The Rheumatology Research Foundation and the Hirschil Trust supported this work.

1. Auflage die CHO-Zellen ICAM Hinweis: Das Ziel dieses Schrittes ist die CHO-ICAM-Zellen in den Strömungskammern für das Wachstum über Nacht mit dem Ziel der Erzeugung einer konfluenten Monoschicht zu plattieren. <ol><li> Pflegen CHO-ICAM-Zellen in 10 cm Gewebekultur behandelten Kulturschalen in 10 ml RPMI-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (CHO-ICAM kompletten Kulturmedium) bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Um Zellen zu sammeln, 1 ml 0,5% Trypsin-EDTA und Inkubation bei Raumtemperatur für 1 min unter leichtem Schütteln. Neutralisieren des Trypsins mit 4 ml Medium. </li><li> Zählen Sie die CHO-ICAM - Zellen eine Hemacytometer mit und berechnen 0,75 x 10 5 Zellen pro Kammer. Anmerkung: In diesem Experiment: 2.25 x 10 5 Zellen werden auf Saatgut 3 Kammern erforderlich sein. </li><li> Zentrifuge 0,75 x 10 5 CHO-ICAM - Zellen pro Kammer für 5 min bei 500 · g, Raumtemperatur und Resuspendieren des Zellpellets in 30 &amp; mgr; l pro Kammer von CHOICAM komplette Kulturmedien. Anmerkung: In diesem Experiment 90 &amp; mgr; l wird auf Saatgut 3 Kammern erforderlich sein. </li><li> Fügen Sie langsam die Zellen in ein Reservoir der Strömungskammer. Lassen Sie die Zellen für 5 min in 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 zu begleichen. </li><li> In 200 ul kompletten Kulturmedien über die beiden Stauseen jeder Kammer. Abwechselnden Zugaben zwischen den beiden Bewegung der Zellen zu vermeiden, da das System äquilibriert. </li><li> Inkubieren der Zellen über Nacht in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2. </li></ol> 2. Herstellung der T-Zellen Anmerkung: Dieser Test kann mit primären humanen T-Zellen oder T-Zelllinie durchgeführt werden. Ein Protokoll auf T - Zell - Isolierung aus Blut zuvor beschrieben worden ist . 10 Bei der Verwendung von primären humanen T - Zellen frisch isolierten Zellen für beste Ergebnisse. Wenn eine T-Zelllinie verwenden, befolgen Sie die Kultur-Protokoll durch die Quelle der Zellen angegeben. Um die Zellen auf einem Fluoreszenz microsco nachzuweisenpe die T-Zellen mit Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE) markiert sind. <ol><li> Zählen Sie die T - Zellen eine Hemacytometer mit und berechnen 2 x 10 6 Zellen pro Kammer. Anmerkung: In diesem Experiment wurden 6 x 10 6 Zellen werden für 3 Kammern erforderlich sein. </li><li> Zentrifuge 2 x 10 6 T - Zellen pro Kammer für 5 min bei 500 · g, Raumtemperatur und Resuspendieren der Zellen in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) , enthaltend 1% Glucose oder 2% FBS. </li><li> In CFSE bei 1: 1000 Verdünnung (Lager aus bis 5 mm). Cover von Licht und Inkubation für 8 min bei RT </li><li> Spin bei 500 × g für 5 min, RT. </li><li> Resuspendieren Zellpellet mit 240 &amp; mgr; l pro Zustand (siehe Kapitel 4 &quot;Hinweis&quot;) von RPMI Medium ohne Serum. In diesem Experiment Zellpellet in 720 ul RPMI Ebene. Teilen Sie die Zellen in leere 1,5-ml-Röhrchen für jede Kammer beschriftet, 240 &amp; mgr; l pro Röhrchen. Halten Sie Zellen in einem 37 ° C Wärmeblock bis zur Verwendung. </li></ol> 3. Definieren von the Input / Output Verschlauchung und Spritzenpumpe <ol><li> Wärmen Sie das Mikroskop Live-Imaging-Kammer auf 37 ° C. </li><li> Bereiten Sie die Eingabe Verschlauchung: <ol><li> Füllen Sie eine 500 ml Glasflasche mit Wasser und machen zwei Löcher in den Deckel. Beschriften Sie die Löcher &quot;in&quot; und &quot;out&quot;. Dies wird für die Eingabemedien als Heizwasser Bad handeln. </li><li> Führen Sie die Eingabe durch die Löcher in dem Deckel und in das Wasserbad abspritzen. Stellen Sie sicher , dass die Seite des Schlauches, der an der Spritze verbindet kommt durch die &quot;in&quot; Loch und der Seite , die mit dem Eingangsbehälter verbinden die &quot;out&quot; Loch kommt durch. </li><li> Spülen Sie die Eingabe mit 60 ml Wasser abspritzen alle Luft aus dem System zu entfernen. </li><li> Prime die Eingangs hosing mit RPMI - Medium Serum fehlt erwärmt auf 37 ° C. Füllen Sie eine 60-ml-Spritze und drücken durch die Medien, bis der Schlauch vollständig grundiert und ohne alle Luftblasen. Hinweis: Je nach length Schlauch verwendet, um das Volumen zu grundieren erforderlich variieren. <ol><li> Berechnen des Volumens der Medien für das Experiment erforderlich, indem die Strömungsgeschwindigkeit multipliziert wird (hier 0,3 ml / min) durch die Anzahl der Minuten (5 min) durch die Anzahl der Kammern in dem Experiment (hier 3); in diesem Experiment verwendet werden 4,5 ml Medium. Hinweis: Wir empfehlen 5 ml zusätzliches Volumen (hier in Höhe von insgesamt 9,5 ml) in der Spritze verbleibenden nach dem Grundieren. </li></ol></li><li> Platzieren Sie die gesamte Eingabe - Setup in die Live - Bildgebung Gehäuse des Mikroskops 37 ° C zu halten. Führen Sie den Schlauch und Spritze aus dem Gehäuse heraus und laden Sie die Spritze in die Spritzenpumpe. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Ausgabe Verschlauchung: <ol><li> Machen Sie ein Loch in den Deckel einer 250 - ml - Flasche als Ausgangs Abfall zu verwenden. </li><li> Führen Sie den Ausgangsschlauch durch das Loch und in die Flasche. Angelehnt an die Deckel zu sichern, nicht den ganzen Weg zu schließen. </li><li> Legen Sie die Ausgabeeinstellung in die Live - Imaging - Gehäuse des mikop. </li></ol></li><li> Berechnen der Fließgeschwindigkeit (ml / min) erforderlich , um die gewünschte Scherbeanspruchung (dyn / cm 2) zu erzeugen. Schubspannung variiert in den verschiedenen Gefäßfächer, daher berücksichtigen, die Gesamtmodell einschließlich Zelltypen untersucht und Behandlungen werden, wenn sie auf einer Schubspannung Ebene zu entscheiden. Hinweis: Diese Experimente durchgeführt werden , bei 0,4 dyn / cm 2 bis eng eine kleine Vene Einstellung zu imitieren. <ol><li> Nehmen Sie die Kammer Dimensionen berücksichtigen, wenn sie Scherspannung zu berechnen. Verwenden Sie die folgende Formel ( zur Verfügung gestellt vom Hersteller 11) für die Strömungskammern verwendet hier (Siehe Tabelle der Materialien): T = η * 176,1 * ø wobei T = Schubspannung, η = dynamische Viskosität, ø = Durchfluss. Hinweis: Die dynamische Viskosität von RPMI-Medium bei 37 ° C 0,007 ist. </li></ol></li></ol> 4. Laden der Strömungskammern und Stimulation der Zellen Hinweis: Um die Haftung zu initiieren,T-Zellen müssen stimuliert werden. In dem folgenden Experiment werden die Zellen bleiben entweder unstimuliert oder werden mit SDF-1α 12 oder Phorbolmyristatacetat (PMA; positive Kontrolle) stimuliert 13. Für die korrekte Darstellung von Chemokin auf T-Zellen, CHO-ICAM-Zellen werden mit SDF-1α (gefolgt von seriellen Wäschen), so dass für die Präsentation auf der Zelloberfläche vorinkubiert. PMA ist ein Phorbolester, die strukturell ähnlich dem zweiten Messenger Diacylglycerol (DAG) ist; hier wird es als positive Kontrolle verwendet. T-Zellen werden direkt mit PMA behandelt, bevor es in die Strömungskammer zu laden. <ol><li> Platzieren Sie die Flusskammer gleiten auf dem Mikroskop und stellen Sie die Fokusebene auf der CHO-ICAM einschichtigen die 20x-Objektiv verwendet wird. </li><li> Halten Sie CFSE-gefärbten T-Zellen für alle anderen Bedingungen in der 37 ° C Heizblock. Herstellung der CHO-ICAM oder T-Zellen, wie dem Assay für den Zustand unmittelbar vor folgt: <ol><li> Für die nicht-stimulierten Zustand (Kammer 1) halten ein Rohr / Fluss chBernstein unbehandelt, als negative Kontrolle für die Stimulation dienen. </li><li> Für PMA-Stimulation (Kammer 2), stimulieren eine Röhre von T-Zellen mit PMA (10 ng / ml) als Positivkontrolle zu dienen; sofort behandeln, bevor sie in Flusskammer geladen werden. </li><li> Für SDF-1α Stimulation (Kammer 3), stimulieren die dritte Strömungskammer mit SDF-1α (100 ng / ml) von 70 &amp; mgr; l zu einem Zeitpunkt 3 Mal von dem oberen Reservoir (Ausgangsbehälter) Entfernen und Hinzufügen dann 70 ul SDF -1α (100 ng / ml) in den unteren Behälter (Eingangsbehälter). Inkubieren für 5 min. </li></ol></li><li> Entfernen und entsorgen 70 &amp; mgr; l zu einer Zeit , 3 - mal aus dem Ausgabebehälter von einer Kammer. </li><li> Hinzufügen , 70 &amp; mgr; l vorbehandelte (gegebenenfalls) T - Zellsuspension in den Eingangsbehälter 3 mal. Warten 5 min die Zellen zu ermöglichen, von dem Einlass der Kammer ( &quot;In&quot;) zu bewegen, und dem proximalen Auslass ( &quot;Out&quot;) der Kammer zu erreichen. </li><li> Während dieser Zeit Bild 5Felder für CFSE-gefärbten T-Zellen. Wählen Felder, die während der Mitte der Kammer verteilt sind (Abbildung 1). Verwenden Sie die folgenden Anregungs- / Emissionsbedingungen: Anregung Laser-Wellenlänge: 488 nm; Emissionssammelfilter: 500 - 540 nm. Diese Bilder werden als die Pre-Flow-Zellzählungen dienen. </li><li> Bringen Sie die Eingangs- und Ausgangsleitungen gleichzeitig an die Strömungskammer Stauseen. Hinweis: Anbringen der Schläuche gleichzeitig kritisch ist, so dass keine Luftblasen in die Kammer und die Aufrechterhaltung Gesamtgleichgewicht innerhalb der Kammer einzuführen. </li><li> Beginnen Fluss bei 0,3 ml / min (0,4 dyn / cm 2) , während die CFSE-gefärbten T - Zellen sichtbar zu machen . Als Fluss beginnt, insbesondere mit der ersten Kammer, gibt es oft eine Verzögerung zwischen Strömungs Initiierung und T-Zell-Roll Beobachtung daher Zeitpunkt 5 min zu Beginn der T-Zell-Bewegung zu beginnen. </li><li> Terminate Fluss nach 5 min und Bild 5 Felder in der CFSE-Kanal. Wählen Sie Felder zufällig verteilten throughout der Mitte der Strömungskammer (Abbildung 1). Diese Bilder werden als die Post-Flow-Zellzählungen dienen. </li></ol> 5. Bestimmung des Prozentsatzes von adhärenten Zellen Anmerkung: Die Bestimmung der Anzahl der Zellen in den erfassten Bildern wird objektiv mit automatisierter Software. Für unsere Untersuchungen verwendeten wir die Software Volocity (Version 6.2.1), aber auch andere Software wie ImageJ (Version 1.48V) sind ebenfalls anwendbar. <ol><li> Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen pro Feld Pre-Flow für jede Bedingung. Der Mittelwert der 5 Feldern ist die &quot;pre-Strömungs durchschnittliche Zellzahl.&quot; 7 </li><li> Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen pro Feld Nachströmzeit für jede Bedingung. Der Durchschnitt der fünf Felder ist die &quot;post-flow durchschnittliche Zellzahl.&quot; 7 </li><li> Der prozentuale Anteil der adhärenten Zellen mit der folgenden Formel: Anteil der anhaftenden Zellen = (post-Strömungs durchschnittliche Zellzahl) / (pre-Strömungs durchschnittliche Zellzahl) x 100%. </li></ol>

