Wir bedanken uns bei Mitgliedern unseres Teams, vor allem MC Blache für technische Unterstützung, sowie M-und B-Irla Imhof, für ihre Unterstützung und fruchtbare Diskussionen. Zahlen für Deflation und Entbindung reproduziert mit freundlicher Genehmigung von Nature Methods. Dieses Projekt wird von institutionellen Zuschüssen aus dem CNRS, INSERM und Marseille-Universität, und durch gezielte Zuschüsse aus der Region Provence-Alpes-Côte d&#39;Azur, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche (ANR unterstützt-08-PCVI- 0034-02, ANR 2010 BLAN 1214 01) und der Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR wird durch ein Stipendium der Ligue Nationale Contre le Cancer unterstützt.

In diesem Video stellen wir eine vollständige Single Particle Tracking Experiment, mit Hilfe von Quanten-Dots gezielt an eine bestimmte Membran-Rezeptor. Das Hauptziel dieser Versuch besteht darin, diskriminierende verschiedene molekulare Diffusion Verhalten in der Plasmamembran von lebenden Zellen gemessen. Tatsächlich können molekulare Bewegungen, die durch an der Membran typischerweise Brownsche Diffusion abweichen, die linear gerichteten oder geschlossenen in Nanodomänen 26-29, zum Beispiel. Wir zielen darauf ab, gleichzeitig nach so vielen Rezeptoren wie technisch möglich, um einen Schnappschuss von der Vielfalt, die sich in der Dynamik, die innerhalb der Membran einer lebenden Zelle liefern. Dies wird letztlich zu erwarten, damit Entschlüsselung der Mechanismen, die Zelloberflächen-Rezeptor-Signalisierung. 1. Cell Culture <ol><li> Bereiten Sie die zelluläre Probe: verwenden adhärenten COS-7-Zellen, die endogen exprimieren den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) 30. WannArbeit mit lebenden Zellen ohne Antibiotika sicher kein latentes Sub-nachweisbare Verunreinigungen durch Verwendung geeigneter steriler Techniken zu jeder Zeit während der Vorbereitung haben zu machen. </li><li> Kultivieren von Zellen in vollständigem Medium (DMEM mit 10% Kälberserum, 1% Glutamin, 1% HEPES und 1% Natriumpyruvat, siehe Tabelle Reagenzien unten), bei 37 ° C mit 7% CO 2, wobei dafür, dass sie haben subkonfluenten, exponentielles Wachstum bevor sie sich ihnen in Lab-Tek. </li><li> Am Tag vor dem Versuch, zu verbreiten 5.000 Zellen / Well in 8-well Kammern (Lab-Tek) und über Nacht. Zählen von Zellen sorgt für eine konstante Zelldichte, damit eine reproduzierbare Verhältnis von Quanten-Punkten pro Zelle. </li></ol> 2. Zellmarkierung Bereiten Quanten-Punkte mit einer speziellen Beschichtung. Quantum-Dots sind fluoreszierende Nanopartikel von Halbleitern. Diese Nanopartikel stellen eine hohe Interesse, da sie sehr hell und photostabil sind im Vergleich zu klassischenFluoreszenzsonden 31,32, die Erreichung eines entsprechenden Signals erlaubt es, Rauschabstand (SNR) für Single Molecule Imaging. <ol><li> Vor dem Experiment, Fab-Fragmente zu erzeugen gegen EGFR aus Hybridom-Zelllinie (mAb 108, ATCC HB-9764), durch Verdau mit Papain, wie zuvor 21 beschrieben. </li><li> Konjugat Fab mit Biotin, als den Anweisungen des Herstellers (EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylierungskit; Thermo Scientific, 1A.). </li><li> Verwendung Quanten-Punkte mit Streptavidin (Invitrogen) und Emission bei 605 nm (optimale Emissionswellenlänge für Glanz, Detektion und Abtrennung von zellulären Autofluoreszenz) funktionalisiert. </li><li> Bereiten Sie die Lösung zur Kennzeichnung in vollständigem Medium (siehe Tabelle der Reagenzien), um