Diese Studie wurde vom NIH gewährt R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 und R01GM096187 unterstützt.

1. RBCs Isolierung aus Vollblut <ol><li> Bereiten Sie EAS-45-Lösungen. Wägen Sie alle Zutaten aus Tabelle I und lösen sich in 100-200ml VE-Wasser. Wasser hinzu, bis 1000ml Lösung zu machen und pH-Wert auf 8,0. Filter und Aliquot von 50ml. Einfrieren bei -20 ° C für die Lagerung. </li></ol> Hinweis: Schritt 1.2 sollte durch einen geschulten Arzt, wie eine Krankenschwester durchgeführt werden, mit einem Institutional Review Board genehmigten Protokoll. <ol start="2"><li> Draw 3-5 ml Blut aus der V. mediana cubiti in eine 10ml Röhrchen mit EDTA und vorsichtig mischen das Blut mit EDTA sofort und gründlich zu vermeiden Blutgerinnung. </li><li> Prozess Blutprobe so schnell wie möglich. Alle folgenden Schritte außer Zentrifugation sollte unter der Haube zu halten Vorbereitung sterile durchgeführt werden. Übertragen Sie die Blut zu einem 50ml Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 10 ml kalt und steril Histopaque 1077 und Zentrifuge für 5min @ 1000rpm, 4 ° C. Zweimal wiederholen. </li><li> Fügen Sie 10ml kalte und sterile PBS, Zentrifuge für 5min @ 1000rpm, 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die 4-mal (insgesamt 5 mal). </li><li> Waschen mit sterilem EAS-45 (5min @ 1000rpm, 4 ° C) zweimal. In den letzten Waschen bewegen RBCs in eine neue sterile 15ml Tube. </li><li> Resuspendieren RBCs in10ml EAS-45. </li></ol> 2. RBCs Biotinylierung <ol><li> Nehmen Sie den Schlauch mit Erythrozyten aus Schritt 1. Entfernen Sie alle Überstand nach Zentrifugation für 5min @ 1000rpm, 4 ° C. Setzen Sie 10 &amp;mgr; l von RBC Pellet jeweils mehrere Ampullen und fügen entsprechende Menge PBS in jedes Fläschchen (siehe Tabelle II zum Beispiel zur Herstellung von sechs verschiedenen RBCs Biotinylierung Konzentrationen). </li><li> Machen Sie frische Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 Verdünnungen nach Tabelle II. </li><li> Add 10 &amp;mgr; l 0,1 M Boratpuffer in jedes Fläschchen. </li><li> Hinzufügen des berechneten Menge an Biotin-Lösung in jedes Fläschchen (siehe Tabelle II als Beispiel) und Vortex sofort. </li><li> Platzieren Sie jede RBC Fläschchenin einem 50ml konischen Rohr und inkubieren am Rotator für 30min bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie jede Flasche 3-mal mit 800μl der EAS-45 für 2min @ 2000rpm. </li><li> Add 100 &amp;mgr; von EAS-45 auf jeder Flasche und lagern bei 4 ° C. In jedem 1μl der endgültigen Lösung sollte nun ~ 1mln von RBC werden. </li></ol> 3. Funktionalisierung der Biotin-linked-Liganden * auf RBCs <ol><li> Bereiten 2mg/ml Streptavidin-Lösung nach den Anweisungen des Herstellers. Aliqouted Lösung kann bei -20 ° C gelagert werden </li><li> Mix eine gleiche Menge an roten Blutkörperchen von Schritt 2,7 (10 &amp;mgr; l) mit Streptavidin-Lösung, Vortex sofort und inkubieren am Rotator für 30min bei 4 ° C. </li><li> 3 x waschen mit 500μl der EAS-45 für 2min @ 2000rpm. Add 15μl EAS-45 / 1% BSA für die Lagerung. </li><li> Mix gleiche Menge an roten Blutkörperchen von Schritt 3,3 (10 &amp;mgr; l) mit 20μg/ml Ligand-Lösung, Vortex sofort und inkubieren am Rotator für 30min bei Raumtemperatur. </li><li> Wash zweimal mit 500μl der EAS-45 / 1% BSA für 2min @ 2000rpm. Fügen Sie 15μl von EAS-45 / 1% BSA für die Lagerung. </li></ol> * Wenn Ihr Protein hat keine Biotin Link können Sie eine der kommerziell erhältlichen Kits für Protein Biotinylierung (z. B. Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro NHS-PEG4-Biotinylierung Kit) oder biotinylierten Fänger-Antikörper, als Zwischenschritt, wie gezeigt in dem Video. 4. Die Quantifizierung von Rezeptor und Ligand Dichten <ol><li> Inkubieren Ligand-beschichteten Erythrozyten aus Schritt 3, und in ein anderes Gefäß, Rezeptor-tragenden Zellen mit sättigenden Konzentrationen der jeweiligen mAbs für 30min bei Raumtemperatur. Inkubieren in separaten Fläschchen Zellen mit irrelevanten Isotyp-Antikörper für die Steuerung. Wenn der primäre Antikörper nicht fluoreszenzmarkierten sind, mit Fluoreszenz-konjugierten Sekundärantikörper inkubieren nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Analysieren Sie die Proben in Schritt 4.1 von Flow cytometery zubereitet mit entsprechenden fluoreszierenden calibration Perlen. Berechnen Sie die Dichte wie in Abb. gezeigt. 