Ringraziamo Andrea Moran insieme con i membri del Centro di Assistenza Animal Lab (LASF) a Stowers Institute per il loro supporto eccellente per la zootecnia e dei servizi tecnici. Questo lavoro è supportato da un finanziamento Stowers Institute e il NIH (dell&#39;NIDCD 008.003) a piangere. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institute on Deafness e altri disturbi della comunicazione o il National Institutes of Health. Usa in attesa di brevetto per il Teto-G-CaMP2 topi per Stowers Institute, CRY e LM.

1. Soluzione preparazione <ol><li> Preparare R1 10X, 10X e 10X R2 R3 soluzioni in base alla tabella. R1 <table border="1"><tbody><tr><td> Prodotti chimici </td><td> MW (g / mol) </td><td> mM (1X) </td><td> Magazzino 10X (g / L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,44 </td><td> 125 </td><td> 73,05 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,55 </td><td> 2,5 </td><td> 1,86 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M magazzino </td><td> 1 </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> 147,02 </td><td> 2 </td><td> 2,94 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 · H 2 O </td><td> 137,99 </td><td> 1,25 </td><td> 1,72 </td></tr></tbody></table> R2 <table border="1"><tbody><tr><td> Chimico </td><td> MW (g / mol) </td><td> mM (1X) </td><td> Magazzino 10X (g / L) </td&gt; </tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84,01 </td><td> 25 </td><td> 21 </td></tr></tbody></table> R3 <table border="1"><tbody><tr><td> Prodotti chimici </td><td> MW (g / mol) </td><td> mM (1X) </td><td> Magazzino 10X (g / L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,44 </td><td> 125 </td><td> 73,05 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,55 </td><td> 2,5 </td><td> 1,86 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M magazzino </td><td> 2 </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> 147,02 </td><td> 2 </td><td> 2,94 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1 M magazzino </td><td> 5 </td><td> 50 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Fare 1 litro di topo artificiale liquido cerebro-spinale (mACSF) il giorno dell&#39;esperimento mescolando 100 ml di R1 10X e 100 ml di R2 10X in acqua bidistillata (DDW) e add 1,8 g di destrosio (finale 10 mM). Questo metodo di preparazione impedisce la precipitazione di carbonato di calcio a pH elevati. L&#39;osmolarità di mACSF è di circa 310-315 mOsm / L. Regolare l&#39;osmolarità con destrosio o acqua se necessario. Aerare la soluzione con Carboxygen gas (95% di ossigeno e anidride carbonica del 5%) per almeno 30 minuti prima di regolare il pH della soluzione a 7,2-7,4. </li><li> Fare 1 litro di soluzione di Ringer, il giorno dell&#39;esperimento mescolando 100 ml di R2 10X e 100 ml di R3 10X in DDW e aggiungere 1,8 g di destrosio (10 mM). L&#39;osmolarità e pH della soluzione di Ringer dovrebbero essere simili a quelle del mACSF. Aerare la soluzione con gas Carboxygen. </li><li> Preparare 4% a bassa fusione agarosio (LMA), in entrambe le mACSF o soluzione di Ringer. Aliquota l&#39;agarosio fuso in tubi eppendorf e conservare a 4 ° C fino all&#39;uso. LMA, che si compone di polisaccaride purificato, rimane fluido a 37 ° C e solidifica rapidamente a temperature inferiori a 25 ° C. Queste proprietà lo rendono ideale per l&#39;incorporamento VNO e la fisiologia dei tessuti vivi. Altri materiali impuri, come agar, non dovrebbe essere la scelta per l&#39;esperimento tessuto vivo come componenti non caratterizzate può interferire con la risposta neuronale. </li><li> Preparare stimoli feromone in soluzione di Ringer. Per l&#39;urina del mouse, diluizione 1:100 dar luogo a risposte robuste. </li></ol> 2. Preparazione di fetta VNO <ol><li> Prima di sacrificare l&#39;animale, messo due tubi di LMA su un blocco di calore e impostare la temperatura a&gt; 60 ° C per sciogliere l&#39;agarosio. Una volta che il gel si liquefa, trasferire i tubi ad un blocco di 37 ° C di calore. </li><li> Decapitare un G-CaMP2 topo seguenti CO 2 l&#39;eutanasia. Tagliare le ossa della mandibola con le forbici per rimuovere la mascella inferiore. Staccare il tessuto increspato palato superiore per