die vorliegenden Streptavidine um die Quanten-Punkte sowie eine Aggregation und nicht-spezifische Bindung an die Zellen und auf das Deckglas zu verhindern sättigen. </li><li> Bereiten Sie zwei Zwischen-Lösungen:ein mit Quantum-Dots-Streptavidin und ein weiteres mit biotinylierten Fab, jeweils bei 20 nM. </li><li> Mischen Sie das gleiche Volumen dieser beiden Lösungen: Mischen Sie die Quantum-Dots mit Fab im Verhältnis 1:1 in eine finale Arbeitsdatei Konzentration von 10 nM Fab erhalten: Quanten-Punkte-Komplex. Verwendung einer äquimolaren Verhältnis begünstigt die Bildung von Mono-funktionalisierten Komplexen eines Quantenpunkt-und einem biotinylierten Fab-Fragment besteht. Dies begünstigt monovalenten Kennzeichnung, die Begrenzung Artefakt Beobachtungen durch Rezeptor-Vernetzung 33,34. </li><li> Inkubieren für 15 Minuten bei 25 ° C unter Verwendung eines Schüttler bei 1.200 Umdrehungen pro Minute eine Aggregation zu verhindern. Die Mischung ist dann bereit, auf lebende Zellen zu verwenden. </li><li> Inkubieren Zellen in 100 ul-Mix für 5 Minuten bei 37 ° C mit 7% CO 2. </li><li> Waschen der Zellen mit nicht-Autofluoreszenzlichtbild Bilderzeugungsmedium (HBSS-Puffer, 1% HEPES, siehe Tabelle der Reagenzien) bei 37 vorgewärmt ° C </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das überschüssige von Etiketten zu verhindern UN-notwendig verderben das SNR um ungebundene, unscharf Quanten-Punkte, indem sie ausführlich Waschen jeder Vertiefung mit Bilderzeugungsmedium, typischerweise 5 mal bei Raumtemperatur mit mindestens 5 Minuten Verzögerung vor dem letzten Waschen. </li></ol> 3. Optischer Aufbau Die Video-Mikroskopie-Setup besteht aus vier Hauptteilen: <ol><li> Mithilfe eines inversen Mikroskops mit einem spezifischen Fluoreszenz-Würfel (FF01-457/50 Anregung, FF495-DI02 dichroitische und FF01-617/73 Emissionsfilter, Semrock) und einer hohen numerischen Apertur (1,3 oder 1,49) Öl-Immersions-100x Objektiv. </li><li> Ein 100-W-Quecksilberlampe (die mit dem Mikroskop durch eine optische Faser, die Vermeidung stören Thermoregulation). </li><li> Ein 512 x 512 Pixel hohe Empfindlichkeit EMCCD-Kamera, einen ausreichenden SNR zu erreichen. </li><li> Ein Inkubator für biologische Proben bei 37 ° C zu halten während des Experiments. </li></ol> 4. Erwerb <ol><li> Wählen Sie isolierten und gut Ausbreitung Zellen. Diesbegünstigt die Verlängerung der schönen, flachen Lamellipodien, am besten geeignet, für planare Bewegung der Membran Moleküle aussehen. </li><li> Bewerten Sie die zellulären physiologischen Status durch sein Aussehen sowohl im Durchlicht und Fluoreszenz-in: intensiv vesikulären Verkehr, das Fehlen von nekrotischen oder apoptotischen Zeichen, geringe Autofluoreszenz und mittlere-starke Quantenpunkt-Kennzeichnung (in der Regel bis zu 1.000 Quanten-Punkten pro Zelle, siehe Abb.. 1B, C). </li><li> Wählen Sie einen hohen Dichte Kennzeichnung, die entscheidend zur simultanen Überwachung so viele Rezeptoren wie möglich ist. Dies ist tatsächlich sowohl durch physiologische (Oberflächenexpression, Epitop Zugänglichkeit, seitliche Bewegung) und algorithmischen Parameter (nicht-überlappenden Point-Spread-Funktionen (PSF), auch unter Berücksichtigung der Unschärfen durch Bewegung, um die ordnungsgemäße Erfassung und Wiederverbindung zu erlauben). Begrenzt </li><li> Für jede Zelle wird zunächst einen Hellfeld-Feld-Bild (vorzugsweise unter Verwendung von DIC, wenn verfügbar), die weitere Überprüfung zulassen kann für