1. </li></ol> 5. Vorbereitung für Mikropipette und Zellkammer <ol><li> Pull-Mikropipetten aus Kapillaren mit PN-30 Narishige &#39;Magnetic Glas-Mikroelektrode Horizontal Puller oder Sutter Instruments Micropipette Puller. </li><li> Verwenden Sie Mikromanipulator mit microforge an der Spitze des gezogenen Mikropipette auf die gewünschte Größe (in der Regel den erforderlichen Durchmesser reicht von 1-5 um je nach Größe der Zellen in der Studie verwendet werden) einstellen. </li><li> Bereiten Sie die Zelle Kammer, indem Mikroskop Deckglas auf die gewünschte Größe. Seal die Kammer mit Mineralöl von beiden Seiten bis mittlere Verdunstung zu vermeiden, um die Osmolarität während des Experiments ändern. </li><li> Fügen Sie die Rezeptor-und Ligand-tragenden Zellen in die Kammer. </li></ol> 6. Micropipette Haftung Frequenz-Test <ol><li> Saugen Sie die interagierenden Zellen, die durch jeweilige Pipetten und Einsatz computer-programmierte piezoelectr<html> ic Übersetzer der RBC in und aus dem Kontakt-Laufwerk mit der anderen Zelle mit kontrolliertem Kontakt Raum und Zeit. Detect Haftung Ereignisse durch die Beobachtung RBC Dehnung auf Zellseparation. </li><li> Wiederholen Sie den Kontakt-Rückzug-Zyklus 50-100 mal für eine bestimmte Einwirkzeit. Notieren Sie sich die beobachteten Ereignisse Haftung durch den Zusatz &quot;1&quot; für die Adhäsion oder &quot;0&quot; für keine Haftung in eine Spalte der Excel-Tabelle. Sie können ein Aufnahmegerät, zB digitale Medien oder Videoband, für den mikroskopischen Bildern. </li><li> Notieren Sie sich die Haftung Frequenz gegenüber Berührung Zeit-Kurve mit mindestens drei verschiedenen Zell-Paare für jeden Kontakt Zeit, um einen Mittelwert und SEM erhalten. </li><li> Notieren Sie sich die unspezifische Bindung Kurve die Kontrolle über RBCs mit irrelevanten Liganden (zB BSA) und / oder Sperrung der Liganden oder Rezeptoren mit ihren spezifischen funktionellen Blockade mAbs beschichtet. Spezifische Haftung Frequenz bei jedem Kontakt Zeitpunkt kann durch Entfernen der unspezifischen Adhäsion Frequenz 1 berechnet werden. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 7. Datenanalyse <ol><li> Setzen Sie die spezifische Adhäsion Frequenz P ein Vergleich Kontaktzeit t Daten von einem probabilistischen Modell (Gleichung 1), dass ein zweiter Ordnung nach vorne und erster Ordnung umzukehren, Single-Step-Interaktion zwischen einem einzelnen Arten von Rezeptoren und einer einzigen Art von Liganden 1 beschreibt : <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq1.jpg" /> wo K eine ist die 2D effektive Bindungsaffinität, k off ist die Off-Rate, sind m r und m l die jeweiligen Rezeptoren und Liganden Dichten in Schritt 4 gemessen und A c ist die Kontaktfläche. Die Kurve-fit hat zwei Parameter, A c K a und k off, wie A c und K a sind zusammengeworfen und als kollektiv als effektive 2D-Affinität. Sein Produkt mit dem off-Rate ist die effektive 2D on-rate: A </em&gt; c k on = A c K a x k off. Die spezifische Adhäsion Frequenz P a wird durch Subtraktion der unspezifischen Adhäsion Fraktion (P unspezifische) aus der Summe gemessen Haftung (P gemessen) 1,21 berechnet: <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq2.jpg" /></li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse: <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig1.jpg" /> Abbildung 1: Bestimmung der Integrin α L β 2 Website Dichte auf Neutrophilen. Neutrophile wurden zunächst mit 1μg/ml von E-Selektin-Ig für 10min inkubiert, um die experimentellen Bedingungen in Zahlen 3,4 oder ohne E-Selektin-Ig verwendet übereinstimmen, und dann mit sättigenden Konzentrationen (10μg/ml) von PE-konjugierten anti -Mensch-CD11a mAb (Clone HI111, siehe Tabelle der spezifischenReagenzien und Geräte) oder