Die Ohse Grant Foundation finanziert diese Arbeit.

1. Erweiterung der Zelleigenschaften
<ol><li>Pflegen Sie SW 13, SW-Neo und SW-DKK3 Zellen in einem standard befeuchteten Inkubator bei 37,0 ° C und 5 % CO2 in Dulbeccos geändert Eagle Medium mit 10 % fötalen Rinderserum und 10.000 U/mL Penicillin und Streptomycin (bezeichnet als "Wachstumsmedium") ergänzt.<ol>
<li>Zählen von Zellen mit einem Hemocytometer und 5.000 Zellen pro Bohrloch für SW 13, SW-Neo und SW-DKK3 Linien in separaten 6-Well-Platten und wachsen über Nacht im Wachstumsmedium auf sterile Glasdeckgläser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nachdem über Nacht Wachstum, für jedes gut Aspirieren das Wachstumsmedium, waschen Sie Zellen mit 1 mL warmen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und befestigen Sie die Zellen mit 1 mL von 3,7 % Formaldehyd für 10 min.</li>
	<li>Aspirat Formaldehyd und Fleck Zellen in jedem Bohrloch mit 1 mL 0,05 % Kristallviolett für 30 min. Waschen überschüssige Farbstoff mit drei wäscht von 1 mL entionisiertem Wasser. Hinweis: Abhängig von der Höhe der Farbstoff-Aufnahme, können mehrere zusätzliche Waschungen erforderlich sein, zur Förderung der Zelle Visualisierung Färbung Hintergrund zu entfernen.<ol>
<li>Mit feinen Spitzen Pinzette, Abrufen von Deckgläsern und legen Sie sie nach unten auf einen beschrifteten Objektträger mit einem Tropfen klar Montage Reagenz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie unter einem Lichtmikroskop nach dem Zufallsprinzip 20 Ansichten von nicht überlappenden Zellen aus jeder Deckglas für die Zelle-Erweiterung-Assay.<ol>
<li>Nehmen Sie Vergößerung bei 400 X Vergrößerung von jedem Sichtfeld. Direkt die Anzahl der jede Art von Erweiterung für jede der 20 repräsentative Zellen. Hinweis: als solche sollte 20 isolierte Zellen für jede getestete Bedingung um zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten untersucht werden. Filopodien wurden durch zelluläre Erweiterungen mit einem Sockel von 5 μm oder weniger und einem einzigen Spitze definiert. Pseudopodien wurden durch zelluläre Erweiterungen mit einer Grundfläche von 5 bis 20 µm Länge enthält Erweiterungen mit mehreren Spitzen definiert. Lamellipodia wurden durch Zelle-Erweiterungen, die größer als 20 Mikrometer lang und mit oder ohne Spitzen sind definiert. Getestete Zelle abhängig die Größe der Zelle Erweiterungen abweichen und Verfeinerung der Identifikation Parameter erfordern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestimmen Sie die durchschnittliche Anzahl pro Zelle-Verlängerung in jeden Zelltyp (d.h., SW 13, SW-Neo, SW-DDK) über die 6 Brunnen untersucht.</li>
	<li>Mit einem One-Way Varianzanalyse (ANOVA) statistische Test, vergleichen Sie Unterschiede in den durchschnittlichen Anteil der Zellmembran Erweiterungen unter die verschiedenen Zelltypen.</li>
</ol>(2) Haftung Assay
<ol><li>SW 13, SW-Neo und SW-DKK3 Zellen in einem standard befeuchteten Inkubator bei 37,0 ° C und 5 % CO2 im Wachstumsmedium zu erhalten.<ol>
<li>Mit einem Hemocytometer, zählen und 100.000 Zellen von SW 13, SW-Neo und SW-DKK3 pro Bohrloch in separaten 6-Well-Platten und wachsen über Nacht im Wachstumsmedium.</li>
		<li>Samen 6-Well-Platten für jeden Zelltyp mit einer Platte für jede der 6 bezeichneten Zeitpunkten getestet unter getestet. Hinweis: Die Zeitpunkte können für verschiedene Zelltypen variieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach der Inkubation über Nacht einmal waschen Sie Zellen mit warmen PBS, dann fügen Sie 0,5 mL 1 x nicht-enzymatische Zelle Dissoziation Lösung in jede Vertiefung.<ol>
<li>Schwenken Sie die Platte, um die Zelle Dissoziation Lösung zu verbreiten. Aspirieren Sie die dafür vorgesehenen Platte zu definierten Zeitpunkten (z. B. 1, 2, 3, 5, 10 und 15 min) und dann mit warmen PBS-Lösung 1 mL waschen Sie dreimal.</li>