die Zelle Aspektund räumlichen Grenzen des Lamellipodien. </li><li> Speichern Sie das Bild mit dem gleichen Namen wie die Video-Stapel (wie cell1.tif &amp; cell1.stk zum Beispiel), in einen Unterordner namens DIC, da mit diesen Konventionen, kann der Algorithmus automatisch zurück finden das passende Bild für jeder Stapel. </li><li> Erwerben Sie 1 bis 3 Videos pro Zelle, kontinuierlich, typischerweise bei 36-ms-Rate, die schnellste Geschwindigkeit, die in Full-Frame mit dieser Kamera. Allerdings kann man bei höheren Frequenzen zu erwerben, bis zu 1-ms-Rate, mit dedizierten CCD-Sensor mit erhöhter Empfindlichkeit und / oder weniger Pixel. Die Frame-Transfer-Technologie bietet vernachlässigbare Verzögerung zwischen Frames. </li><li> Electron mehrfach Erweiterung sollte immer bei maximaler (knapp unterhalb der Sättigung, wenn relevant) gesetzt werden, damit erreicht einzelnes Molekül Empfindlichkeit, mit einem ausreichenden SNR, zumindest oberhalb von 20 dB (Peak-Erkennung für eine effiziente 1), in der Regel etwa 25-30 dB. </li><li> In der Regel erwirbt 300 Bilder pro Video, sinCE-Bahnen werden über ~ 100 Frames im Schnitt, meist durch lange blinken Ereignisse beschränkt rekonstruiert. Video Häufigkeit und Länge kann für eine bestimmte Maßnahme, die mehr Spuren zum Beispiel verlangen, angepasst werden konnten. </li></ol> 5. MTT-Analyse <ol><li> Wählen Sie den Pfad zu dem Verzeichnis, das die Video-Dateien, um eine bestimmte Datenmenge mit Matlab oder Octave zu bewerten. </li><li> Um die vollautomatische Analyse 1,35 zu starten, geben Sie den Befehl detect_reconnex23 in Octave, oder MTT23i in Matlab. Dieses Programm steht für &quot;Version 2.3, mit User-Interface&quot; und steht zum Download bereit, zusammen mit der Vorgängerversion 2.2. Es zeigt zuerst ein grafisches Interface, in dem alle Parameter verwendet, wie in Abb. 2. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse MTT automatisch analysiert jedes Video-Recorder, um Spuren von erkannt und geschätzt, Ziele, durch weitere ergänzt liefern inchungen, wie Einschluss Detektion. Dies ermöglicht letztendlich Mapping Spuren über Zell-Bilder (Abb. 1C und 3). MTT-Beschreibung Der Kern MTT Analyse wird über jeden Rahmen durchgeführt unter Berufung auf drei Hauptaufgaben (Abb. 3): <ol><li> Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Ziels (Quantenpunkt-), innerhalb eines gleitenden Teilbereich nacheinander um jedes Pixel zentriert ist, wobei zwei Hypothesen verglichen: Gegenwart entweder eines Signals, mit dem PSF als zweidimensionale Gauß-Peak modellierte , oder nur Lärm, unter Verwendung eines Schwellenwertes versichern niedrig genug Fehlalarm, mit weniger als einem unechten Erkennung pro Frame. Dies führt zu einer Karte Detektionswahrscheinlichkeit. Jede lokale Maximum ergibt, als mögliches Zielgen erlaubt, sichergestellt wird, dass die Wahrscheinlichkeit höher als ein Mindestwert, richtet sich nach der gewünschten Wahrscheinlichkeit eines falschen Alarms (PFA) ist. Diese Grenze ist tief genug, um effizient zu diskriminieren SIGSignale vom Rauschen und vermeidet bestenfalls falsche Erkennungen (PFA von 10 -6 standardmäßig auf weniger als ein Fehler in 512 x 512 Pixel Bilder zu versichern), während immer noch eine ausreichend hohe Wahrscheinlichkeit der Aufdeckung und erreichte damit den theoretisch vorhergesagten optimalen ein. Beachten Sie, dass das Erfordernis der Verwendung eines Teilbereich bedeutet, dass die Bildränder (3 Pixel, für eine