Dieses Protokoll hilft, die Verbindung zwischen molekularer Kraft und Zellrollenverhalten herzustellen und ermöglicht es, die rollende Adhäsion auf molekularer Ebene räumlich abzubilden und zu quantifizieren. Diese Technik ermöglicht es, individuelle Adhäsionsereignisse während des eigentlichen Zellrollens zu untersuchen, so dass wir die physiologisch relevante molekulare Adhäsionskraft direkt messen können. Die Oberflächenvorbereitung mit der entsprechenden Konzentration und Inkubationszeit in jedem Schritt ist entscheidend, um eine qualitativ hochwertige Oberflächenfunktionalisierung zu erreichen.
Die Qualität der Biokonjugationen und die richtigen Bedingungen sind ebenfalls entscheidend. Die visuelle Demonstration ist entscheidend, um Forschern zu helfen, dieses Protokoll zu replizieren. Insbesondere die Schritte wie die Montage der Durchflusskammer und die Nachbearbeitung von Bildern werden von einer visuellen Demonstration stark profitieren.
Beginnen Sie, indem Sie eine kleine Menge Epoxidharz auf beiden Seiten des doppelseitigen Klebebandes mit einer Rasierklinge dünn verteilen. Schneiden Sie das epoxidbeschichtete Klebeband mit einem Laser ab, um vier Kanäle zu erzeugen. Erstellen Sie den Flow-Chip, indem Sie das Epoxidband zwischen einem Vier-Loch-Schlitten und einem PEG-Deckglas einklemmen.
Üben Sie mit einer Pipettenspitze sanften Druck entlang der Länge der Kanäle aus, um eine gute Abdichtung zu erzeugen, und härten Sie das Epoxidharz dann für mindestens eine Stunde aus. Richten Sie den Chip so aus, dass die Öffnung jedes Kanals in der Mitte des Adapters positioniert ist. Platzieren Sie dann zwei transparente Acryl-Abstandhalter auf dem Chip.
Üben Sie festen Druck in der Mitte des Blocks aus und schrauben Sie an den Enden jedes Abstandhalters. Schrauben Sie die Einlässe in die Gewindelöcher auf der anderen Seite der Halterung und überwachen Sie den Dichtungszustand durch den transparenten Acrylblock. 200 Mikroliter Waschpuffer in die Kammer strömen, um nach Leckagen zu suchen.
Wenn sich Blasen im Kanal bilden, drücken Sie aggressiv weitere 200 Mikroliter Waschpuffer, um die Blasen zu entfernen. Geben Sie 40 Mikroliter BSA in die Durchflusskammer, um eine unspezifische Bindung zu verhindern, und inkubieren Sie für 10 Minuten in der Feuchtigkeitskammer. Nach der Inkubation 40 Mikroliter bei Tween 20 in die Durchflusskammer geben und erneut 10 Minuten inkubieren, um die unspezifische Bindung weiter zu reduzieren.
Dann waschen Sie den Kanal mit 200 Mikrolitern Waschpuffer, um alle Passivierungsmittel zu entfernen. Für die Funktionalisierung der Kammeroberfläche fügen Sie 40 Mikroliter Streptavidin in die Durchflusskammer hinzu und inkubieren Sie für 20 Minuten, dann waschen Sie die Kammer mit 200 Mikrolitern Waschpuffer. Geben Sie nun 40 Mikroliter hybridisiertes Protein G-TGT in die Durchflusskammer und inkubieren Sie für 20 Minuten.
Nach dem Waschen mit Waschpuffer 40 Mikroliter Protein G-TGT oberer Strang hinzufügen und 20 Minuten inkubieren, um jeden unhybridisierten TGT-Bodenstrang auf der Oberfläche zu vervollständigen, und dann mit Waschpuffer waschen. Zum Schluss 40 Mikroliter P-Selectin-Fc in die Durchflusskammer geben und vor dem Waschen mit Waschpuffer 60 Minuten inkubieren. Füllen Sie eine Fünf-Milliliter-Glasspritze mit dem Rollpuffer und klopfen Sie auf die Seiten der Spritze, um die Blasen zu lösen und herauszudrücken, während sie in Richtung der Spitze schweben.
Nachdem Sie eine sterile Nadel in ein 200 Millimeter großes Stück Polyethylenschlauch eingeführt haben, verbinden Sie die Nadel mit der Glasspritze. Befestigen Sie die Spritze an der Spritzenpumpe und neigen Sie die Spritzenpumpe so, dass die Kolbenseite angehoben ist, um zu verhindern, dass Luftblasen in den Kanal gelangen. Setzen Sie das Ende des Rohrs in den Einlass der Durchflusskammer ein.
Setzen Sie ein Ende eines weiteren 200-Millimeter-Stücks des Polyethylenschlauchs in den Auslass ein und tauchen Sie das andere Ende in ein Abfallbecherglas. Nehmen Sie ein bis zwei Milliliter der Zellsuspensionsprobe und zentrifugieren Sie sie, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie das Medium und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 500 Mikrolitern des Rollpuffers.