irrelevant Maus IgG1 für die Steuerung, gewaschen und sofort analysiert. Die Proben wurden auf BD LSR Durchflusszytometer mit Standard QuantiBRITE PE Kalibrierung Perlen zu lesen. Panel A zeigt Fluoreszenz-Histogramme der Kalibrierung Perlen (rosa) zusammen mit denen von E-Selektin-Ig behandelt wurden (blaue Farbe) oder unbehandelten Zellen (grüne Farbe). Spezifische CD11a mAb Färbung ist in durchgezogenen Kurven und irrelevant Isotyp-Kontroll-Antikörper-Färbung ist gestrichelt dargestellten Kurven gezeigt. Zellen, die mit E-Selektin-Ig (Präsenz in allen Waschschritte und in FACS-Puffer) behandelt wurden, keinen Einfluss auf die CD11a Dichte wie aus dem Vergleich mit unbehandelten Zellen gesehen. Panel B zeigt den Prozess der Dichte Quantifizierung. Log10 wurde für die mittlere Fluoreszenzintensität (FI) der einzelnen Spitzenwert von vier Kalibrierung bead Histogramme von Panel berechnet A (rosa Kreise) und für die viel-spezifischen PE-Moleküle pro Perle (vom Hersteller). Eine lineare Regression von Log10 PE-Moleküle pro Perle gegen Log10 fluoreszENCE wurde aufgezeichnet. Für E-Selektin behandelten Zellen der Log10 FI (y)-Werte gleich 3,99 (blue solid Kreis) und 2,23 (blue offener Kreis) für spezifische mAb und Kontroll-Antikörper, respectivly. Wir lösten das lineare Gleichung für x (Werte sind als grüne und blaue Kreise auf Panel B dargestellt) x = log10 PE / Zelle und als PE:. MAb-Verhältnis war 1:1, war die Gesamtzahl der α L β 2 auf Neutrophilen berechnet als 9587. Flächendichte berechnet wurde auf 43 Moleküle / um 2, mit 8.4μm wie die neutrophilen Durchmesser 22. Dichte von ICAM-1 wurde in ähnlicher Weise durch flow cytometery mit PE-Anti-Human-CD54 mAb, die 65 mol / &amp;mgr; m 2 erreicht gemessen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig2.jpg" /> Abbildung 2 Micropipette System Schaltpläne. Unsere Mikropipette wurde im Haus montiert und besteht aus drei Teilsystemen: ein bildgebendes Subsystem, damit man beobachten, record und analysieren Bewegungen der Mikropipette-Saugmotor Zelle, eine Mikromanipulation Subsystem, damit man die Zellen aus der Zelle Kammer zu wählen, und ein Druck-Subsystem, damit man die Zellen in Mikropipetten absaugen. Das zentrale Stück der Imaging-Subsystem Mikroskop invertiert (Olympus IMT-2 IMT2) mit einem 100x Öl-Immersion 1,25 NA Objektiv. Das Bild wird auf einem Videorecorder über eine Belastung Coupled Device (CCD)-Kamera gesendet werden. Ein Video-Timer ist mit dem System gekoppelt, den Überblick über Zeit zu halten. Jede Mikropipette kann durch einen mechanischen Antrieb auf das Mikroskop angebracht und fein mit einem Drei-Achsen-hydraulischen Mikromanipulator positioniert manipuliert werden. Mechanische Manipulatoren aus Newport könnte auch verwendet werden. Einer der Mikropipette Inhaber auf einem piezoelektrischen Übersetzer montiert ist, wird der Fahrer, die von einem Computer LabView-Code (auf Anfrage) und das Signal übersetzt durch eine DAQ-Karte über einen Spannungs-Verstärker (hausgemacht), um den Piezo-Aktuator gesteuert. Dies ist einSorgt dafür, man die Pipette exakt und reproduzierbar zu bewegen in einer Adhäsion Testzyklus. Die Druckregelung Subsystem wird verwendet, um Saug während des Experiments zu kontrollieren. Ein hydraulischer Linie verbindet die Mikropipette Halter mit einem Flüssigkeitsbehälter. Eine feine mechanische Stellungsregler ermöglicht die Höhe des Behälters genau manipuliert werden. Mikropipetten werden mit Hilfe KIMAX Schmelzpunkt Borosilikatglas Kapillaren (mit einem Außendurchmesser von 1,0 ± 0,07 mm und einem Innendurchmesser von 0,7 ± 0,07 mm. Erstens, die Mikropipetten von Kapillaren gezogen werden mit PN-30 Narishige &#39;Magnetic Glas-Mikroelektrode Horizontal Puller (Sutter Instruments Micropipette Puller ist ein weiterer Puller Option). Zweitens Microforge System (erbaut im Haus) wird verwendet, um die Mikropipetten auf die gewünschte Größe Öffnung geschnitten. Handelsregister Modelle Microforge Systeme sind ebenfalls verfügbar. Um Schwingungen der Mikropipetten während des Experiments, das Mikroskop zu vermeidenopa, zusammen mit der Mikromanipulatoren, basiert auf einer Luftfederung Tisch gelegt. