Der Großteil der Arbeit und die beteiligten Mitarbeiter wurden von NIH Zuschusses NS060677 und teilweise durch NIH gewährt MH099559 und MH104069 (BSK) unterstützt. Ein Teil der Arbeit wurde auch von der CHDI Foundation unterstützt.

Alle Tier Protokolle waren in Übereinstimmung mit den US National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der UCLA genehmigt. 1.1) Bereiten Mikropipette und AAV2 / 5 Virus Loading <ol><li> Verwenden Fein Borsilikatglas-Mikropipetten für die Injektion des Virus. Ziehen die Mikropipette unter Verwendung eines zweistufigen Zieh Programm mit einer vertikalen Magnet. Kegel die Pipette in einem Winkel von 40 ° unter Verwendung einer Pipette Mühle. Die Pipette, die ideal für den Einsatz ist wird einen Spitzendurchmesser von 20 bis 40 um und eine Schaftlänge von 6 - 7 mm. Autoklavieren der Pipette und chirurgische Instrumente. Der Bohrer wird durch Abwischen mit 70% Ethanol sterilisiert. </li><li> Speichern des Virus AAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1,5 x 10 13 gc / ml), bei -80 ° C in 10 &amp; mgr; l Aliquots. Kurz vor der Operation, nehmen Sie die Aliquots aus dem Gefrierfach und Lagerung auf Eis, bis zum Füllen th verwendete-Mikropipette. </li><li> Füllen Sie die Mikropipette mit Virus mit einer Spritzenpumpe. Dicht verbinden Sie ein Ende eines Rohrstück, durch einen entsprechend dimensionierten Rohr Klemmverschraubung, auf eine Glasspritze mit einem verstärkten Kolben. Befestigen Sie die autoklaviert Mikropipette mit dem anderen Ende des Rohrstück durch einen entsprechend dimensionierten abnehmbare Nadelklemmfitting. </li><li> Vor dem Beladen des viralen Vektor, entfernen Luftblasen aus dem Pumpsystem einschließlich Schlauch, Spritze und Mikropipette durch Befüllen des Systems mit Mineralöl mit Sudanrot IV (~ 1 mg / 50 ml) in einer 1-ml-Spritze mit einer Nadel gefärbt (27 G ). </li><li> Ein sauberes Stück Parafilm unter der Glas-Mikropipette, und Abgeben von 5 bis 10 &amp; mgr; l der Virusvektors auf die Parafilm. </li><li> Saugen den viralen Vektor, der durch Bewegen des Kolbens der Spritze nach hinten in 0.5 &amp; mgr; l / min, und markieren die Grenze zwischen dem Vektor und dem Öl auf der Glaspipette. </li></ol> 1.2) Anästhesie, Haarschneide, Head Fixierung und Vorbereitung zur Kraniotomie <ol><li> Eine Maus (P49-63, C57BL / 6) in die Kammer mit N 2 O und O 2 und 5% Isofluran gefüllt. Beurteilen Sie die Narkosetiefe durch den Verlust der zielBewegung und einer verlangsamte Atemfrequenz (~ 60-90 / min). Schneiden Sie Haare auf dem Kopf, wenn die Maus betäubt. </li><li> Setzen Sie die Maus in die stereotaktischen Rahmen, mit seinem Kopf durch stumpfe Ohr Bars und seine Nase in eine Anästhesie- und Beatmungssystem platziert gesichert. Pflegen kontinuierliche Isofluran bei 2 - 3%. Künstliche Tränen Salbe auf beiden Augen, da Mäuse verlieren ihre Lidschlussreflexes unter Narkose. </li><li> Verwalten 0,05 ml Buprenorphin (0,1 mg / ml) durch subkutane Injektion zur Schmerzlinderung. </li><li> Sauberen Operationsbereich mit 10% Povidon-Jod und 70% Alkohol dreimal abwechselnd zwischen den beiden Lösungen besteht und mit Povidon-Iod. Starten Sie von vorne und wischen nach hinten, um alle bereits geschnittenen Haare zu entfernen. </li><li> Machen Sie eine Hautschnitt an der Spitze of der Kopf, der zwischen den Augen beginnt und endet zwischen den Ohren. </li></ol> 1.3) Kraniotomie und Mikroinjektionen <ol><li> Entfernen Sie die Knochenhaut durch Streichen mit einem Wattestäbchen und dann trocknen Sie die Oberfläche des Schädels mit Zahnwattebällchen. Machen Sie eine Markierung an der Injektionsstelle, und bohren um den Rand der Marke mit einem kleinen Stahl Grat angetrieben von einem High-Speed-Bohrer. </li><li> Entfernen Sie die Knochen und reinigen Sie die Oberfläche mit