esporre la cavità nasale (Figura 1A). Separare le mandibole con l&#39;inserimento di una lama chirurgica tra i due incisivi davanti. Rimuovere con attenzione la mascella per esporre VNO. A questo punto, il VNO intero può essere elevato da ncavità Asal tenendo sul coccige (Figura 1B). Trasferire il VNO al freddo soluzione ossigenata mACSF immediatamente. </li><li> In ambito dissezione, separare i due VNOs utilizzando la punta del # 5 pinze dolcemente scivolare lungo la parete di osso settale (Figura 1C). Sbucciare via l&#39;osso vomere che avvolge il tessuto VNO. Sollevare delicatamente tutto il tessuto VNO dalla cavità ossea. Estrema cura deve essere presa in questa fase non danneggiare il neuroepitelio. Piccoli frammenti ossei lasciati sulla superficie del tessuto deve essere rimosso completamente prima di incorporamento. Frammenti lasciati sul tessuto può essere catturato dalla lama di taglio per tirare il tessuto fuori del blocco di agarosio. </li><li> Utilizzare le pinze per tenere la fine posteriore del tessuto VNO e delicatamente immergere nel fuso agarosio (Figura 1D). Rapidamente raffreddare la provetta in ghiaccio per solidificare l&#39;agarosio. Il processo di inclusione e di raffreddamento dovrebbe prendere meno di 2 minuti. </li><li> VF300 affettatrice tessuto (Precisionary Instrcumenti, Greenville, Carolina del Nord) è usato per fare sezioni. Tagliare il blocco di agarosio contenente il VNO in forma e incollarlo al titolare del tessuto (Figura 1E e F). Inserire il supporto del tessuto nel cilindro di metallo e riempire la camera restante con l&#39;aggiunta di LMA. Una volta che la LMA solidifica in ghiaccio, procedere al sezionamento immediatamente. Fornitura freddo mACSF ossigenata in camera di sezionamento e di iniziare a tagliare a 180-200 micron di spessore per fetta. Regolare la velocità di avanzamento e la frequenza di vibrazione in modo che il tessuto non viene compressa durante il sezionamento e VNO non si stacchi dal agarosio. Raccogliere e trasferire le fette sezionato per mACSF camera di incubazione (Figura 2A). Le fette sono vitali per 6-8 ore in mACSF ossigenata a temperatura ambiente. Figura 2B e C mostrano le immagini DIC e 2-fotone di un G-CaMP2 fetta VNO, rispettivamente. </li></ol> 3. Imaging camera di impostare <ol><li> Collocare la fetta VNO nel mezzo della perfusionecamera (Siskiyou, Grants Pass, OR) e tenere la fetta giù con una fetta di ancoraggio (Warner Instruments, Hamden, CT) (Figura 3A). I fili del tassello deve solo premere contro la parte LMA della fetta ma non il tessuto VNO. Ossigenato mACSF viene consegnato alla camera di perfusione attraverso la porta di ingresso a ~ 100 l / sec e il liquido viene drenato attraverso un ago di aspirazione tramite la porta di uscita per fornire un flusso continuo di nuove mACSF (Figura 3A e B). </li><li> Riempire una siringa da 30 ml con la soluzione di Ringer e bloccarlo alla pompa siringa (Nuovi sistemi di pompe di Era, Farmingdale, NY). Impostare la velocità della pompa di 300-600 microlitri / min per fornire un flusso continuo di soluzione di Ringer sulla fetta (Figura 3C). </li><li> Collegare l&#39;uscita della suoneria è l&#39;iniezione HPLC ad un loop (Chromtech, Apple Valley, MN) (Figura 3D). Dimensioni ciclo differenti possono essere selezionati per un controllo preciso del volume essere consegnati. Usiamo un loop 20 microlitri in oesperimenti di ur. Il controllo del ciclo di iniezione ha due percorsi di flusso (Figura 3E). Nella posizione &quot;carico&quot;, i campioni possono essere caricati nel ciclo del campione con una siringa di precisione Hamilton. Esce campione in eccesso il ciclo campione attraverso uscita dei rifiuti. Ringer iniettata dalla pompa siringa bypassa il ciclo del campione e va direttamente al punto vendita, che è collegata alla punta perfusione (Figura 3A ed E). Alla posizione di &quot;iniezione&quot;, la soluzione della pompa passa attraverso il ciclo di campionamento e spingere gli stimoli nella presa (Figura 3E). Prima l&#39;esperimento di imaging, le bolle d&#39;aria devono essere cacciati per garantire la fluidità del liquido di perfusione. Altri sistemi commerciali o custom iniezione fatto può anche