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig3.jpg" /> Abbildung 3 Running Haftung Frequenz F i für bestimmte (A) und unspezifische (B) Bindung an 1s (rot) und 10s (blau) Kontaktzeiten von wiederholten Haftung Testzyklen zwischen RBC mit ICAM-1 (A) oder Higg beschichtet gemessen (B ) mit humanen Neutrophilen Ausdruck Integrin α L β 2. F i = (X 1 + X 2 + ... + X i) / i (1 ≤ i ≤ n), wobei i den Prüfzyklus Index, X i ist gleich &quot;1&quot; (Adhäsion) oder &quot;0&quot; (keine Haftung). F n (n = 50) wurde als beste Schätzung für die Haftung Wahrscheinlichkeit verwendet. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig4.jpg" /> Abbildung 4 Kinetik derICAM-1-Bindung an neutrophilen Integrin α L β 2 ( <img alt="Quadrat" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq1.jpg" /> ). Adhesion Wahrscheinlichkeit gemessen, wie in Abbildung 3 für drei Zellpaaren an jedem Kontaktpunkt Mal gezeigt wird gemittelt und aufgetragen gegen Kontaktzeit. Die Kammer Medium wurde HBSS mit 1mM jeder Ca 2 + und Mg 2 + und 1μg/ml dimerer E-Selektin-Ig zu regulieren α L β 2-Bindung. Zur Erfassung ICAM-1-Ig auf Erythrozyten, ein Zwischenschritt wurde hinzugefügt, um Erythrozyten mit 10μg/ml Fänger-Antikörper (biotinylierter Ziege-Anti-Human-Fc-Antikörper, eBioscience) nach dem Streptavidin Inkubationsschritt inkubieren. Zur Kontrolle unspezifischer Bindung zwei verschiedenen Bedingungen wurden verwendet: 1) RBCs beschichtet mit anti-human-Fc Fänger-Antikörper inkubiert und mit humanen IgG anstelle von ICAM-1-Ig (O) und 2) Neutrophile Bindung an Erythrozyten nicht mit der beschichteten Fänger-Antikörper (Δ). 10μg/ml IgG wurde dem Medium aufgenommen zu minimieren Bindung von E-Selektin-Ig in Lösung des Capture-Antikörper auf der Oberfläche RBC. Die unspezifische Bindung als menschliche IgG Regelkurve aufgenommen wurde verwendet, um eine spezifische Adhäsion Wahrscheinlichkeit Kurve zu erhalten ( <img alt="Quadrat" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq2.jpg" /> ) Mit Gl. 2. Fitting spezifische Adhäsion Wahrscheinlichkeit Kurve mit Gl. 1 (durchgezogene Linie) wieder wirksam Bindungsaffinität A c K a = 1,4 • 10 -4 μm4 und k off = 0,3 s -1. <table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> MW (g / mol) </th><th> Konzentration (mM) </th><th> Menge (g) </th></tr><tr><td> Adenin </td><td> 135,13 </td><td> 2 </td><td> 0,27 </td></tr><tr><td> D-Glucose (Dextrose) </td><td> 180,16 </td><td> 110 </td><td> 19,82 </td></tr><tr><td> D-Mannitol </td><td> 182,17 </td><td> 55 </td><td> 10,02 </td></tr><tr><td> Natriumchlorid (NaCl) </td><td> 58,44 </td><td>50 </td><td> 2,92 </td></tr><tr><td> Sodium Phosphate, Dibasic (Na HPO ) </td><td> 141,95 </td><td> 20 </td><td> 2,84 </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> 146,15 </td><td> 10 </td><td> 1,46 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. EAS-45-Puffer Vorbereitung (1L). <table border="1"><tbody><tr><td> 25 mg Biotin-XHS in 550 ul DMF </td><td> 0,1 M Biotin-Lösung </td></tr><tr><td> 1:10 Verdünnung von 0,1 Biotin w / DMF </td><td> 0,01 M Biotin-Lösung </td></tr><tr><td> 1:100 Verdünnung von 0,1 Biotin w / DMF </td><td> 0,001 Biotin-Lösung </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Vorbereitung der Biotin-Lösung. <table border="1"><tbody><tr><th> Biotin Endkonzentration (M) </th><th> 4 </th><th> 10 </th><th> 20 </th><th> 50 </th><th> 100 </th><th> 160 </th></tr><tr><td> RBCs Pellet Lager (ul) </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 1x PBS (ul) </td><td> 179,2 </td><td> 178 </td><td> 176 </td><td> 179 </td><td> 178 </td><td> 176,8 </td></tr><tr><td> 0,1 M Boratpuffer (ul) </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 0,01 M Biotin-Lösung (ul) </td><td></td><td></td><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3,2 </td></tr><tr><td> 0,001 Biotin-Lösung (ul) </td><td> 0,8 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Biotinylierung von RBC.