Standard-Fenster von 7 x 7 Punkte) nicht ausgewertet werden kann. </li><li> Schätzung für jedes detektierte Ziel, der relevanten Parameter, wie Subpixel-Position und der Signalintensität. Für jedes detektierte Ziel wird eine Methode der kleinsten Quadrate Gauß-Newton-Sitz nächsten durchgeführt, um die Position, Breite und Höhe des detektierten Gauß zu schätzen. Dies stellt insbesondere die Subpixel-Position des Farbstoffs (10 bis 20 nm Genauigkeit für typische SNR-Werte und unbeweglich und langsam diffundierende Farbstoffe, jedoch bis zu ~ 100 nm für Farbstoffe Diffundieren bei 0,1 um 2 / s). </li><li> Reconnection der neuen Ziele mit derSpuren bereits in den vorangegangenen Frames aufgebaut. Die Reihe neuer Ziele mit dem Satz von vorhergehenden Spuren abgestimmt. Zu diesem Zweck, um jedes Ziel eine Spur zuzuordnen, wenn möglich, alle erhältlich statistischer Information zur Detektion Schritt verwendet wird, nicht nur die Position, sondern auch die Intensität, Breite, zu blinken, und die zugehörigen Statistiken. Daher werden Ziele nicht nur auf die nächste Spur zugewiesen: im Falle von kreuzenden Spuren, Intensität, Geschwindigkeit, Breite und blinkende werden berücksichtigt. Dies liefert die statistisch optimale Wiederanschluss des Gastes. Diese Strategie vermeidet, wenn möglich, das Vorspannen des Wiederverbindung zu den nächsten Nachbarn. </li></ol> Detektierten Peaks können im Nachhinein abgelehnt werden, wenn ihrer Einschätzung oder Wiederverbindung scheitert sein. Eine besondere Prüfung übernimmt die Erkennung von neuen Spitzen, die neue Spuren zu initiieren würde. Dieser Test verwendet eine strengere PFA (10 -7), da Sie wieder eine Spitze, um eine Spur können de facto als Bestätigung interpretiert werden o<html> f seine Relevanz (dieses Kriterium als per Definition nicht anwendbar für neue Peaks). Trajektorienanalyse Mögliche vorübergehende Entbindung nächsten durch eine Funktion umgekehrt proportional zur lokalen Verbreitung 24-29 im Zusammenhang ausgewertet. Die Anwendung ermöglicht einen Schwellenwert zu definieren, beschränkt oder nicht Episoden. Durch diese Iteration über alle Spuren, können wir abbilden Membran Dynamik im Hinblick auf die vorübergehende Haft / verlangsamen Veranstaltungen. Dies kann alternativ dargestellt werden entweder mit dem Binär-oder diskrete Werte dieser Beschränkung Index. Standardmäßig MTT diese Aufgaben automatisch und spart 8 Peakparameter in einer Textdatei: Frame-Nummer, Offset-i und j Position, Signalstärke, den Radius und blinken, für jeden Video-Frame (Gruppe von 7 Zeilen) und Spurenelemente (Spalte) . Diese Ausgabeparameter kann in Matlab oder Octave mit dem fread_data_spt Skript für die weitere Analyse dh Spuren oder Signalintensitäten geladen werden, wie in der beispielhaft<html> &quot;Http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt&quot;&gt; MTT_example Skript im Anhang. Weitere Analysen führen zu Spuren in jeder Zelle zugeordnet werden (Abb. 1C und 3) und Histogramm-Verteilung für die relevanten Parameter (wie zB Peak-Intensitäten, SNR oder lokale Diffusion Werte) zu schaffen. Für jede Datei, Mittelwert und Standardabweichung der einzelnen Parameter werden in einer Textdatei gespeichert, zusammen mit einem Bild der Histogramme. Logarithmisch-Distributionen, wie zum Quadrat Verschiebungen R 2, auf geometrische Mittel führen. Der Diffusionskoeffizient D wird aus einer linearen Anpassung in den fünf ersten Punkte der MSD-Kurve berechnet. Diese Werte geben einen Überblick über ein Experiment mit zum Beispiel Kinetik der zellulären Reaktionen oder pharmazeutische / enzymatische Behandlungen beeinflussen Membran Organisation. Da MTT ist ein Open-Source-Code, kann dieser Aspekt ohne weiteres auf jeden engagierten Untersuchung angepasst werden. 