		<li>Zwischen den Waschgängen klopfen Sie leicht die Platten um lose beigefügte Zellen zu lösen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirieren Sie alle verbleibenden PBS und Korrektur, die die Zellen bleiben auf der Platte mit 1 mL von 3,7 % Formaldehyd für 10 min angebracht.</li>
	<li>Beflecken Sie Zellen mit 1 mL 0,05 % Kristallviolett für 30 min, dann waschen Sie überschüssige Farbstoff Weg mit 1 mL entionisiertem Wasser. Titrieren Sie waschen Zelle Visualisierung zu fördern. Hinweis: Abhängig von der Höhe der Farbstoff-Aufnahme, können mehrere zusätzliche Wäschen benötigt, um Zelle Visualisierung zu fördern.</li>
	<li>Mit einem Lichtmikroskop bei 100 X Vergrößerung, Graf befestigt die restlichen Zellen in jede Vertiefung für jede Platte. Hinweis: Verwendung von transparenten Herrscher oder Kennzeichnung feinen Stift Führer auf der Unterseite der Platte hilft zur Vermeidung wiederholter zählen die gleichen Zellen.</li>
	<li>Bestimmen Sie die durchschnittliche Anzahl der angeschlossenen Zellen pro Bohrloch für jede Platte.</li>
	<li>Vergleichen Sie die Rate der Zelle Ablösung zwischen SW 13, SW-Neo und SW-DDK3 Zellen im angegebenen Zeitraum mit einem zwei-Wege-ANOVA statistischen Test.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenocortical+cancer:+pathophysiology+and+clinical+management.">Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management.</a> Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).</li><li>Veeck, J., Dahl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Wnt+pathway+in+cancer:+the+emerging+role+of+Dickkopf-3.">Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3.</a> Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).</li><li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Jacquemet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-type+calcium+channels+regulate+filopodia+stability+and+cancer+cell+invasion+downstream+of+integrin+signalling.">L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling.</a> Nat Commun. 7, 13297 (2016).</li><li>Machesky, L. M., Li, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin:+Invasive+filopodia+promoting+metastasis.">Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis.</a> Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).</li><li>Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+the+nuclear+piston+mechanism+of+3D+migration+in+tumor+cells.">Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells.</a> J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).</li><li>Korah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+RASSF1A+deregulates+cytoskeleton+and+promotes+malignant+behavior+of+adrenocortical+carcinoma.">Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma.</a> Molecular cancer. 12, 87 (2013).</li><li>Cheng, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+FOXO1-mediated+dedifferentiation+blocking+role+for+DKK3+in+adrenocortical+carcinogenesis.">A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis.</a> BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).</li><li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration,+protrusions,+and+fluorescence+intensities.">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).</li><li>Cliffe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+analysis+of+complex+single+border+cell+behaviors+in+coordinated+collective+cell+migration.">Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration.</a> Nat Commun. 8, 14905 (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier beschreiben wir eine in-vitro- quantitative Methode zur Charakterisierung von Zelle Erweiterungen mit Leichtigkeit, paar Grube fällt und zuverlässige Reproduzierbarkeit, die für verschiedene Testbedingungen angewendet werden können. Darüber hinaus können einfache, quantifizierbare Haftung und/oder Motilität Assays gleichzeitig durchgeführt werden, um mögliche funktionale Bedeutung der beobachteten Veränderungen in der Zellmembran Erweiterungen zu korrelieren.
Diese Meth...