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Med. 208, 81-90 (2011).</li><li>Jiang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-stage+cooperative+T+cell+receptor-peptide+major+histocompatibility+complex-CD8+trimolecular+interactions+amplify+antigen+discrimination.">Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination.</a> Immunity. 34, 13-23 (2011).</li><li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force.">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).</li><li>Zhu, C., Williams, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+concurrent+binding+of+multiple+molecular+species+in+cell+adhesion.">Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion.</a> Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).</li><li>Downey, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+of+leukocytes+in+capillaries:+role+of+cell+size+and+deformability.">Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability.</a> J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).</li><li>Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+and+kinetic+analysis+of+Fcgamma+receptor+IIIa+(CD16a)+binding+to+IgG+ligands.">Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands.</a> J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).</li><li>Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Receptor-Ligand+Binding+Kinetics+on+Cell+Surfaces:+From+Adhesion+Frequency+to+Thermal+Fluctuation+Methods.">Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods.</a> Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).</li><li>Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., Meister, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+binding+of+fibroblasts+to+fibronectin:+optical+tweezers+experiments+and+probabilistic+analysis.">Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis.</a> Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).</li><li>Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P. A., Heinrich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+horizontal+force+probe+for+mechanical+tests+on+pipette-held+cells,+particles,+and+membrane+capsules.">Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules.</a> Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).</li><li>Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+force+dependence+of+two-dimensional+receptor-ligand+binding+affinity+by+centrifugation.">Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation.</a> Biophys. J. 74, 492-513 (1998).</li><li>Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+competition+binding+between+soluble+and+membrane-bound+ligands+for+cell+surface+receptors.">Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors.</a> Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).</li><li>Long, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+modeling+of+rosette+formation.">Probabilistic modeling of rosette formation.</a> Biophys. J. 91, 352-363 (2006).</li><li>Lou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-enhanced+adhesion+regulated+by+a+selectin+interdomain+hinge.">Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge.</a> J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).</li><li>Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+governs+flow-enhanced+cell+tethering+through+L-selectin+at+threshold+shear.">Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear.</a> Biophys. J. 92, 330-342 (2007).</li><li>Evans, E., Berk, D., Leung, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detachment+of+agglutinin-bonded+red+blood+cells.+I.+Forces+to+rupture+molecular-point+attachments.">Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments.</a> Biophys. J. 59, 838-848 (1991).</li><li>Zarnitsyna, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+in+receptor-ligand-mediated+cell+adhesion.">Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Um erfolgreich mit der Mikropipette Haftung Frequenz Assay man mehrere kritische Schritte in Betracht ziehen sollten. Stellen Sie zunächst sicher, um die spezifische Wechselwirkung für die Rezeptor-Ligand-System von Interesse aufnehmen. Unspezifische Kontrollmessungen (vgl. Abb.. 3, 4) gewährleisten die Spezifität. Idealerweise sollten unspezifische Adhäsion Wahrscheinlichkeiten unter 0,05 für jeden Kontakt Zeitdauern zu sein und einen signifikanten Unterschied zwischen der spezifischen und unspezifischen Haftung ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog # </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> BioWhittaker </td><td> 17-517Q </td><td> Verdünnen auf 1x mit VE-Wasser vor dem Gebrauch </td></tr><tr><td> Vacutainer EDTA </td><td> BD </td><td> 366643 </td><td> Erythrozyten isoliert </td></tr><tr><td> 10ML PK100 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 10771 </td><td> Erythrozyten isoliert </td></tr><tr><td> Adenin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2786 </td><td> EAS-45 Vorbereitung </td></tr><tr><td> D-Glucose (Dextrose) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528 </td><td> EAS-45 Vorbereitung </td></tr><tr><td> D-Mannitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 6360 </td><td> EAS-45 Vorbereitung </td></tr><tr><td> Natriumchlorid (NaCl) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7653 </td><td> EAS-45 Vorbereitung </td></tr><tr><td> Sodium Phosphate, Dibasic (Na &amp; # x2082; HPO ₄) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S374 </td><td> EAS-45 Vorbereitung </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5763 </td><td> EAS-45 Vorbereitung </td></tr><tr><td> Biotin-X-NHS </td><td> Calbiochem </td><td> 203188 </td><td> RBCs Biotinylierung </td></tr><tr><td> Dimethylformamid (DMF) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 20673 </td><td> RBCs Biotinylierung </td></tr><tr><td> Boratpuffer (0,1 M) </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 11455-90 </td><td> RBCs Biotinylierung </td></tr><tr><td> Streptavidin </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21125 </td><td> Ligand Funktionalisierung </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0336 </td><td> Ligand Funktionalisierung </td></tr><tr><td> Quantibrite PE Beads </td><td> BD Biosciences </td><td> 340495 </td><td> Dichte Quantifizierung </td></tr><tr><td> Durchflusszytometer </td><td> BD Immunocytometry Systems </td><td> BD LSR II </td><td> Dichte quantification </td></tr><tr><td> Kapillarrohr 0,7-1.0mm x 30 &quot; </td><td> Kimble Glass Inc. </td><td> 46485-1 </td><td> Micropipette ziehen </td></tr><tr><td> Mineralöl </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2629-1 </td><td> Kammeranordnung </td></tr><tr><td> Mikroskop Deckglas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12 bis 544-G </td><td> Kammeranordnung </td></tr><tr><td> PE α-human CD11a Clone HALLO 111 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0119-71 </td><td> Reagenz für Abb.1 </td></tr><tr><td> PE anti-human CD54 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0549 </td><td> Reagenz für Abb.1 </td></tr><tr><td> Maus IgG1 Isotyp-Kontroll-PE </td><td> eBioscience </td><td> 12-4714 </td><td> Reagenz für Abb.1 </td></tr><tr><td> hydraulischen Mikromanipulator </td><td> Narishige </td><td> MO-303 </td><td> Micropipette System </td></tr><tr><td> Mechanische Manipulator </td><td> Newport </td><td> 461-xyz-m, SM-13, DM-13 </td><td> Micropipette System </td></tr><tr><td> piezoelektrische Übersetzer </td><td> Physik Instrumente </td><td> P-840 </td><td> Micropipette System </td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td> Version 8.6 </td><td> Micropipette System </td></tr><tr><td> DAQ-Karte </td><td> National Instruments </td><td> USB-6008 </td><td> Micropipette System </td></tr><tr><td> Optische Tisch </td><td> Kinetics Systeme </td><td> 5200 Series </td><td> Micropipette System </td></tr></tbody></table>