Kochsalzlösung. </li><li> Platzieren Sie die Pipette in die linke Rücken seitlich mit den folgenden Koordinaten (mm) Striatum: anterior-posterioren 0,8, medial-lateral: 2,0, dorsal-ventrale vom Pia-Oberfläche: -2,4 13. Beachten Sie, dass diese Koordinaten bedeutet, dass die Spitze der Mikroinjektionsnadel sitzt direkt über dem dorsolateralen Striatum (1A, B), was bedeutet, dass er nur geringfügig innerhalb dieses Kerns eindringt. Vermeiden schädlicher Blutgefäße. Wenn die Pipette passiert zu sein Recht auf ein Blutgefäß, leicht einzustellen dasKoordinaten von ~ 0.1 - 0.2 mm. </li><li> Starten Einspritzung mit Einspritzrate bei 0,2 ml / min eingestellt, und in der Regel zu injizieren 1 bis 1,5 &amp; mgr; l-Virus. </li><li> Verlassen Sie die Pipette anstelle nach der Injektion für 10 Minuten, und dann langsam zurückziehen der Pipette. </li><li> Beenden Sie durch Schließen der Operationswunde mit fortlaufenden Naht externen Nylonnaht. </li></ol> 1.4) Wiederherstellung <ol><li> Setzen Sie die Maus in einem sauberen Käfig auf einem Heizkissen für 24 Stunden. Sie eine Maus, die Operation, um der Gesellschaft von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück. Lassen Sie die Maus unbeaufsichtigt, bis es ausreichend das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten. </li><li> In Trimethoprim Sulfamethoxiazole (5 ml pro 500 ml Wasser, das 40 mg Trimethoprim und 200 mg sulfamethoxiazole) im Wasser für eine Woche. Verwaltung Buprenorphin zweimal pro Tag für bis zu 3 Tage nach der Operation. </li><li> Pflegen Sie die Maus auf einem 12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus, gefüttert und täglich bewässert, einnd wird einmal pro Tag bis zu 3 Tage nach der Operation gewichtet. In diesen 3 Tagen wird jede Maus mit einem Verlust von mehr als 10% Körpergewicht gelten als gefährdet und werden anstatt an Versuchen unterworfen eingeschläfert werden. </li><li> Getrennt, ändern Sie die Maus Käfig zweimal pro Woche, und mindestens einmal pro Tag zu überwachen für die allgemeine Gesundheit. 3 Wochen nach der stereotaktischen Mikroinjektionen - Typischerweise wird die Maus innerhalb von 2 verwendet. </li></ol> 2. akuten Hirnschnittpräparat für die konfokale Ca 2+ Imaging 2.1) Herstellung von Schnitt- und Recording Solutions. <ol><li> Vorbereitung Schneid Lösung aus (mM): 194 Sucrose, 30 NaCl, 4.5 KCl, 10 D-Glucose, 1 MgCl 2, 1,2 NaH 2 PO 4 und 26 NaHCO 3, mit 95% O 2 und 5% CO 2 gesättigt. </li><li> Vorbereitung Aufzeichnungslösung, umfassend (mM): 124 NaCl, 4,5 KCl, 1 MgCl 2, 10 D-Glucose, 2 CaCl 2, 1,2 NaH 2 PO 4 </sub&gt; und 26 NaHCO 3; pH 7,3 bis 7,4, 290 bis 295 mOsm, mit 95% O 2 und 5% CO 2 gesättigt. Füllen Sie den Hirnschnitt hält Becher mit Aufzeichnungslösung, und halten Sie sie bei 34 ° C. </li></ol> 2.2) Slicing <ol><li> Zwei bis drei Wochen nach der stereotaktischen Mikroinjektionen, tief und unheilbar betäuben die Maus und dann enthaupten es. </li><li> Extrahieren Sie das Gehirn, und verwenden Sie ein Messer, um die injizierten rechten Hemisphäre zu entfernen, und montieren Sie die linke auf die Vibratom Tablett mit Superkleber. Füllen Sie den Vibratom Tablett mit eiskaltem Schneid Puffer und halten sättigt sie mit 95% O 2 und 5% CO 2. </li><li> Schneiden koronaler oder sagittaler striatalen Hirnschnitten bei 300 &amp; mgr; m Dicke. Normalerweise 4-5 koronalen oder 6 - 7 können sagittale striatalen Scheiben gesammelt werden. </li><li> Übertragen Sie die Scheiben auf die Scheibe Holdingbecher erwärmt bei 34 ° C, und es halten sie für 30 Minuten vor dem Ablegen bei Raumtemperatur für nachfolgende recording. </li><li> Inkubieren der Hirnschnitten in oxygenierten Aufzeichnungspuffer bei Raumtemperatur für mindestens 30 min vor der [Ca 2+] i-Bildgebung. </li></ol> 3. Immunhistochemie (IHC) <ol><li> Zwei Wochen