599fig1.jpg &quot;alt =&quot; Bild 1 &quot;/&gt; Abbildung 1. Überwachung Membranrezeptoren Dynamik MTT. (A) Membrankomponenten, wie EGFR, sind markiert mit Quanten-Punkten gekoppelt ist, um biotinylierte Fab-Fragmente (schematische Zeichnung mit annähernd richtig Skalierung jedem Molekül). (B) Typische fluoreszierende Bild von einer Live-COS-7 Zelle erworben, mit 36-ms Belichtungszeit, Darstellung beugungsbegrenzten Peaks, die individuell beschriftet Rezeptor. (C) Ausgang des MTT-Analyse zeigt die rekonstituierte Bahnen der Rezeptoren auf der Hellfeldbild der Zelle überlagert. <img src="/files/ftp_upload/3599/3599fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. MTT Eingabeparameter. Laufen MTT23i öffnet eine grafische Benutzeroberfläche listet alle Input-Parameter, Namen und Standardwerte, wie in unseren früheren Publikation 1 beschrieben. In den Algorithmus, Raum und Zeit Parameter (Suchfenster, Spitzenradius, maximale Verbreitung<html> und blinkend) sind in dimensionslosen Standard-Einheiten, Pixel und Rahmen. Kalibrierungen können im Nachhinein zu Ausgabeergebnisse umwandeln angewendet werden. Default-Werte, entsprechend einer Cascade 512BFT mit 100-facher Vergrößerung, sind Pixel-Größe: 156 nm / pxl und Frame-Verzögerung: 36 ms / Frame. Die Ermittler sollten die Optimierung ein paar kritische Parameter, wie zB der maximal zu erwartenden Diffusionskoeffizienten (&quot;Diff max&quot;) und einem maximalen blinkt Verschwinden (&quot;T off&quot;). Diese beiden Raum und Zeit Limits sind fast die einzigen, die zu überdenken für einen bestimmten experimentellen Bedingungen, die anderen nach robusten Standardwerte werden gesetzt werden müssen. Zum Beispiel wird die Anzahl von Fehlalarmen direkt auf weniger als einem Fehler pro Millionen Pixel, so dass weniger als einmal pro Frame, was zufriedenstellend in den meisten Fällen zu gewährleisten. Alle Parameter werden in einer Textdatei in der Ausgabe-Ordner gespeichert, so dass Anwender im Nachhinein zu überprüfen, welche Einstellungen wurden für die Analyse verwendet. s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg &quot;alt =&quot; Bild 3 &quot;/&gt; Abbildung 3. Wichtige Schritte des MTT-Analyse. Ausgehend von einem Stapel von experimentellen Fluoreszenzbilder werden Peaks nacheinander und automatisch erkannt, geschätzt durch eine Gauß-Sitz und wieder über Rahmen (erste Reihe von Operationen, oberen Teil des Flussdiagramms). Die Spuren können weiter nach möglichen Einschluss untersucht werden, zum Beispiel, was letztlich zu einer dynamischen Karte von relevanten Deskriptoren (zweite Reihe von Operationen, unterer Teil). <img src="/files/ftp_upload/3599/3599fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Labeling Wertigkeit hat keinen Einfluss auf MTT. Um die mögliche Voreingenommenheit durch artifizielle multivalenten Kennzeichnung eingeführt zu bewerten, wurde MTT-Analyse durchgeführt, um endogenen EGFR getaggt mit 2 verschiedenen Systemen, zur Generierung und Analyse von Trajektorien Karten zu verfolgen. (A)-Rezeptoren wurden mit biotinylierten Fab und Quanten-dots605-Streptavidin markiert, wie im Protokoll beschrieben.In diesem Fall kann die Multi-Quanten-Wertigkeit