essere implementato per la consegna stimolo. </li><li> Regolare la punta perfusione sotto una lente 5x o 10x in modo che la punta è di circa 1 mm di distanza dalla fetta VNO. </li><li> Quando un sistema di perfusione è nuova configurazione, si consiglia di misurare il tempo di ritardo del campione e durantezione con il colorante fluorescente. Carico colorante rodamina 6G 0,1% nel ciclo di campionamento e passare la valvola per iniettare posizione a 5 secondi dopo l&#39;inizio di acquisizione dell&#39;immagine (Figura 3F). Il segnale fluorescente viene rilevato tra i 10-30 secondi. La curva del segnale fluorescente indica anche che c&#39;è poca turbolenza generata sotto la lente immersione e perfusione adeguata ossigenazione mACSF raggiunge la fetta. </li></ol> 4. Passa il tempo di imaging <ol><li> Usiamo il microscopio Zeiss AxioSkope FS2 con un 10X o 20X acqua immersione lente per l&#39;imaging lasso di tempo. Standard GFP filtro passa-banda (450-490nm) viene utilizzato per G-CaMP2 segnali. Epifluorescente Le immagini vengono acquisite da una telecamera CCD (Zeiss HRM) con binning 1x1 o 2x2 a seconda del livelli di espressione di G-CaMP2. </li><li> Impostare la velocità di acquisizione di 1 fotogramma al secondo. Regolare l&#39;intensità della luce per minimizzare lo sbiancamento del G-CaMP2 segnali e danni alle cellule foto. Per ogni experiment, che normalmente acquistare un 60-stack frame di immagine (~ 60-70 secondi). Passa la valvola in posizione di iniezione in un dato momento (per esempio, 5 secondi nella figura 3F) per una serie di esperimenti per ottenere ritardo temporale coerente in tutti gli studi. </li><li> Eseguire una prova utilizzando la soluzione di Ringer come stimolo. Regolare nuovamente il setup perfusione se artefatto movimento è introdotto durante l&#39;iniezione del campione. </li><li> Eseguire un controllo positivo correre con l&#39;urina del mouse diluito 1:100 in una soluzione di Ringer. Il tipico massima ΔF / F valore di G-CaMP2 risposta alle urine del mouse è di circa 20-40%. Se necessario, si può confermare la vitalità della fetta offrendo 10 mM KCl in Ringer per stimolare le fette alla fine degli esperimenti. </li><li> Lavare la siringa Hamilton in soluzione di Ringer almeno tre volte dopo il caricamento di uno stimolo. Lavare il ciclo campione con una soluzione di Ringer almeno tre volte tra stimoli diversi. Questi passaggi prevenire la contaminazione crociata tra different campioni. </li><li> Attendere 4-10 min per il VSNs di recuperare prima di applicare lo stimolo successivo. </li></ol> 5. Analisi dei dati <ol><li> Eseguire la registrazione di immagini di tutte le immagini acquisite da una fetta. Usiamo un custom-written script VBA in AxioVision (Carl Zeiss, Nord America) per automatizzare questo processo. Tutti i telai immagine all&#39;interno lo stesso esperimento sono registrati nei confronti di un quadro comune di riferimento scelto con elastico di registrazione (Figura 4A). Elastico registrazione, noto anche come registrazione non lineare, è una categoria di tecnica dell&#39;immagine registrazione sottolineando la trasformazione di una immagine di destinazione non rigidamente ad un&#39;immagine di riferimento. Qui abbiamo usato l&#39;attuazione da AxioVision. Questa cornice di riferimento viene scelto arbitrariamente dalle pile immagine. </li><li> Eseguire la sottrazione delle immagini per identificare le cellule rispondono. Noi usiamo personalizzati macro scritte in ImageJ v1.42 ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> , NIH, Bethesda, MD) per automatizzare questo processo. Un&#39;immagine proiezione minima è generato per ogni stack. Le cellule rispondono emergono dopo la proiezione minima è sottratto dal stack prima (Figura 4B). </li><li> Identificare regione di interesse (ROI) dalle pile sottratto il ROI e ottenere coordinate con multimisura plugin da ImageJ. Processo tutti gli stack per un esperimento e salvare tutte le ROI coordinate in un elenco principale ROI (Figura 4C). </li><li> Utilizzare l&#39;elenco principale ROI per misurare le risposte delle cellule dai camini immagine grezza con scritte personalizzate macro e multimisura plugin da ImageJ (fig. 4D). Trama curve di risposta e heatmap in Matlab (Mathworks Inc., Natick, MA). </li></ol> 6. Rappresentante Risultati Un esempio di esperimento di imaging VNO utilizzando campioni di urina raccolti da quattro singoli topi è mostrato in Figura 5. La fetta risponde alla stimolazione delle urine con p diverseatterns di attivazione. Circa 80 le cellule sono identificate mostrando risposta ad almeno uno degli stimoli urine e la loro risposta ΔF / F sono riportati i valori nel heatmap (Figura 5A). Le tracce di risposta delle celle 1, 2 e 3 sono riportati in Figura 5B che mostra il tempo di attivazione del corso da stimoli urine. Cella 1 mostra la risposta ad entrambe le urine femminili, ma non i campioni maschi, mentre le cellule 2 mostra i modelli opposti di attivazione e risponde a entrambi i campioni di sesso maschile. Cella 3 è attivato da entrambi i campioni individuali maschili e femminili. Celle 1 e 2 mostrano la risposta caratteristica al sesso indicazioni specifiche nelle urine 15. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig1.jpg" /> Figura 1 Rappresentazione schematica del processo di dissezione VNO. A. La posizione anatomica del VNO nella testa del mouse. La testa di un G-CaMP2 mouse è stato sezionato ed è prevista a testa in giù con la t morbidoquestione rimossa dal palato per esporre il VNO. Ingresso mostra un&#39;immagine fluorescente della stessa immagine. Il neuroepithelia del VNO sono di colore verde brillante. B. Una vista laterale della VNO isolato che è racchiuso nelle ossa vomere (in alto) e l&#39;immagine fluorescente dello stesso VNO (in basso). C. Una vista coronale del VNO e dissezione processo. Un VNO è separato dal setto e l&#39;osso vomere può essere rimosso per districare il neuroepitelio. D. VNO è incorporato in LMA. E. Il blocco incorporato è incollato al titolare del tessuto per il sezionamento. Il titolare tessuto è avanzato a 180-200 micron per fetta spingendo il blocco agarosio dalla canna di metallo per il sezionamento. La lama di taglio è posizionato vicino al barile di metallo. Vista laterale F. del sistema VF300 tessuto affettatrice. BV, dei vasi sanguigni. NE, neuroepitelio. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2 fette VNO. fette A. VNO sono mantenuti in mACSF ossigenata a temperatura ambiente. DIC B. Una foto della fetta VNO. C. A 2-fotone immagine del VNO da G-CaMP2 mouse. Scala bar, 50 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig3.jpg" /> Figura 3 Illustrazione di perfusione di configurazione di sistema. A. Una camera di perfusione tipica con ingresso e uscita. Fetta VNO è posizionato nel centro della camera e premuto con un ancoraggio dei tessuti. I fili vengono rimossi dal mezzo l&#39;ancora del tessuto in modo che il tessuto VNO non è premuto. B. La camera di perfusione è posto sul palco microscopio nell&#39;ambito dell&#39;obiettivo immersione. Il mACSF entrata, uscita di aspirazione e punta perfusione sono indicati. C. Il singolo pompa siringa fornisce un flusso continuo di Ringer attraverso la punta di perfusione. D. Il inje HPLCsistema a ciclo ction è adottato per il carico utile del campione di stimolo e di iniezione. E. schematica illustrazione delle direzioni del flusso di carico e le posizioni di iniezione. Ringer, verde. Stimolo campione, magenta. Le frecce indicano la direzione del flusso. F. Delay e lavare misura del tempo del sistema di perfusione. Rodamina 6G colorante fluorescente viene caricato il ciclo del campione e la valvola è commutata in posizione di iniezione in seconda 5, che è indicato con una freccia. La variazione del segnale fluorescente viene rilevato tra 10-30 secondi e diminuisce in seguito. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig4.jpg" /> Figura 4 pipeline di elaborazione delle immagini. R. Tutti i frame di immagine per una fetta sono registrati nei confronti di un sistema di riferimento. B. Sottrazione di proiezione minima di una pila dai suoi telai prime. Le cellule rispondono diventata di primaria importanza dopo la sottrazione. C. RIO sono selezionati e le loro coordinate sono compilati nella lista principale. D. Misurazione delle cellule rispondono con elenco principale ROI dallo stack prime. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig5.jpg" /> Figura 5 A G-CaMP2 VNO rappresentante esperimento di imaging. R. La ΔF / F heatmap risposta da una fetta stimolato con i singoli urina maschili e femminili. I campioni di urina sono raccolti direttamente presso i singoli topi maschi e femmine. Asse X, rispondendo cellule identificate dalla fetta. Asse Y, campioni di urina utilizzati per l&#39;esperimento. Barra dei colori indica la ΔF / F valore. Corso B. tempo di risposta di 3 celle rappresentante segnato in A. Le frecce indicano il tempo di applicazione dello stimolo. F-FVB, femminile FVB, F-CBA, femminile CBA; M-FVB, maschio FVB; M-BL6, maschio C57BL / 6. Tabella di reagenti e attrezzature specifiche: <table border="1"><tbody><tr><td> Nome delreagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> camera di perfusione </td><td> Siskiyou </td><td> PC-H </td><td> orizzontale </td></tr><tr><td> fetta hold-down </td><td> Warner Instruments </td><td> SHD-22CL </td><td></td></tr><tr><td> perfusione porta titolare </td><td> ALA scientifica, Inc. </td><td> MPIOH-S </td><td></td></tr><tr><td> pompa siringa </td><td> Nuovi sistemi di pompe di Era, Inc. </td><td> NE-300 </td><td></td></tr><tr><td> valvola di iniezione a bassa pressione </td><td> Chromtech </td><td> V-451 </td><td></td></tr><tr><td> PEEK tubi </td><td> Chromtech </td><td> 1531 </td><td> 1 / 16 &quot;OD, 0,25 millimetri ID </td></tr><tr><td> PEEK campione ciclo </td><td> Chromtech </td><td> 1803 </td><td> 20 l </td></tr><tr><td> Hamilton siringa </td><td> Chromtech </td><td> 80630 </td><td> 100 ul </td></tr></tbody></table>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+three-dimensional+fluorescence+imaging+of+activity+in+neural+populations+by+objective-coupled+planar+illumination+microscopy.">Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy.</a> Neuron. 57, 661-672 (2008).</li><li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+I+peptides+as+chemosensory+signals+in+the+vomeronasal+organ.">MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ.</a> Science. 306, 1033-1037 (2004).</li><li>He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+signals+conveyed+by+pheromone+concentrations+to+the+mouse+vomeronasal+organ.">Distinct signals conveyed by pheromone concentrations to the mouse vomeronasal organ.</a> J. Neurosci. 30, 7473-7483 (2010).</li><li>Haga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+male+mouse+pheromone+ESP1+enhances+female+sexual+receptive+behaviour+through+a+specific+vomeronasal+receptor.">The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor.</a> Nature. 466, 118-122 (2010).</li><li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor.">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nat. Neurosci. 5, 1261-1262 (2002).</li><li>Hendel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+changes+of+genetic+calcium+indicators+and+OGB-1+correlated+with+neural+activity+and+calcium+in+vivo+and+in.">Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in.</a> 28, 7399-7411 (2008).</li><li>Pologruto, T. A., Yasuda, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+neural+activity+and+[Ca2+]+with+genetically+encoded+Ca2++indicators.">Monitoring neural activity and [Ca2+] with genetically encoded Ca2+ indicators.</a> J. Neurosci. 24, 9572-9579 (2004).</li><li>Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+a+genetically+encoded+optical+sensor+of+neural+activity+using+electrophysiology+in+intact+adult+fruit+flies.">Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies.</a> Front Neural Circuits. 1 (3), (2007).</li><li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La maggior parte dei recettori vomeronasale (VR) rimangono come recettori orfano fin dalla loro scoperta da parte Dulac e Axel 5. I ligandi feromone per questi recettori chemosensoriali e il loro ruolo nel mediare i comportamenti animali non sono ben compresi. Fino ad ora, solo un paio di ligando / recettore, il ESP1 peptide e il suo recettore, Vmn2r116 (V2Rp5), è stato identificato e indicato per trasmettere informazioni specifiche sociale 19,23. Un altro recettore, V1rb2, ha dimostrato di rispon...