nach Virusinjektion, perfuse die Maus transkardial mit PBS, gefolgt von 10% Formalin in PBS. </li><li> Entfernen, post-fix über Nacht, und cryoprotect das Gehirn in gepufferten 30% Saccharose für mindestens 2 Tage. </li><li> Bereiten Sie 40 um Abschnitte mit einem Kryostat-Mikrotom. </li><li> Spülen Sie den Abschnitten 3 mal mit PBS bei 10 min-Intervall. </li><li> Abschnitte Inkubation für 1 h in PBS mit 10% normalem Ziegenserum und 0,5% Triton X-100. </li><li> Abschnitte über Nacht Inkubation bei 4 ° C in primären Antikörpers in PBS mit 0,5% Triton X-100 hergestellt. Die primären Antikörper verwendet wurden, waren wie folgt: Huhn anti-GFP 1: 1.000, Maus anti-S100β 1: 400, Maus-anti-NeuN 1: 600, Maus-Anti-Glutamin-Synthetase 1: 300. </li><li> Spülen Sie den Abschnitten 3 mal mit PBS auf 10 min Intervallen. </li><li> Inkubieren Abschnitte mit den sekundären Antikörpern in PBS mit 10% normalem Ziegenserum für 2 Stunden bei Raumtemperatur hergestellt. Der zweite Antikörper waren wie folgt: Ziege anti-Maus Alexa546 1: 500, Ziege-Anti-Huhn Alexa488 1: 500. </li><li> Montieren Sie die Teile auf Glasobjektträger, trocken und mehrere Tropfen Antifade Eindeckmediums, dann langsam decken die Schnitte mit einem Deckglas. Lagern Sie die Folien bei 4 ° C. </li><li> Nehmen Bilder auf einem konfokalen Mikroskop mit einem 40x-Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,3. </li></ol> 4. Die konfokale [Ca 2+] i Imaging HINWEIS: [Ca 2 +] i-Bildgebung erfolgte mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 40x Wasserimmersionsobjektivlinse mit einer numerischen Apertur von 0,8. <ol><li> Zwischen 1 und 5 Stunden nach dem Schneiden, Ort Scheibe im Aufnahmeraum und superfuse mit sauerstoffAufzeichnungsPuffer bei Raumtemperatur mit Durchflussrate von 1-2 ml proMinute Dann legen Sie eine Platin Harfe mit Nylonsaiten auf der Oberseite der Scheibe, um die Bewegung während des Experiments zu minimieren. </li><li> Visualisieren und suchen Sie das dorsale Striatum mit Hellfeld Lumineszenz unter einem 10X Wasserimmersionsobjektiv. </li><li> Wechseln Sie auf die 40X Wasserimmersionsobjektiv Objektiv, und schalten Sie den 488-nm-Linie des Argon-Laser. Durch die Veränderung der Brennebene, finden Zellen etwa 20 &amp; mgr; m unterhalb der Scheibenoberfläche befindet, zeigt basale Fluoreszenz in Soma, Niederlassungen und Zweigstellen. Zu beachten ist, kompromittiert Zellen zeigen meist Fluoreszenzniveau über dem Durchschnitt, die vermieden werden sollten. </li><li> Verwenden Sie Modus &#39;Bildabtastintervalle&#39;, um das Scannen zu starten. Üblicherweise wird die Laserintensität auf 0,5 eingestellt - 5% des maximalen Ausgangs ausreicht, um Bild [Ca 2+] i mit Zyto-GCaMP3. Zur Überwachung [Ca 2+] i Dynamik im gesamten Gebiet der Astrozyten ist die &quot;Rahmenscan &#39;mit einer Abtastrate von 1 Sekunde pro Frame oder schneller EMPFEHLUNDED, aber das muss je nach Experiment in Frage entschieden werden. </li><li> Wenn nötig, um die Bild [Ca 2+] i in Prozessen verwenden digitale Vergrößerung von 2 - 3 fach zu überwachen 1-2 Astrozyten im gesamten Sichtfeld. </li><li> Zu gesättigten Pixel bei einer Aufnahme zu vermeiden, verwenden Lookup-Modus &quot;Hilo&quot;, um die Zellen Pseudocolor. Immer mit einem &quot;Pilot Aufnahme&quot; für ca. 5 min zu starten, um zu testen, ob rote Farbe erscheint als Hinweis auf Sättigung. Wenn dem so ist, senken Sie die Laserausgangsleistung, oder senken Sie die PMT / Gain / Offset-Werte und führen Sie eine weitere Pilotaufzeichnung zu testen die Pixelwerte im nicht gesättigten Bereich. Typischerweise für die Bildgebung Astrozyten verwendet die kombinierten Parameter [Ca 2+] i im Striatum sind wie folgt: Laserausgangsleistung von 0,5 bis 5% (von 10 mW), PMT 550-650 Volt, Gewinn 2,0 - 3.5X und Offset 0 - 5%. </li></ol>