von Punkten und Streptavidine in Kopplung mehrerer Rezeptoren an einen einzigen Farbstoff führen. (B)-Rezeptoren wurden mit Fab direkt mit einem organischen Farbstoff, ATTO647N gekoppelt ist markiert. In diesem Fall kann man Fab, damit ein Rezeptor, um mehr als einen Farbstoff gekoppelt sein. (C) mittleren quadratischen Verlagerung (MSD)-Kurve für alle Spuren für jede Zelle berechnet wurde, entweder mit Quantenpunkt-Farbstoffe oder Atto (links und rechts Graphs, jeweils) markiert. Diffusionskoeffizienten wurden durch lineare Anpassung in den fünf ersten Punkte der MSD (rote gepunktete Linie) berechnet. Jedes Schema der Kennzeichnung führten zu ähnlichen Werten Diffusion (Zentral Grafik). Qdot: Quanten-dots605 (n = 5 Zellen), Atto: ATTO647N (n = 7 Zellen), ns: nicht signifikant (Student t-Test p-Wert&gt; 0,05).

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J. 69, 989-993 (1995).</li><li>Jacobson, K., Dietrich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+lipid+rafts.">Looking at lipid rafts.</a> Trends Cell Biol. 9, 87-91 (1999).</li><li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+(nanovid+microscopy).+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells.">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).</li><li>Livneh, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+deletions+in+the+cytoplasmic+kinase+domain+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+do+not+affect+its+laternal+mobility.">Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility.</a> J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).</li><li>Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot+bioconjugates+for+imaging,+labelling+and.">Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and.</a> 4, 435-446 (2005).</li><li>Wu, X., Bruchez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+cellular+targets+with+semiconductor+quantum+dot+conjugates.">Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates.</a> Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).</li><li>Mohammadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation-induced+activation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+protein+tyrosine+kinase.">Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase.</a> Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).</li><li>Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent,+reduced-size+quantum+dots+for+imaging+receptors+on+living+cells.">Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells.</a> Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).</li><li>Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Serg&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-target+tracing+(MTT)+algorithm+probes+molecular+dynamics+at+cell+surface.">Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface.</a> Protocol Exchange. , (1038).</li><li>Groc, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+trafficking+of+neurotransmitter+receptor:+comparison+between+single-molecule/quantum+dot+strategies.">Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).</li><li>Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+at+a+time,+live+tracking+of+NGF+axonal+transport+using+quantum+dots.">One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).</li><li>He, H. T., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+nanodomains+in+living+cell+membrane+by+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).