imaging neuronal responses in slice preparations of vomeronasal organ expressing a genetically encoded calcium sensor

L&#39;organo vomeronasale (VNO) rileva i segnali chemosensoriali che portano informazioni sullo stato sociale, sessuale e riproduttiva degli individui all&#39;interno della stessa specie, 1,2. Questi segnali intraspecie, i feromoni, così come i segnali di alcuni predatori 3, attivare i neuroni sensoriali vomeronasale (VSNs) con alti livelli di specificità e sensibilità 4. Almeno tre distinte famiglie di proteine ​​G recettori accoppiati, V1R, V2R e FPR 5-14, vengono espressi nei neuroni VNO di mediare la rilevazione della spunti chemosensoriali. Per capire come le informazioni feromone è codificata dal VNO, è fondamentale per analizzare i profili di risposta di VSNs individuale a stimoli diversi e identificare i recettori specifici che mediano la risposta. Il neuroepithelia di VNO sono racchiusi in un paio di ossa vomere. Il semi-cieco struttura tubolare del VNO ha una estremità aperta (il dotto vomeronasale) che collega ala cavità nasale. VSNs estendere i loro dendriti alla parte lume del VNO, dove gli spunti feromoni sono in contatto con i recettori espressi al manopole dendritiche. I corpi cellulari dei VSNs forma pseudo-stratificato con strati V1R e V2R espressa negli strati basali e apicali rispettivamente 6-8. Diverse tecniche sono state utilizzate per monitorare le risposte di VSNs agli stimoli sensoriali 4,12,15-19. Tra queste tecniche, la preparazione fetta acuta offre diversi vantaggi. In primo luogo, rispetto ai 3,17 VSNs dissociato, preparati fetta mantenere i neuroni nella loro morfologia e origine i dendriti delle cellule soggiorno relativamente intatte. In secondo luogo, i corpi cellulari dei VSNs sono facilmente accessibili in fetta coronale del VNO per consentire studi di elettrofisiologia ed esperimenti di imaging rispetto a epitelio tutto e tutto di montaggio preparati 12,20. In terzo luogo, questo metodo può essere combinata con tecniche di clonazione molecolare per consentire l&#39;identificazione del recettore. Stimolazione sensoriale suscita forte afflusso Ca 2 + in VSNs che è indicativo di attivazione dei recettori 4,21. Abbiamo così sviluppare topi transgenici che esprimono G-CaMP2 nei neuroni sensoriali olfattivi, compreso il VSNs 15,22. La sensibilità e la natura genetica della sonda facilitare notevolmente Ca 2 + esperimenti di imaging. Questo metodo ha eliminato il processo di tintura di carico utilizzati in studi precedenti 4,21. Inoltre utilizzano un sistema di consegna ligando che consente l&#39;applicazione di stimoli diversi per le fette VNO. La combinazione delle due tecniche ci permette di monitorare contemporaneamente i neuroni in risposta a un gran numero di stimoli. Infine, abbiamo stabilito un semi-automatico pipeline di analisi per aiutare l&#39;elaborazione delle immagini.