<ol>
	<li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+on+the+run:+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells.">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membranes+as+messengers+in+T+cell+adhesion+signaling.">Membranes as messengers in T cell adhesion signaling.</a> Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).</li><li>Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+GTPases+and+LFA-1+reciprocally+modulate+adhesion+and+signaling.">Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling.</a> Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).</li><li>Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration.">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li><li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-triggered+leukocyte+arrest:+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts.">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li><li>Su, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+and+its+effector+RIAM+are+required+for+lymphocyte+trafficking.">Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking.</a> Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).</li><li>Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. 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(88), (2014).</li><li>Ibidi GmbH. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+and+shear+rates+for+ibidi+&#956;-Slides+-+based+on+numerical+calculations.">Shear stress and shear rates for ibidi &#956;-Slides - based on numerical calculations.</a> Application Note 11. , (2014).</li><li>van Gijsel-Bonnello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantethine+Alters+Lipid+Composition+and+Cholesterol+Content+of+Membrane+Rafts,+With+Down-Regulation+of+CXCL12-Induced+T+Cell+Migration.">Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration.</a> J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).</li><li>Tozeren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+adhesion+of+phorbol+12-myristate-13-acetate-stimulated+T+lymphocytes+to+planar+membranes+containing+intercellular+adhesion+molecule-1.">Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1.</a> Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).</li><li>Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+mechanisms+regulating+chemokine+activity+and+availability.">Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability.</a> Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).</li><li>Rot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+binding+assay+for+studying+chemokine+interactions+with+endothelial+cells.">In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells.</a> J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1+regulates+neutrophil+adhesion+and+transcellular+migration+of+TNF-alpha-activated+vascular+endothelium+under+flow.">ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow.</a> Blood. 106 (2), 584-592 (2005).</li><li>Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1:+getting+a+grip+on+leukocyte+adhesion.">ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion.</a> J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Um das Stimulans richtig T - Zell - Adhäsion zu analysieren, um in die Studie aufgenommen werden müssen berücksichtigt werden , wenn ein in vitro - Verfahren wählen. Zwar gibt es mehrere Assays sind Signale zu untersuchen, die zu LFA-1-Aktivierung und ICAM-1-Bindung Alle Methoden sind nicht austauschbar. Eine statische Adhäsionstest 10 ist am besten geeignet , T - Zell-APC - Wechselwirkungen zu untersuchen; alternativ detailliert die Schubspannung Methode hier ist ideal T - Zell-epithelialen Zel...

