblasts. Rather than using bath loading we injected the dye by pressure inside the tissue allowing better dye diffusion.

Vorbereitung der akuten Subventrikulärzone Slices für Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo Zubereitungen der Intact Vomeronasalorgan und akzessorischen olfaktorischen Bulbus

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments that largely determines the quality of results. It has been shown that omitting the cooling step during cutting procedure is beneficial in obtaining healthy slices and cells, especially when dealing with highly myelinated brain structures from mature animals. Even though the precise mechanism whereby elevated temperature supports neural health can only be speculated upon, it stands to reason that, whenever possible, the temperature in which the slicing is performed should be close to physiological conditions to prevent temperature related artifacts. Another important advantage of this method is the simplicity of the procedure and therefore the short preparation time. In the demonstrated method adult mice are used but the same procedure can be applied with younger mice as well as rats. Also, the following patch clamp experiment is performed on horizontal cerebellar slices, but the same procedure can also be used in other planes as well as other posterior areas of the brain.

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

Slice It Hot: Akute erwachsenen Gehirn Slicing in physiologischen Temperatur

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...