</li><li>Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+complexes+and+clusters:+functional+advantages+and+methodological+hurdles.">Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles.</a> J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).</li><li>Kao, H. P., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+single+fluorescent+particles+in+three+dimensions:+use+of+cylindrical+optics+to+encode+particle+position.">Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position.</a> Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

In Einzelpartikel-Tracking, neben den Zellen und Mikroskopie Aspekte stellt die Analyse einen wesentlichen Teil der Arbeit. Diese befasst sich mit der Algorithmus verwendet, um die drei wichtigsten Aufgaben: Erkennen, Abschätzen und wieder Gipfeln über jeden Frame. Aber die konsequente Aspekt dieser Arbeit besteht in der Erarbeitung des Algorithmus selbst, die müssen für jede neue dedizierte Untersuchung, im Wesentlichen für den letzten, zusätzliche Schritte (wie Entschlüsselung Arten der Bewegung, Interaktionen ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Menge </td></tr><tr><td> Cos-7-Zelllinie </td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td><td> 5000 Zellen / Well </td></tr><tr><td> HBSS ohne Ca 2 + </td><td> GIBCO </td><td> 14175 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 0,05% Trypsin-EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 8-Well Lab-Tek </td><td> NUNC </td><td> 155441 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> QDot-605 Streptavidin </td><td> Invitrogen </td><td> Q10101MP </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td colspan="4"> Biotinylierten Fab (Fab für Synthese, siehe Referenz 21) </td></tr><tr><td> Fab aus mAb 108 </td><td> ATCC </td><td> HB-9764 </td><td> 200 ug </td></tr><tr><td> NHS-Biotin<html></td><td> Thermo Scientific </td><td> 21435 </td><td> 18,5 pg </td></tr><tr><td colspan="4"> Komplett Medium </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 41965 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Fötalem Rinderserum </td><td> SIGMA </td><td> F7524 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> GIBCO </td><td> 25030 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Natriumpyruvat </td><td> GIBCO </td><td> 11360 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Bilderzeugungsmedium </td></tr><tr><td> HBSS mit Ca 2 + </td><td> GIBCO </td><td> 14025 </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td> 250 ul </td></tr></tbody></table>1 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Referenz </td></tr><tr><td> Inverses Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> Eclipse-TE2000U </td></tr><tr><td> Leuchtstofflampe </td><td> Nikon </td><td> Intensilight C-HGFIE </td></tr><tr><td> 1,3 NA 100x Objektiv </td><td> Nikon </td><td> Plan Fluor 1,30 </td></tr><tr><td> 1,49 NA 100x Objektiv </td><td> Nikon </td><td> APO TIRF 1,49 </td></tr><tr><td> Kamera </td><td> Roper Scientific </td><td> Cascade 512 B </td></tr><tr><td> Thermostatisiert Box </td><td> Life Imaging Dienstleistungen </td><td> The Box </td></tr></tbody></table> Anhang: Auszug aus einem Skript von MTT ergänzende Analyse Funktion MTT_example (Dateiname) %%% Basic-Beispiele, die zeigen, wie man MTT Ausgabeergebnisse erholen %%% Zu plotten jede trace und um das Histogramm zu bauen %%% Der Fluoreszenzintensitäten wenn nargin &lt;1% kein file_name zur Verfügung gestellt? Dateien = dir (&#39;* stk.