T - Lymphozyten - Adhäsion vermittelt eine Anzahl verschiedener Prozesse in einem gesunden Immunsystem, 3 entscheidende Rolle bei der T - Zell - Handel und Antigenpräsentation spielen. Ob bei der Immunüberwachung oder eine aktive Immunantwort diese beiden Rollen breiten für die Haftung sind kritisch. 4 Die physiologischen Signalereignisse von T - Zell-Endothel-Interaktionen unterscheiden sich von T - Zell-Antigen - präsentierenden Zellen (APC) Wechselwirkungen und erfordern daher unterschiedliche Methoden Studie am besten verstehen, die signal~~POS=TRUNC beteiligt. Die feste Haftung einer T-Zelle zu einer Blutgefäßwand während der Lymphozyten-Extravasation erfordert eine schnelle und dynamische Integrin-Aktivierung. Die enge Wechselwirkung zwischen einem aktiven Zustand Integrin und Adhäsionsmoleküle entlang des Endothels führt zu beständige Haftung auf den Fluss von Blut, T - Zellen , so dass auf der Suche nach einer Fläche permissive Zellpassage entlang der Oberfläche zu kriechen. 5 Das Crawling einer T - Zelle bi -directionally Alonga Blutgefßwand ist angewiesen auf polarisierter Adhäsion, mit einem ausgeprägten Klebe vorderen Ende der T - Zelle. 6 Am wichtigsten ist, feste Adhäsion und Transmigration erfordern Widerstand gegenüber der Scherkraft , die durch den Blutfluss zirkuliert. Wenn Experimente entwerfen Lymphozytenadhäsion zu studieren, sollten ihr Augenmerk auf den spezifischen Reiz von Zinsen gezahlt werden. Während Integrin-Aktivierung eine übliche und wichtige Komponente für alle Formen der T-Zell-Adhäsion, sind die Kaskaden von der Aktivierung wahrscheinlich einzigartig nachgeordnet einzelnen Rezeptoren und Co-Rezeptoren zu sein. Ebenso funktionieren Integrin und Adhäsionsmolekül-Paare in spezialisierten Mikroumgebungen und auf spezifische Subpopulationen. Auf diese Weise können diese Paare ganz anders geregelt werden. Das Modell präsentiert hier ist ideal für die Untersuchung von Signalkaskaden , die zu Integrin - Aktivierung unter Scherspannungsbedingungen nehmen. 7 Diese Wechselwirkungen können nicht adäquat in einem statischen ADHESI verstanden werdenauf System , um die Auswirkungen durch diese Kräfte direkt auf T - Zellen - Verhalten gezeigt haben , wurden. 8 Obwohl hier mit T - Zellen und CHO (Chinese Hamster Ovary) Zellen entwickelt , um menschliche ICAM-1 (CHO-ICAM - Zellen) exprimieren das System präsentiert werden , können leicht modifiziert werden, um verschiedene Leukozytenpopulationen oder Adhäsionsmoleküle zu untersuchen. Dieser Test stellt ein Verfahren T-Zell-Klebrigkeit und Integrin-Aktivierung unter Verwendung von Scherspannung zu quantifizieren, ein Modell für die feste Haftung Stadium der Leukozytenextravasation bereitstellt. Durch die Verwendung von CHO-Zellen ICAM die Affinität von LFA-1 für seinen Liganden in lebenden Zellen können in Echtzeit in Reaktion auf verschiedene Stimuli von Interesse untersucht werden. Diese Technik erfordert einfach erhalten, im Handel erhältliche Mikroströmungskammern in Kombination mit einer Spritzenpumpe, stark die Ausrüstung vereinfacht notwendigen Durchblutung und Scherspannung im Vergleich zu anderen Modellen. 9 Ein weiterer großer Vorteil dieses Assays zu modellieren ist , dass spezifische SignalKaskaden und der resultierende Aktivierungszustand einzelner Integrine sauber durch die Verwendung von gentechnisch veränderten CHO-Zellen können menschlichen Adhäsionsmoleküle von Interesse exprimieren, untersucht. Darüber hinaus ist die Kombination von quantitativen Daten mit lebenden Zellen ein wesentlicher Vorteil dieser Methode. Insgesamt während eine Reihe von Tests der statischen T Zelladhäsion beschrieben wurden, die gut T-Zell-APC-Interaktionen zu modellieren, sind diese Modelle nicht ausreichend in den dynamischen Prozess der T-Zell-epitheliale Adhäsion zu erfassen. Aus diesem Grund wird, wenn ein Adhäsionstest der Reiz in Frage entscheiden müssen berücksichtigt werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="950">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">T cell samples (cell line or primary)</td>
			<td style="width:269px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">TIB-152</td>
			<td style="width:248px;">Peripheral human T cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CHO-ICAM-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-2093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#181;-Slide VI 0.4 ibiTreat</td>
			<td>ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">500 ml glass bottle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB800500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250 ml glass bottle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB800250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silicone tubing 0.8 mm</td>
			<td>ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal microscope with incubator chamber</td>
			<td>Ziess</td>
			<td style="width:119px;">700</td>
			<td>Any wide field fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td style="width:119px;">NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">60 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:119px;">309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFSE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">65-0850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SDF-1&#945;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">350-NS-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI</td>
			<td>Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-702F/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">16561-29-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Volocity software</td>
			<td style="width:269px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:269px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.48V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP295950</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay of adhesion under shear stress for the study of t lymphocyte-adhesion molecule interactions