<ol>
	<li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology.">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li><li>Khakh, B. S., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromodulation+by+extracellular+ATP+and+P2X+receptors+in+the+CNS.">Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS.</a> Neuron. 76, 51-69 (2012).</li><li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP.">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li><li>Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-derived+adenosine+and+A1+receptor+activity+contribute+to+sleep+loss-induced+deficits+in+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory+in+mice.">Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice.</a> J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O'Dell, T. J., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA1+channels+are+regulators+of+astrocyte+basal+calcium+levels+and+long-term+potentiation+via+constitutive+D-serine+release.">TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release.</a> J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).</li><li>Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+and+astrocyte+calcium+microdomains.">Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains.</a> Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).</li><li>Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+near+plasma+membrane+and+global+intracellular+calcium+dynamics+in+astrocytes.">Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes.</a> J Vis Exp. 26, (2009).</li><li>Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+loading+of+calcium+indicator+dyes+to+study+astrocyte+physiology:+key+limitations+and+improvements+using+morphological+maps.">Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps.</a> J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).</li><li>Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+investigating+astrocyte-to-neuron+communication.">New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).</li><li>Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+molecular+approaches+to+understanding+astrocyte+function+in+vivo.">Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo.</a> Front Cell Neurosci. 7, 272 (2013).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2012).</li><li>Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+astrocyte+activation+modulates+response+selectivity+of+visual+cortex+neurons+in+vivo.">Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo.</a> Nat Commun. 5, 3262 (2014).</li><li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+biology+and+pathology.">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).</li><li>Eid, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+glutamine+synthetase+in+the+human+epileptogenic+hippocampus:+possible+mechanism+for+raised+extracellular+glutamate+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Lancet. 363, 28-37 (2004).</li><li>Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+and+astrocytes--key+players+in+human+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Glutamate and astrocytes--key players in human mesial temporal lobe epilepsy.</a> Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).</li><li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+Kir4.1+ion+channel+deficits+contribute+to+neuronal+dysfunction+in+Huntington's+disease+model+mice.">Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice.</a> Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).</li><li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition.">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li><li>Zhang, Y., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity:+an+underappreciated+topic+in+neurobiology.">Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology.</a> Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).</li><li>Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+transgene+expression+after+intrastriatal+pseudotyped+rAAV2/1,+rAAV2/2,+rAAV2/5,+and+rAAV2/8+transduction+in+the+rat.">Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat.</a> Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die hier beschriebenen Verfahren haben uns erlaubt, Zyto-GCaMP3 in striatalen Astrozyten in vivo für die anschließende [Ca 2+] i-Bildgebung in situ auszudrücken. Dieses Verfahren hat Vorteile gegenüber der Verwendung von transgenen oder Knockout-Mäusen, wie robust der Expression des Zielproteins, Geschwindigkeit und Flexibilität der experimentellen Durchführung und anatomischen Besonderheiten. Der Ausdruck GCaMP3 mit AAV2 / 5 wurde als spezifisch und robust. Die Kombination...