Dysregulated WNT signalisieren spielt eine entscheidende Rolle in der NNR Malignome1. Die in dieser Studie verwendeten Methoden untersuchen, ob Schweigen der DKK3, ein negativer Regulator der WNT signalisieren, stellt eine Entdifferenzierung Ereignis in der Nebennierenrinde und fördert Tumorbildung im Zusammenhang mit der Zelle-Erweiterung Repertoire Änderungen. DKK3 ist eine 38 kDa Glykoprotein mit einer N-terminalen Signalpeptid abgesondert und frühere Studien haben gezeigt, dass seine erzwungene Ausdruck Zellzyklus Festnahme führte, aggressiven bösartigen Verhaltens gehemmt und epitheliale-mesenchymale umgekehrt Übergang2.
Das bösartige Verhalten der NNR-Karzinom (ACC) und anderen Krebsarten ist, im Teil, beeinflusst durch die Fähigkeit der Tumorzellen, Schnittstelle mit der umgebenden Flächen, einschließlich die extrazelluläre Matrix, die wiederum Tumorinvasion Zelle erleichtert und Migration-3. Die Rolle der spezifischen Zellmembran Erweiterungen in Tumorprogression ist zunehmend in verschiedenen Kontexten, vor allem über die Bildung von Filopodien vorgeführt. Zum Beispiel wurde Überexpression des L-Typ-Kalziumkanäle zu induzieren Filopodien Bildung und Förderung der Tumor Zelle Invasion4gefunden. Ebenso ist Fascin, ein Aktin-bindende Protein minimal ausgedrückt in normalem Gewebe auch überexprimieren in Krebszellen in Verbindung mit Filopodien Bildung5. Pseudopodien Bildung ermöglicht nicht-malignen Fibroblasten, effektiv durch die extrazelluläre Matrix zu migrieren, jedoch wurde nachgewiesen, dass Fibrosarkom Zellen abhängig Metalloproteinase Aktivität anstelle von Pseudopodien Zellwanderung zu erleichtern und Invasion-6. Wir haben gezeigt, dass Tumor Entstörer, einschließlich Ras Verband Domäne Familie 1 Isoform (RASSF1A) und DKK3, kann die Funktion zum Zellskelett Elemente zu verändern und Lamellipodia Bildung und stymie invasive Eigenschaften7,8.
Als solches ist es wichtig, die Auswirkungen von Genen, die in der Karzinogenese und ihre Beziehung zur Zellmembran Erweiterung Änderungen, insbesondere Beurteilung Filopodien, Pseudopodien und Lamellipodia Bildung unter Testbedingungen zu charakterisieren. Aktuellen State-of-the-Art-Techniken umfassen die Verwendung von immer ausgefeilteren Mikroskopieverfahren, fluoreszierende Kennzeichnung und/oder komplexe Computer-Algorithmen für die Datenerfassung und Auslegung. Während diese Methoden neue, leistungsstarke Analysetools bieten, schränkt ihre Komplexität ihrer Verbreitung und Anpassungsfähigkeit in Zelle Biologie Experimente. Darüber hinaus ist die exakte Quantifizierung und Beobachtung der Veränderungen der Zellmorphologie Erweiterung nicht in der Regel gemessenen9,10. Im Gegensatz dazu stellen wir Ihnen hier eine Technik, die Zelle Erweiterung Änderungen mit mikroskopischen Standardtechniken und leicht anpassbar in-vitro- Methoden genau quantifiziert. Diese Methoden auch quantifizieren jeden Erweiterungstyp Zelle gleichzeitig für jede Zelle analysiert und Veränderungen in der Zellmembran Erweiterung Repertoire zu bestimmen. Wir zeigen auch, wie diese Veränderungen auf Zelle Adhäsionseigenschaften beziehen können.
Als ein experimentelles Beispiel verwenden wir eine zuvor erstellte Zelllinie SW-13 bezeichneten SW-DDK3, das hat mit pCMV6-Eintrag/DKK3 Plasmid-Vektoren stabil transfiziert wurden und konstitutiv overexpresses DKK3, ein Unterscheidungsmerkmal in der Nebenniere. Non-transfizierten SW 13 und SW-13 Zellen mit leerer Vektor (pCMV6-Eintrag), benannten SW-Neo, stabil transfiziert werden als experimentelle Kontrollen dienen.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>11965-092</td><td>Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin</td></tr><tr><td>Deulbeco&#039;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>1X solution, used directly</td></tr><tr><td>3.7% formaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Dilute stock solution</td></tr><tr><td>0.05% crystal violet&amp;nbsp;</td><td>Harleco</td><td>192-12</td><td>Dilute stock solution</td></tr><tr><td>De-ionized water</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>Microscope with 400X magnification&amp;nbsp;</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Corning</td><td>353046</td><td>NA</td></tr><tr><td>Cell dissociation solution non-enzymatic 1X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5914&amp;nbsp;</td><td>1X solution, used directly</td></tr></tbody></table>