adhesion frequency assay for in situ kinetics analysis of cross-junctional molecular interactions at the cell-cell interface

Die Mikropipette Adhäsionsassay wurde 1998 entwickelt, um zweidimensionale (2D)-Rezeptor-Ligand-Bindung Kinetik 1 zu messen. Der Test verwendet eine menschliche rote Blutzellen (RBC) als Haftvermittler Sensor und präsentierenden Zelle für eine der wechselwirkenden Moleküle. Das Unternehmen beschäftigt Mikromanipulation der RBC in Kontakt mit einer anderen Zelle, dass die anderen interagieren Molekül drückt mit präzise kontrollierten Raum und Zeit, um Bindung zu ermöglichen bringen. Die Haftung Veranstaltung ist als RBC Dehnung beim Ziehen der beiden Zellen voneinander entdeckt. Durch die Steuerung der Dichte des Liganden auf der RBC Oberfläche immobilisiert, ist die Wahrscheinlichkeit der Adhäsion in Mid-Range zwischen 0 und 1 gehalten. Die Haftung Wahrscheinlichkeit ist von der Frequenz der Haftung Ereignisse in eine Folge von wiederholtem Kontakt Zyklen zwischen den beiden Zellen für eine bestimmte Einwirkzeit geschätzt. Durch Variation der Einwirkzeit erzeugt eine verbindliche Kurve. Der Einbau einer probabilistischen Modell für die Rezeptor-Ligand-Reaktionskinetik 1, um die BindungKurve gibt die 2D-Affinität und off-Rate. Der Test wurde validiert mit Wechselwirkungen von Fcy Rezeptoren mit IgG Fc 1-6, Selektine mit Glykokonjugat Liganden 6-9, Integrine mit Liganden 10-13, homotypical Cadherin binden 14, T-Zell-Rezeptor und Korezeptor mit Peptid-MHC-Komplexe 15 - 19. Die Methode wurde verwendet, um Vorschriften von 2D-Kinetik von biophysikalischen Faktoren, wie die Membran microtopology 5, Membrananker 2, molekulare Orientierung und Länge 6, Träger Steifigkeit 9, Krümmung 20 und Impingement Kraft 20, sowie biochemische Faktoren zu quantifizieren, wie Modulatoren des Zytoskeletts und Membranmikroumgebung wo die interagierende Moleküle befinden und die Oberfläche Organisation dieser Moleküle 15,17,19. Die Methode wurde auch t verwendeto Studie der gleichzeitigen Bindung von zwei Rezeptor-Ligand-Arten 3,4 und trimolekulare Interaktionen 19 mit einem modifizierten Modell 21. Der große Vorteil der Methode ist, dass es zu studieren von Rezeptoren in ihrer Muttersprache Membran-Umgebung ermöglicht. Die Ergebnisse könnten erheblich von denen unter Verwendung gereinigter Rezeptoren 17. Es ermöglicht auch Erforschung der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen in einem Sub-Sekunden-Zeitskala mit zeitlicher Auflösung die weit über die typischen biochemischen Methoden. Zur Veranschaulichung der Mikropipette Haftung Frequenz-Methode zeigen wir, Kinetik Messung von ICAM 1 (ICAM-1) auf Erythrozyten Bindung an Integrin α L β 2 auf Neutrophilen mit dimeren E-Selektin in die Lösung α L β 2 aktivieren funktionalisiert.