Astrozyten sind allgegenwärtig und reichlich Gliazellen des Gehirns. Es ist gut bekannt, dass Astrozyten dienen wichtige Unterstützung und homöostatischen Rollen einschließlich Pufferung der K + -Konzentration in den extrazellulären Raum, Aufnahme von Neurotransmittern sowie Bereitstellung von Nährstoffen. Neuere Studien zeigen jedoch, dass sie [Ca 2+] i-Signale, die spontan auftreten und werden durch neuronale Aktivität 1 erhöht zeigen auch. Die Existenz von Astrocyten [Ca 2+] i-Signalisierung wurde immer angenommen, dass die Kommunikation mit den Neuronen auslösen, und hat als solche als eine Form von &quot;Ca 2+ Erregbarkeit&quot; in Astrozyten interpretiert. Die verfügbaren Daten über die letzten zwei Jahrzehnte deuten zwei Einstellungen in dem Astrozyten und Neuronen kommunizieren kann, vielleicht in einer bidirektionalen Art und Weise. Ersten, Astrozyten reagieren häufig mit einer Zunahme der [Ca 2+] i, wenn sie von Neurotransmittern und AktivNeuromodulatoren von Neuronen 2 veröffentlicht. Zweitens [Ca 2+] i steigt innerhalb Astrozyten bewirken die Freisetzung von Signalmolekülen aus Astrozyten, die wiederum Nervenzellen und Blutgefäße beeinflussen. Hinweise darauf, dass Moleküle aus Astrozyten Freigabe über Astrozyten-to-Neuron Signalisierungs Änderungen in den Funktionen der Synapsen, Schaltungen und schließlich 3-5 Verhalten führen. Allerdings bleibt diese eine sich schnell entwickelnde Forschungsgebiet, und es wurde argumentiert, dass eine bessere und detailliertes Verständnis der Astrozyten [Ca 2+] i wird benötigt, um einige der derzeitigen Unsicherheiten 6 lösen. In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass das Laden von mehreren organischen Ca 2+ Indikatorfarbstoffe in Astrozyten nicht zuverlässig zu erfassen [Ca 2+] i-Signale innerhalb gesamte Astrozyten in der Kultur und in situ 7-10. Diese Ergebnisse wurden von uns und anderen 6,11,12 diskutiert. Die Emerging Bild ist, dass [Ca 2+] i-Signale innerhalb Astrozyten Verfahren (zum Beispiel, Zweige und Ästchen), die die primären Standorte für Interaktionen mit Neuronen und Blutgefäße sind, haben nur selten im Detail erforscht. Vor kurzem hat die Anwendung genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren (GeCIS) wie zytosolischen GCaMP3, GCaMP5G und GCaMP6 und Plasmamembran tethered Versionen (zB Lck-GCaMP3) hat das Studium der [Ca2 +] i-Signale in kleine Fächer von Astrozyten wie erlaubt so dünn Prozesse, in der Nähe der Plasmamembran und im gesamten Hoheitsgebiet zu 7,8. Allerdings GeCIS einen Nachteil gegenüber organischen Ca 2+ Indikatorfarbstoffe und das ist die Voraussetzung für genetische Methoden, um die kodierenden Gene selektiv Astrozyten in vivo für Zeiträume von Wochen zu liefern für die GeCIS angemessen sein ausgedrückt. Expression in vivo wird typischerweise unter Verwendung von transgenen Mäusen erreicht, knock-in Mäuse oder mit Virus basierte Auslieferung AppKakerlaken. In der vorliegenden JoVE Artikel berichten wir Methoden und Verfahren eingesetzt, um GeCIS zu striatalen Astrozyten mit Adeno-assoziierten Viren liefern. Wir konzentrieren uns auf Cyto-GCaMP3 als ein Beispiel, aber die gleichen grundlegenden Verfahren funktioniert für jede andere GECI oder fluoreszierendes Protein basierten Reporter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Capillaries</td>
			<td >World Precision Instruments</td>
			<td >1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette puller</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette grinder</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >EG-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3</td>
			<td >Addgene</td>
			<td>44331</td>
			<td >a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >I mL syringe</td>
			<td >BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >syringe needle</td>
			<td >BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AAV2/5 virus</td>
			<td >UPenn vector core</td>
			<td >NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sudan red IV</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >67386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mineral oil</td>
			<td >CVS Pharmacy</td>
			<td>152355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryostat</td>
			<td >Leica</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereotaxic instrument</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td >900LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Speed Rotary Micromotor Kit</td>
			<td >FOREDOM</td>
			<td >K.1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Santa cruz biotechnology</td>
			<td >sc-281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Super Glue</td>
			<td>Krazy&#174;Glue</td>
			<td>KG925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microslicer</td>
			<td >Ted Pella</td>
			<td >DTK-Zero 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Confocal microscopes</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >FV300 and FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal goat serum</td>
			<td >Vector</td>
			<td >S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >chicken anti-GFP</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >ab13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse anti-s100&#946;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >S2532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse anti-NeuN</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >MAB377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse anti-glutamine synthetase</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >MAB302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat anti-mouse-Alexa546</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A11003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat anti-chicken-Alexa488</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slides</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cover Glass</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-548-5J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mounting Medium</td>
			<td >Vector</td>
			<td >H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging intracellular ca2+ signals in striatal astrocytes from adult mice using genetically-encoded calcium indicators