characterization of cell membrane extensions and studying their roles in cancer cell adhesion dynamics

Die Zellmembran Erweiterung Repertoire moduliert verschiedene bösartige Verhaltensweisen von Krebszellen, einschließlich ihrer Klebe- und wandernden Potenziale. Die Fähigkeit, genau zu klassifizieren und Zelle Erweiterungen zu quantifizieren und die Wirkung auf eine Zelle Klebstoff Kapazität zu messen ist entscheidend für die Bestimmung, wie Zelle Signalisierung Ereignisse Auswirkungen Krebs Zelle Verhalten und Aggressivität. Hier beschreiben wir die in-vitro- Gestaltung und Nutzung einer Zelle Quantifizierung Erweiterungsmethode in Verbindung mit einem Adhäsion Kapazität Assay in einem etablierten in-vitro- Modell für NNR-Karzinom (ACC). Insbesondere prüfen wir die Auswirkungen der DKK3, eine vermeintliche Tumorsuppressor und pro-Differenzierung Faktor auf der Membran Erweiterung Phänotyp der ACC-Zelllinie, SW-13. Wir schlagen diese Tests bieten relativ einfach, zuverlässig und leicht interpretierbare Metriken, misst diese Eigenschaften unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.

Unter Verwendung der oben genannten Assays, wurden die Auswirkungen der DKK3 Überexpression auf Verlängerung Zellmorphologie und Zelle Adhäsionseigenschaften in die etablierten ACC-Zellinie SW-13, in Vitrogetestet. DKK3 überexprimierenden Zellen wurden durch stabil transfecting SW-13 Zellen mit Myc-DDK tagged pCMV6-Eintrag/DKK3-Plasmid-Vektoren und als SW-DKK3 erzeugt. Ebenso wurden mit leerer Vektor pCMV6-Eintrag stabil transfizierten Zellen als Transfektion und Passagierung...

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Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

Diese Studie zeigt den nutzen und die einfache quantitative Zellmembran Erweiterung Messung und ihre Korrelation zum Klebstoff Kapazität von Zellen. Als ein repräsentatives Beispiel zeigen wir hier der Dickkopf-related Protein 3 (DKK3) fördert erhöhte Pseudopodien Bildung und Zelle Haftfähigkeit in NNR Karzinom-Zellen in Vitro.

Charakterisierung der Zellmembran Erweiterungen und studieren ihre Rolle im Krebs Zelle Adhäsion Dynamik

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

characterization-cell-membrane-extensions-studying-their-roles-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.4K Aufrufe.  Yale University School of Medicine. Diese Studie zeigt den nutzen und die einfache quantitative Zellmembran Erweiterung Messung und ihre Korrelation zum Klebstoff Kapazität von Zellen. Als ein repräsentatives Beispiel zeigen wir hier der Dickkopf-related Protein 3 (DKK3) fördert erhöhte Pseudopodien Bildung und Zelle Haftfähigkeit in NNR Karzinom-Zellen in Vitro.

Serie: Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Analyse der Zellmigration in eine dreidimensionale Kollagenmatrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Forschung

Biotechnik

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the homeostasis of adult tissues. Interestingly, oxidative stress can alter these processes, thus contributing to the pathophysiology of diseases such as metastatic cancer. Therefore, understanding the mechanism(s) of how cells attach and spread on the ECM during perturbations in redox status can provide insight into normal and disease states. Described below is a step-wise protocol that utilizes an immunofluorescence-based assay to specifically quantify cell adhesion and spreading of immortalized fibroblast cells on fibronectin (FN) in vitro. Briefly, anchorage-dependent cells are held in suspension and exposed to the ATM kinase inhibitor Ku55933 to induce oxidative stress. Cells are then plated on FN-coated surface and allowed to attach for predetermined periods of time. Cells that remain attached are fixed and labeled with fluorescence-based antibody markers of adhesion (e.g., paxillin) and spreading (e.g., F-actin). Data acquisition and analysis are performed using commonly available laboratory equipment, including an epifluorescence microscope and freely available Fiji software. This procedure is highly versatile and can be modified for a variety of cell lines, ECM proteins, or inhibitors in order to examine a broad range of biological questions.