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Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Eine Haftung Frequenz-Assay zur Messung der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung Kinetik, wenn beide Moleküle auf der Oberfläche der interagierenden Zellen verankert sind beschrieben. Diese mechanisch-basierter Assay wird beispielhaft mit einer Mikropipette unter Druck menschlichen roten Blutkörperchen als Haftvermittler Sensor und Integrin αLβ2 und ICAM-1 als interagierende Rezeptoren und Liganden.

Adhesion Frequency-Assay für In Situ Kinetics Analyse der Cross-Junktionaler Molecular Interactions an der Zell-Zell-Schnittstelle

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

adhesion-frequency-assay-for-situ-kinetics-analysis-cross-junctional

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

14.9K Aufrufe.  Georgia Institute of Technology. Eine Haftung Frequenz-Assay zur Messung der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung Kinetik, wenn beide Moleküle auf der Oberfläche der interagierenden Zellen verankert sind beschrieben. Diese mechanisch-basierter Assay wird beispielhaft mit einer Mikropipette unter Druck menschlichen roten Blutkörperchen als Haftvermittler Sensor und Integrin αLβ2 und ICAM-1 als interagierende Rezeptoren und Liganden.

Serie: Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

Hochauflösende LWL-Mikroendoskopiesysteme für In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Forschung

Biotechnik

Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication

Advancements in lab-on-a-chip technology promise to revolutionize both research and medicine through lower costs, better sensitivity, portability, and higher throughput. The incorporation of biological components onto biological microelectromechanical systems (bioMEMS) has shown great potential for achieving these goals. Microfabricated electronic chips allow for micrometer-scale features as well as an electrical connection for sensing and actuation. Functional biological components give the system the capacity for specific detection of analytes, enzymatic functions, and whole-cell capabilities. Standard microfabrication processes and bio-analytical techniques have been successfully utilized for decades in the computer and biological industries, respectively. Their combination and interfacing in a lab-on-a-chip environment, however, brings forth new challenges. There is a call for techniques that can build an interface between the electrode and biological component that is mild and is easy to fabricate and pattern.
Biofabrication, described here, is one such approach that has shown great promise for its easy-to-assemble incorporation of biological components with versatility in the on-chip functions that are enabled. Biofabrication uses biological materials and biological mechanisms (self-assembly, enzymatic assembly) for bottom-up hierarchical assembly. While our labs have demonstrated these concepts in many formats 1,2,3, here we demonstrate the assembly process based on electrodeposition followed by multiple applications of signal-based interactions. The assembly process consists of the electrodeposition of biocompatible stimuli-responsive polymer films on electrodes and their subsequent functionalization with biological components such as DNA, enzymes, or live cells 4,5. Electrodeposition takes advantage of the pH gradient created at the surface of a biased electrode from the electrolysis of water 6,7,. Chitosan and alginate are stimuli-responsive biological polymers that can be triggered to self-assemble into hydrogel films in response to imposed electrical signals 8. The thickness of these hydrogels is determined by the extent to which the pH gradient extends from the electrode. This can be modified using varying current densities and deposition times 6,7. This protocol will describe how chitosan films are deposited and functionalized by covalently attaching biological components to the abundant primary amine groups present on the film through either enzymatic or electrochemical methods 9,10. Alginate films and their entrapment of live cells will also be addressed 11. Finally, the utility of biofabrication is demonstrated through examples of signal-based interaction, including chemical-to-electrical, cell-to-cell, and also enzyme-to-cell signal transmission. 
Both the electrodeposition and functionalization can be performed under near-physiological conditions without the need for reagents and thus spare labile biological components from harsh conditions. Additionally, both chitosan and alginate have long been used for biologically-relevant purposes 12,13. Overall, biofabrication, a rapid technique that can be simply performed on a benchtop, can be used for creating micron scale patterns of functional biological components on electrodes and can be used for a variety of lab-on-a-chip applications.

This article describes a biofabrication approach: deposition of stimuli-responsive polysaccharides in the presence of biased electrodes to create biocompatible films which can be functionalized with cells or proteins. We demonstrate a bench-top strategy for the generation of the films as well as their basic uses for creating interactive biofunctionalized surfaces for lab-on-a-chip applications.

Bridging the Bio-elektronische Schnittstelle mit Biofabrication

Advancements in lab-on-a-chip technology promise to revolutionize both research and medicine through lower costs, better sensitivity, portability, and ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Bestimmung der Transport von Xenobiotika und Nanomaterialien über die Plazenta mit dem<em&gt; Ex vivo</em&gt; Menschliche Plazentaperfusion Modell

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or erosion. Amelogenin has been proven to be a critical protein for controlling the organized growth of apatite crystals. In this paper, we present a detailed protocol for superficial enamel reconstruction by using a novel amelogenin-chitosan hydrogel. Compared to other conventional treatments, such as topical fluoride and mouthwash, this method not only has the potential to prevent the development of dental caries but also promotes significant and durable enamel restoration. The organized enamel-like microstructure regulated by amelogenin assemblies can significantly improve the mechanical properties of etched enamel, while the dense enamel-restoration interface formed by an in situ regrowth of apatite crystals can improve the effectiveness and durability of restorations. Furthermore, chitosan hydrogel is easy to use and can suppress bacterial infection, which is the major risk factor for the occurrence of dental caries. Therefore, this biocompatible and biodegradable amelogenin-chitosan hydrogel shows promise as a biomaterial for the prevention, restoration, and treatment of defective enamel.

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

In this article, we describe a protocol for fabricating an amelogenin-chitosan hydrogel for superficial enamel reconstruction. Organized in situ growth of apatite crystals in the hydrogel formed a dense enamel-restoration interface, which will improve the effectiveness and durability of restorations.