Trennen Sie den Schlauch vorsichtig von den Einlässen und dem Auslass und pipettieren Sie 40 Mikroliter der Zellsuspension in die Durchflusskammer. Schließen Sie den Schlauch wie zuvor beschrieben wieder an, um sicherzustellen, dass keine Blasen in den Strömungskanal eingeführt werden. Beginnen Sie das Zellwalzexperiment, indem Sie die Spritzenpumpe mit den gewünschten Durchflussraten starten.
Beobachten Sie das Rollen von Zellen mit einem Dunkelfeldmikroskop mit einem 10-fachen Objektiv. Sobald das Experiment abgeschlossen ist, entfernen Sie die Zellen aus dem Kanal, indem Sie den Rollpuffer mit 100 Millilitern pro Stunde infundieren, bis die Oberfläche zellfrei ist. Um die lokalen Spuren durch DNA-PAINT abzubilden, fügen Sie dem Kanal 40 Mikroliter DNA-PAINT-Imager-Strang hinzu, der im DNA-PAINT-Puffer hergestellt wurde.
Führen Sie eine totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung der im Textmanuskript genannten Bedingungen durch. Lokalisieren und rendern Sie die hochauflösenden Bilder. Um die langen Spuren durch permanente Beschriftung abzubilden, fügen Sie den permanenten Imager-Strang hinzu und inkubieren Sie für 120 Sekunden im T50M5-Puffer.
Dann waschen Sie den Kanal, indem Sie 200 Mikroliter Waschpuffer infundieren. Nehmen Sie ein Bild mit ausgeschaltetem Anregungslaser auf, um Hintergrundrauschen der Kamera zu erhalten. Stellen Sie eine große Fläche in einem Gittermuster mit TIRF-Mikroskopie dar.
Programmieren Sie das Mikroskop so, dass es über die Fläche von 400 mal 50 Bildern scannt, und teilen Sie die Rohdaten mit dem Programm ImageJ in einzelne TIP-Dateien mit jeweils maximal 10.000 Bildern auf. Reduzieren Sie alle Bilder mit dem Beleuchtungsprofil und verwenden Sie das MIST-Plugin, um die Bilder zusammenzusetzen. Das Ergebnis für die Charakterisierung der Protein-G-ssDNA-Biokonjugation zeigte ein Verhältnis von fast eins zu eins von Protein G zu ssDNA, wobei das Protein G Maleimid ssDNA und Imidazol-Elutionspufferspektren aus der orthogonalen Basis für die Anpassung an das Produktspektrum der Biokonjugation vorliegen.
Native PAGE wurde verwendet, um die Biokonjugation zu bestätigen, die die hellgrünen Bänder zeigt, die mit dem monomeren Protein G-Band zusammenfallen, was auf eine erfolgreiche Konjugation und einen guten Ertrag hinweist. Das TIRF-Beleuchtungsprofil, das von einer Singlemode-Faser eingeführt wird, ist im Allgemeinen in der Mitte des Sichtfeldes heller und an den Rändern dunkler. Um die ungleichmäßige Ausleuchtung auszugleichen und die Bilder für die quantitative Analyse abzuflachen, wurde das Beleuchtungsprofil durch Mittelung tausender Einzelbilder ermittelt.
Abgeflachte Bilder wurden erzeugt, indem das Kamerarauschen sowohl von Roh- als auch von Beleuchtungsprofilen subtrahiert und dann durch das Beleuchtungsprofil normalisiert wurde. Raw Stitching zeigte klare periodische Muster, die den unkorrigierten Bildern entsprachen, während das gleiche Sichtfeld, das aus abgeflachten Bildern zusammengefügt wurde, einen flachen Hintergrund erzeugte. Ein Ramp-up-Strömungsprofil wurde verwendet, um den Bereich der Scherspannung zu bestimmen, was zu Zellwalz- und Fluoreszenzspuren führte, unter denen ein typischer Einzelzell-Adhäsions-Footprint zu sehen war.
Suboptimale und optimale Ergebnisse von fluoreszierenden Spuren mit unzureichendem Kontrast, übermäßiger Spurdichte, optimaler Spurdichte und Kontrast sowie Beugungsbegrenzter und DNA-PAINT-Bildgebung werden gezeigt. Eine Inkubationszeit von mehr als 60 Minuten gewährleistet eine Oberflächenfunktionalisierung und eine ordnungsgemäße Kammerkonstruktion verhindert den Durchgang von Blasen, die die funktionalisierte Oberfläche beschädigen. Dieses Verfahren eignet sich für die quantitative Analyse der molekularen Kraft, die an der Walzadhäsion beteiligt ist, und ermöglicht es den Forschern, das Walzverhalten der verschiedenen Zelltypen zu verstehen.
Diese Technik ermöglicht es den Forschern, neue Fragen zu schnellen Adhäsionsereignissen zu untersuchen, die zu einer weiteren Weiterentwicklung der Einzelmolekül- und Mechanobiologieforschung führen.