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

Für Astrozyten spezifische Expression von Cyto-GCaMP3 im Striatum, verwendeten wir Adeno-assoziierten Virus (AAV) des Serotyp 5 und die GFAP GfaABC 1 D-Promotors (1A), die zuvor gezeigt wurde, robuste und GCaMP3 Reportergen fahren Expression in hippokampalen und kortikalen Astrozyten 8,14. Zwei Wochen nach der Virusmikroinjektion in die Maus-Striatum wurde die Maus (~ 10 Wochen alt) perfundiert und IHC auf dünnen Hirnschnitten durchgeführt, um Cyto-GCaMP3 Expression im Striatum ...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators at JoVE.com

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.

Abbildungsintrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in Striatal Astrozyten von erwachsenen Mäusen mit gentechnisch-kodierte Kalzium Indikatoren

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

imaging-intracellular-ca2-signals-striatal-astrocytes-from-adult-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

14.7K Aufrufe.  University of California Los Angeles. The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ. 

Serie: Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Imaging neuronalen Antworten in Scheiben Zubereitungen von Vomeronasalorgan Ausdruck eines genetisch kodierte Kalzium-Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Forschung

Neurowissenschaften

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

Gleichzeitige Aufnahme von Calcium-Signale von identifizierten Neuronen und Fressverhalten von Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Modellierung Astrozytom Pathogenese<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt; Verwenden kortikale Astrozyten oder neuralen Stammzellen aus dem Bedingten, gentechnisch veränderte Mäuse

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate goal is to image neuronal activity in vivo, one must be able to image activity of a single cell to ensure successful in vivo preparations. This procedure will describe how to image membrane potential in a single cell to provide a foundation to eventually image in vivo. Here we describe methods for imaging GEVIs consisting of a voltage-sensing domain fused to either a single fluorescent protein (FP) or two fluorescent proteins capable of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) in vitro. Using an image splitter enables the projection of images created by two different wavelengths onto the same charge-coupled device (CCD) camera simultaneously. The image splitter positions a second filter cube in the light path. This second filter cube consists of a dichroic and two emission filters to separate the donor and acceptor fluorescent wavelengths depending on the FPs of the GEVI. This setup enables the simultaneous recording of both the acceptor and donor fluorescent partners while the membrane potential is manipulated via whole cell patch clamp configuration. When using a GEVI consisting of a single FP, the second filter cube can be removed allowing the mirrors in the image splitter to project a single image onto the CCD camera.

A method for imaging changes in membrane potential using genetically encoded voltage indicators is described.