Insgesamt ist T Zelladhäsion eine kritische Komponente der Funktion, einen Beitrag zu den unterschiedliche Prozesse der zellulären Rekrutierung von Entzündungsherden und die Wechselwirkung mit Antigen-präsentierenden Zellen (APC) in der Bildung von immunologischen Synapsen. Diese beiden Kontexte T Zelladhäsion unterscheiden, daß T-Zell-APC-Interaktionen statisch betrachtet werden können, während T-Zell-Wechselwirkungen Blutgefß durch die Scherbeanspruchung durch Zirkulation selbst erzeugt werden, in Frage gestellt. T-Zellen-APC-Wechselwirkungen werden als statisch klassifiziert, dass in den beiden Zellpartnern sind statisch relativ zueinander. Normalerweise tritt diese Wechselwirkung innerhalb der Lymphknoten. Als eine T - Zelle mit der Blutgefäßwand in Wechselwirkung tritt, verhaften die Zellen und muss die erzeugte Scherbeanspruchung zu widerstehen. 1,2 markieren Diese Unterschiede die Notwendigkeit einer besseren statischen Haftung und Haftung unter Strömungsbedingungen als zwei unterschiedliche regulatorische Prozesse zu verstehen. Die Regulation der T-Zell-Adhäsion am meisten werden kann kurz und bündig als con beschriebenTrolling die Affinitätszustand von Molekülen exprimiert auf der Zelloberfläche Integrin, und somit die Wechselwirkung von Integrinen mit den adhesion molecule-Liganden auf der Oberfläche der Zelle exprimiert Interaktion reguliert wird. Unsere aktuellen Verständnis der Regulation von Integrin Affinität Staaten kommt von häufig vereinfachend in vitro Modellsystemen. Der Test der Adhäsion Strömungsbedingungen unter Verwendung von hier ermöglicht folgenden Stimulus für die Visualisierung und genaue Quantifizierung von T-Zell-epithelialen Zell-Wechselwirkungen in Echtzeit beschrieben. Eine Haftung unter Strömungs Assay kann auf Studien der Haftung angewendet werden Signalgebung innerhalb von T-Zellen nach der Behandlung mit inhibitorisch oder stimulatorisch Substanzen. Darüber hinaus kann dieser Test über T-Zell-Signalgebung auf jede Klebe Leukozytenpopulation und jedes Integrin-Adhäsionsmolekül Paar erweitert werden.