Entwicklung von Amelogenin-Chitosan-Hydrogel für<em&gt; In-vitro-</em&gt; Emaille Nachwachsen mit einem dichten Schnittstelle

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

Mess TCR-pMHC Binding<em&gt; In-situ-</em&gt; Mit einem FRET-Mikroskopie Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The KYF-Pt-NE encapsulates Pt(II) at 10 wt. %, has a diameter of 107 &#177; 27 nm and a negative surface charge. The KYF-Pt-NE is stable in water and in serum, and is biologically active. The conjugation of a fluorophore to KYF allows the synthesis of a fluorescent nanoemulsion that is suitable for biological imaging. The synthesis of the nanoemulsion is performed in an aqueous environment, and the KYF-Pt-NE forms via self-assembly of a short KYF peptide and an oleic acids-platinum(II) conjugate. The self-assembly process depends on the temperature of the solution, the molar ratio of the substrates, and the flow rate of the substrate addition. Crucial steps include maintaining the optimal stirring rate during the synthesis, permitting sufficient time for self-assembly, and pre-concentrating the nanoemulsion gradually in a centrifugal concentrator.

This protocol describes an efficient method to synthesize a nanoemulsion of an oleic acids-platinum(II) conjugate stabilized with a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) tripeptide. The nanoemulsion forms under mild synthetic conditions via self-assembly of the KYF and the conjugate.

Ein Tripeptid-stabilisierten Nanoemulsion Ölsäure

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior of these materials. In the past, it has not been possible to satisfactorily measure the softening of thin films under conditions mimicking body environment without substantial effort. This publication presents a new and simple method that allows dynamic mechanical analysis (DMA) of polymers in solutions, such as phosphate buffered saline (PBS), at relevant temperatures. The use of environmental DMA allows measurement of the softening effects of polymers due to plasticization in various media and temperatures, which therefore allows a prediction of the materials behavior under in vivo conditions.

To allow reliable predictions of the softening of polymeric substrates for neural implants in an in vivo environment, it is important to have a reliable in vitro method. Here, the use of dynamic mechanical analysis in phosphate buffered saline at body temperature is presented.

Ökologische dynamische mechanische Analyse um die Erweichung Verhalten der neuronale Implantate

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically been studied in vivo in animal models showing characteristic patterns of cell migration. However, in vivo models have several limitations, including intercellular mediators that are difficult to access and analyze, as well as the inability to directly analyze human neutrophils. Because of these limitations, there is a need for an in vitro platform that studies swarming with human neutrophils and provides easy access to the molecular signals generated during swarming. Here, a multistep microstamping process is used to generate a bioparticle microarray that stimulates swarming by mimicking an in vivo infection. The bioparticle microarray induces neutrophils to swarm in a controlled and stable manner. On the microarray, neutrophils increase in speed and form stable swarms around bioparticle clusters. Additionally, supernatant generated by the neutrophils was analyzed and 16 proteins were discovered to have been differentially expressed over the course of swarming. This in vitro swarming platform facilitates direct analysis of neutrophil migration and protein release in a reproducible, spatially controlled manner.

This protocol generates bioparticle microarrays that provide spatially controlled neutrophil swarming. It provides easy access to the mediators that neutrophils release during migration and allows for quantitative imaging analysis.

Biopartikel-Mikroarrays für chemotaktische und molekulare Analysen des menschlichen Neutrophilen-Schwärmens in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built high viscous injector, Lipidico, as part of the macromolecular crystallography (MX2) beamline to measure large numbers of small crystals at room temperature. The goal of this technique is to enable crystals to be grown/transferred to&#160;glass syringes to be used directly in the injector for serial crystallography data collection. The advantages of this injector include the ability to respond rapidly&#160;to changes in the flow rate without interruption of the stream. Several limitations for this high viscosity injector (HVI) exist which include a restriction on the allowed sample viscosities to &#62;10 Pa.s. Stream stability can also potentially be an issue depending on the specific properties of the sample. A detailed protocol for how to set up samples and operate the injector for serial crystallography measurements at the Australian synchrotron is presented here. The method demonstrates preparation of the sample, including the transfer of lysozyme crystals into a high viscous media (silicone grease), and the operation of the injector for data collection at MX2.

The goal of this protocol is to demonstrate how to prepare serial crystallography samples for data collection on a high viscous injector, Lipidico, recently commissioned at the Australian synchrotron.

Lipidico Injektionsprotokoll für serielle Kristallographiemessungen am australischen Synchrotron

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure single-molecular binding kinetics, assess mechanical properties of ligand-receptor interactions, visualize protein dynamic conformational changes and more excitingly elucidate receptor mediated cell mechanosensing mechanisms. More recently, BFP has been used to measure the spring constant of molecular bonds. This protocol describes the step-by-step procedure to perform molecular spring constant DFS analysis. Specifically, two BFP operation modes are discussed, namely the Bead-Cell and Bead-Bead modes. This protocol focuses on deriving spring constants of the molecular bond and cell from DFS raw data.

A biomembrane force probe (BFP) is an in situ dynamic force spectroscopy (DFS) technique. BFP can be used to measure the spring constant of molecular interactions on living cells. This protocol presents spring constant analysis for molecular bonds detected by BFP.

Molekulare Federkonstantenanalyse mittels Biomembran-Kraftsondenspektroskopie

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...