Imaging Membrane Potential mit zwei Arten von genetisch kodierten Fluorescent Spannungssensoren

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Optische Kontrolle eines Neuronal Protein eine genetisch kodierter unnatürliche Aminosäure in Neurons Verwendung

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

Dissektion der lokalen Ca2 + Signale in kultivierten Zellen durch die Membran-gezielte Ca2 + Indikatoren

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other neurodegenerative disorders, this independence might be compromised due to insufficient glutamate clearance and the resulting spill-in and spill-out effects. Altered astrocytic coverage of the presynaptic terminals and/or dendritic spines as well as a reduced size of glutamate transporter clusters at glutamate release sites have been implicated in the pathogenesis of diseases resulting in symptoms of dys-/hyperkinesia. However, the mechanisms leading to the dysfunction of glutamatergic synapses in HD are not well understood. Improving and applying synapse imaging we have obtained data shedding new light on the mechanisms impeding the initiation of movements. Here, we describe the principle elements of a relatively inexpensive approach to achieve single synapse resolution by using the new genetically encoded ultrafast glutamate sensor iGluu, wide-field optics, a scientific CMOS (sCMOS) camera, a 473 nm laser and a laser positioning system to evaluate the state of corticostriatal synapses in acute slices from age appropriate healthy or diseased mice. Glutamate transients were constructed from single or multiple pixels to obtain estimates of i) glutamate release based on the maximal elevation of the glutamate concentration [Glu] next to the active zone and ii) glutamate uptake as reflected in the time constant of decay (TauD) of the perisynaptic [Glu]. Differences in the resting bouton size and contrasting patterns of short-term plasticity served as criteria for the identification of corticostriatal terminals as belonging to the intratelencephalic (IT) or the pyramidal tract (PT) pathway. Using these methods, we discovered that in symptomatic HD mice ~40% of PT-type corticostriatal synapses exhibited insufficient glutamate clearance, suggesting that these synapses might be at risk to excitotoxic damage. The results underline the usefulness of TauD as a biomarker of dysfunctional synapses in Huntington mice with a hypokinetic phenotype.

We present a protocol to evaluate the balance between glutamate release and clearance at single corticostriatal glutamatergic synapses in acute slices from adult mice. This protocol uses the fluorescent sensor iGluu for glutamate detection, a sCMOS camera for signal acquisition and a device for focal laser illumination.

Einzelne Synapsenindikatoren für Glutamatfreisetzung und Aufnahme in akuten Gehirnscheiben von normalen und Huntington-Mäusen

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in brain homeostasis, astrocytes supply neurons with vital metabolites and buffer extracellular water, ions, and glutamate. An integral component of the &#8220;tri-partite&#8221; synapse, astrocytes are also critical in the formation, pruning, maintenance, and modulation of synapses. To enable these highly interactive functions, astrocytes communicate among themselves and with other glial cells, neurons, the brain vasculature, and the extracellular environment through a multitude of specialized membrane proteins that include cell adhesion molecules, aquaporins, ion channels, neurotransmitter transporters, and gap junction molecules. To support this dynamic flux, astrocytes, like neurons, rely on tightly coordinated and efficient intracellular transport. Unlike neurons,&#160;where intracellular trafficking has been extensively delineated, microtubule-based transport in astrocytes has been less studied. Nonetheless, exo- and endocytic trafficking of cell membrane proteins and intracellular organelle transport orchestrates astrocytes&#8217; normal biology, and these processes are often affected in disease or in response to injury. Here we present a straightforward protocol to culture high quality murine astrocytes, to fluorescently label astrocytic proteins and organelles of interest, and to record their intracellular transport dynamics using time-lapse confocal microscopy. We also demonstrate how to extract and quantify relevant transport parameters from the acquired movies using available image analysis software (i.e., ImageJ/FIJI) plugins.

Here we describe an in vitro live-imaging method to visualize intracellular transport of organelles and trafficking of plasma membrane proteins in murine astrocytes. This protocol also presents an image analysis methodology to determine cargo transport itineraries and kinetics.

Visualisierung und Analyse des intrazellulären Transports von Organellen und anderen Ladungen in Astrozyten

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.

Minimierung der Hypoxie in Hippocampal Scheiben von erwachsenen und alternden Mäusen

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.