Repräsentative Ergebnisse sind aus der Strömungs Adhäsionsassay gezeigt unter Verwendung von Jurkat und primären humanen CD3 + T - Zellen, wie angegeben, stimuliert mit SDF-1α. Die negativen Kontrollen in allen gezeigten Experimente sind nicht stimulierten Zellen. Ein Schwellenwert basal Prozent Anhaftung von nicht-stimulierten Zellen von 5 - 10%; Basis Haftung zeigt insbesondere eine problematische Experiment über diesem Bereich und schlägt vor, die Start Population vo...

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Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Dieser Strömungs Adhäsionsassay stellt eine einfache, hochschlag Modell von T-Zell-epithelialen Zell-Wechselwirkungen. Eine Spritzenpumpe wird verwendet, Scherspannung zu erzeugen, und die konfokale Mikroskopie erfasst Bilder für die Quantifizierung. Das Ziel dieser Studien ist es, um effektiv T Zelladhäsion quantifizieren Strömungsbedingungen.

Test der Haftung unter Scherspannung für das Studium der T-Lymphozyten-Adhäsions-Molekül-Wechselwirkungen

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.4K Aufrufe.  New York University School of Medicine.  Dieser Strömungs Adhäsionsassay stellt eine einfache, hochschlag Modell von T-Zell-epithelialen Zell-Wechselwirkungen. Eine Spritzenpumpe wird verwendet, Scherspannung zu erzeugen, und die konfokale Mikroskopie erfasst Bilder für die Quantifizierung. Das Ziel dieser Studien ist es, um effektiv T Zelladhäsion quantifizieren Strömungsbedingungen. 

Serie: Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

Die Verwendung einer optischen Falle für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen für Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Verwendung von<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Zum Autophagie-Zytoskelett Interaktionen zu untersuchen

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Statische Haftung Assay für das Studium der Integrin-Aktivierung in T-Lymphozyten

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In-vitro- und In-vivo-Modell, um die bakterielle Adhäsion an der Gefäßwand unter Strömungsbedingungen Studieren

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.

Hochmultiplexed, Super-Auflösung Bildgebung von T-Zellen mit madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Dynamische Adhäsion Assay für die funktionelle Analyse von Anti-Adhäsion Therapien bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...