This method is useful for quantifying the early dynamics of cellular adhesion and spreading of anchorage-dependent cells onto the fibronectin. Furthermore, this assay can be used to investigate the effects of altered redox homeostasis on cell spreading and/or cell adhesion-related intracellular signaling pathways.

Untersuchung der Dynamik der zellulären Adhäsion und Ausbreitung von Epithelzellen auf Fibronectin während oxidativen Stresses

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Biochemie

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration in more appropriate 3D environments, which better resemble the dimensionality of the physiological processes in question. Migratory cells can substantially differ in their morphology and mode of migration depending on whether they are moving on 2D or 3D substrates. Due to technical difficulties and incompatibilities with most standard protocols, structural and functional analysis of cells embedded within 3D matrices still remains uncommon. This article describes methods for preparation and imaging of 3D cancer cell cultures, either as single cells or spheroids. As an appropriate ECM substrate for cancer cell migration, we use nonpepsinized rat tail collagen I polymerized at room-temperature and fluorescently labeled to facilitate visualization using standard confocal microscopes. This work also includes a protocol for 3D immunofluorescent labeling of endogenous cell cytoskeleton. Using these protocols we hope to contribute to a better description of the molecular composition, localization, and functions of cellular structures in 3D.

This article presents a method to fluorescently label collagen that can be further used for both fix and live imaging of 3D cell cultures. We also provide an optimized protocol to visualize endogenous cytoskeletal proteins of cells cultured in 3D environments.

Enthüllung des Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

Medizin

Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is facilitated by actin-rich protrusions called invadopodia that proteolytically degrade the extracellular matrix (ECM). Invadopodia activity has been shown to be dependent on ECM rigidity and cancer cell contractile forces suggesting that rigidity signals can regulate these subcellular structures through actomyosin contractility. Invasive and contractile properties of cancer cells can be correlated in vitro using invadopodia and traction force assays based on polyacrylamide gels (PAAs) of different rigidities. Invasive and contractile properties of cancer cells can be correlated in vitro using invadopodia and traction force assays based on polyacrylamide gels (PAAs) of different rigidities. While some variations between the two assays exist, the protocol presented here provides a method for creating PAAs that can be used in both assays and are easily adaptable to the user&#8217;s specific biological and technical needs.

Mechanical rigidity in the tumor microenvironment plays a crucial role in driving malignant behavior by increasing invadopodia activity and actomyosin contractility. Using polyacrylamide gels (PAAs), invadopodia and traction force assays can be utilized to study the invasive and contractile properties of cancer cells in response to matrix rigidity.

Polyacrylamidgelen für Invadopodia und Traction Force-Assays auf Krebszellen

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

Analyse Zelloberflächenhaftung Remodeling in Reaktion auf mechanische Spannung Mit Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Biologie

Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers

The methods presented here quantify some parameters of confluent adherent cell monolayers from multiple appropriately stained confocal images: adhesion to the substrate as a function of the number and size of focal adhesions, and cell shape, characterized by the cell shape index and other shape descriptors. Focal adhesions were visualized by paxillin staining and cell-cell borders were marked by junction plakoglobin and actin. The methods for cell culture and staining were standard; images represent single focal planes; image analysis was performed using publicly available image processing software. The presented protocols are used to quantify the number and size of focal adhesions and the differences in cell shape distribution in the monolayers, but they can be repurposed for the quantification of the size and shape of any other distinct cellular structure that can be stained (e.g., mitochondria or nuclei). Assessing these parameters is important in the characterization of the dynamic forces in adherent cell layer, including cell adhesion and actomyosin contractility that affects cell shape.

The article describes quantification of 1) the size and number of focal adhesions and 2) cell shape index and its distribution from confocal images of the confluent monolayers of MCF7 cells.

Quantifizierung von Zell-Substrat-Adhäsionsflächen und Zellformverteilungen in MCF7-Zell-Monolayern

The methods presented here quantify some parameters of confluent adherent cell monolayers from multiple appropriately stained confocal images: adhesion to ...

Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out shape. Following the cell-substrate attachment, the cell forms a thin sheet of lamellipodia emanating from the cell body. In the lamellipodia, globular actin (G-actin) monomers polymerize into a dense filamentous actin (F-actin) meshwork that pushes against the plasma membrane, thereby providing the mechanical forces required for the cell to spread. Notably, the molecular players that control the actin polymerization in lamellipodia are essential for many other cellular processes, such as cell migration and endocytosis. 
Since spreading cells form continuous lamellipodia that span the entire cell periphery and persistently expand outward, cell spreading assays have become an efficient tool to assess the kinetics of lamellipodial protrusions. Although several technical implementations of the cell spreading assay have been developed, a detailed description of the workflow, which would include both a step-by-step protocol and computational tools for data analysis, is currently lacking. Here, we describe the experimental procedures of the cell spreading assay and present an open-source tool for quantitative and unbiased analysis of cell edge dynamics during spreading. When combined with pharmacological manipulations and/or gene-silencing techniques, this protocol is amenable to a large-scale screen of molecular players regulating lamellipodial protrusions.

In this protocol, we present the experimental procedures of a cell spreading assay that is based on live-cell microscopy. We provide an open-source computational tool for the unbiased segmentation of fluorescently labeled cells and quantitative analysis of lamellipodia dynamics during cell spreading.

Quantitative Analyse der Zellkantendynamik während der Zellstreuung

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of inflammation. This phenomenon occurs in postcapillary venules, where blood flow pushes leukocytes in a rolling motion on the endothelial cells. Stable rolling requires a delicate balance between adhesion bond formation and their mechanically-driven dissociation, allowing the cell to remain attached to the surface while rolling in the direction of flow. Unlike other adhesion processes occurring in relatively static environments, rolling adhesion is highly dynamic as the rolling cells travel over thousands of microns at tens of microns per second. Consequently, conventional mechanobiology methods such as traction force microscopy are unsuitable for measuring the individual adhesion events and the associated molecular forces due to the short timescale and high sensitivity required. Here, we describe our latest implementation of the adhesion footprint assay to image the P-selectin: PSGL-1 interactions in rolling adhesion at the molecular level. This method utilizes irreversible DNA-based tension gauge tethers to produce a permanent history of molecular adhesion events in the form of fluorescence tracks. These tracks can be imaged in two ways: (1) stitching together thousands of diffraction-limited images to produce a large field of view, enabling the extraction of adhesion footprint of each rolling cell over thousands of microns in length, (2) performing DNA-PAINT to reconstruct super-resolution images of the fluorescence tracks within a small field of view. In this study, the adhesion footprint assay was used to study HL-60 cells rolling at different shear stresses. In doing so, we were able to image the spatial distribution of the P-selectin: PSGL-1 interaction and gain insight into their molecular forces through fluorescence intensity. Thus, this method provides the groundwork for the quantitative investigation of the various cell-surface interactions involved in rolling adhesion at the molecular level.

This protocol presents the experimental procedures to perform the adhesion footprint assay to image the adhesion events during fast cell rolling adhesion.

Abbildung der molekularen Adhäsion im Zellrollen durch Adhäsion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the construction and regeneration of tissues, and is critical in embryonic development, immunological responses, and wound healing. Dysregulation of cell motility contributes to pathological disorders, such as chronic inflammation and cancer metastasis. Cell migration, tissue invasion, axon, and dendrite outgrowth all initiate with actin polymerization-mediated cell-edge protrusions. Here, we describe a simple, efficient, time-saving method for the imaging and quantitative analysis of cell-edge protrusion dynamics during spreading. This method measures discrete features of cell-edge membrane dynamics, such as protrusions, retractions, and ruffles, and can be used to assess how manipulations of key actin regulators impact cell-edge protrusions in diverse contexts.

This protocol aims to measure the dynamic parameters (protrusions, retractions, ruffles) of protrusions at the edge of spreading cells.

Messung der Zellkanten-Überstandsdynamik während des Streuens mittels Lebendzellmikroskopie

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

Cytoskeleton and Focal Adhesion Organization Assay: An Immunofluorescence-based Method to Study Cell Adhesion and Spreading on Substrates

Source: Ali, M. Y et al., <a href="https://www.jove.com/v/52532"> Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video describes the technique of studying the cytoskeleton and focal adhesions in primary human colon cancer cells to understand its variations depending on substrate rigidity. This culture of cancer cells on soft and hard substrates allows various downstream biophysical measurements for cancer prognosis.

Zytoskelett und fokaler Adhäsionsorganisationsassay: Eine Immunfluoreszenz-basierte Methode zur Untersuchung der Zelladhäsion und -ausbreitung auf Substraten

Source: Ali, M. Y et al.,  Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for ...