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Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

L&#39;organo vomeronasale (VNO) rileva i segnali chimici intraspecie che veicolano informazioni sociali e riproduttivi. Abbiamo effettuato Ca2 + esperimenti di imaging con topi transgenici che esprimono G-CaMP2 nel tessuto VNO. Questo approccio ci consente di analizzare i modelli di risposta dei neuroni complicato vomeronasale a un gran numero di stimoli feromone.

Le risposte di imaging neuronale in preparazione Fetta di organo vomeronasale Esprimere un sensore di calcio geneticamente codificato

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

imaging-neuronal-responses-slice-preparations-vomeronasal-organ

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K Views.  Stowers Institute for Medical Research. L'organo vomeronasale (VNO) rileva i segnali chimici intraspecie che veicolano informazioni sociali e riproduttivi. Abbiamo effettuato Ca2 + esperimenti di imaging con topi transgenici che esprimono G-CaMP2 nel tessuto VNO. Questo approccio ci consente di analizzare i modelli di risposta dei neuroni complicato vomeronasale a un gran numero di stimoli feromone.

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Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel Drosophila Lobe antenne

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Ricerca

Neuroscienze

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

Imaging Pheromone Sensing in preparazione dei tessuti Vomeronasal acuta Slice mouse

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo preparati della lampadina vomeronasale Organo e accessori olfattivo intatto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.

Imaging intracellulare Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Segnali di striatale astrociti da topi adulti utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificate

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Registrazione Light-evocato Risposte postsinaptica nei neuroni in Dark-adattati, i preparativi della retina del mouse Slice Utilizzando tecniche di patch clamp

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate goal is to image neuronal activity in vivo, one must be able to image activity of a single cell to ensure successful in vivo preparations. This procedure will describe how to image membrane potential in a single cell to provide a foundation to eventually image in vivo. Here we describe methods for imaging GEVIs consisting of a voltage-sensing domain fused to either a single fluorescent protein (FP) or two fluorescent proteins capable of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) in vitro. Using an image splitter enables the projection of images created by two different wavelengths onto the same charge-coupled device (CCD) camera simultaneously. The image splitter positions a second filter cube in the light path. This second filter cube consists of a dichroic and two emission filters to separate the donor and acceptor fluorescent wavelengths depending on the FPs of the GEVI. This setup enables the simultaneous recording of both the acceptor and donor fluorescent partners while the membrane potential is manipulated via whole cell patch clamp configuration. When using a GEVI consisting of a single FP, the second filter cube can be removed allowing the mirrors in the image splitter to project a single image onto the CCD camera.

A method for imaging changes in membrane potential using genetically encoded voltage indicators is described.

Imaging potenziale di membrana con due tipi di geneticamente codificati fluorescenti di sensori di tensione

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Controllo ottico di una proteina neuronale Utilizzando un acido Innaturale Amino geneticamente codificata in neuroni

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

L&#39;incubazione prolungata di acuta neuronale tessuto per Elettrofisiologia e Calcio imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Le risposte di imaging neuronale in preparazione Fetta di organo vomeronasale Esprimere un sensore di calcio geneticamente codificato

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