&#39;); wenn IsEmpty (Dateien), disp (&#39;keine Daten im aktuellen Verzeichnis&#39;), Rückkehr, Ende . file_name = Dateien (1) Name;% default: stk erste Datei disp ([&#39;mit&#39; datei &#39;standardmäßig&#39;]) Ende file_param = [Dateiname &#39;_tab_param.dat&#39;];% Ausgabe-Datei %% Laden von Daten cd (&quot;output23 &#39;)% oder (&#39; output22 &#39;), je nach Ausführung verwendet % Haftungsausschluss: Version 2.2 erzeugt nur 7 Parameter, % Ein zusätzlicher Parameter, Lärm, wurde in Version 2.3 hinzugefügt % Um alle Parameter auf einmal zu lesen, in einer einzigen Tabelle % = Tab_param fread_all_param (file_param); % Tab_i = tab_param (2:8: end, :); tab_j = ... % Um alle Parameter (außer frame_number) in separaten Tabellen lesen % [Tab_i, tab_j, tab_alpha, tab_radius, tab_offset, tab_blk, tab_noise] = fread_all_data_spt (file_param); tab_i = fread_data_spt (file_param, 3);% Index ist 3, weil Trace-Nummer und Rahmennummer, nicht informativ, verworfen werden! tab_j = fread_data_spt (file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt (file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt (file_param, 8); %% Schleife über Spuren N_traces = size (tab_i, 1); % Tabellen sind N_traces Linien durch Spalten N_frames für ITRC = 1: N_traces No_blk_index = tab_blk (ITRC, :)&gt; 0;% nicht blinken Schritte nur Grundstück (tab_i (ITRC, No_blk_index), tab_j (ITRC, No_blk_index)) &amp; Nbsp; xlabel (&#39;i (Pixel)&#39;), ylabel (&#39;J (Pixel)&#39;) title ([&#39;trace #&#39; num2str (ITRC)]) disp (&#39;Bitte treffen Sie eine beliebige Taste für die nächste Spur &quot;), Pause Ende %% Fluo Histogramm N_datapoints = SUMME (tab_blk (:)&gt; 0);% nicht blinken Schritte nur hist (tab_alpha (tab_blk&gt; 0), 2 * sqrt (N_datapoints))% mit 2sqrt (N) Bins xlabel (&#39;Intensität (au)&#39;), ylabel (&quot;Ereignis&quot;) title (&#39;Histogramm der Partikel Fluoreszenzintensität&#39;)

mapping molecular diffusion in the plasma membrane by multiple-target tracing (mtt)

Unser Ziel ist eine umfassende Beschreibung der molekularen Vorgänge bei zellulären Membranen in verschiedenen biologischen Funktionen zu erhalten. Unser Ziel ist die Charakterisierung der komplexen Organisation und Dynamik der Plasmamembran auf Einzel-Molekül-Ebene, durch die Entwicklung von Analysewerkzeugen gewidmet Single-Particle Tracking (SPT) in hoher Dichte: Multiple-Target Tracing (MTT) 1. Einzel-Molekül-Videomikroskopie und bietet Millisekunde und Auflösung im Nanometerbereich 1-11, erlaubt eine detaillierte Darstellung der Membran Organisation von 12-14 genau Mapping-Deskriptoren wie Zell-Rezeptoren-Lokalisierung, Mobilität, Gefangenschaft oder Wechselwirkungen. Wir revisited SPT, sowohl experimentell als auch algorithmisch. Experimentelle Aspekte waren die Optimierung Setup-und Zell-Kennzeichnung, mit besonderem Schwerpunkt auf dem Erreichen der höchstmöglichen Dichte Kennzeichnung, um eine dynamische Momentaufnahme der Molekulardynamik einen gebens tritt es innerhalb der Membran. Algorithmische Fragen betroffenen einzelnen Schritte für den Wiederaufbau von Flugbahnen verwendet: Spitzen-Erkennung, Einschätzung und der Wiederanschluss von speziellen Werkzeugen aus Bildanalyse 15,16 gerichtet. Implementieren von Deflation nach Entdeckung ermöglicht Rettung Gipfel zunächst von benachbarten, stärkeren Peaks versteckt. Zu beachten ist, wirkt sich direkt auf die Verbesserung der Erkennung Wiederverbindung, durch Reduzierung der Lücken innerhalb Flugbahnen. Vorstellungen wurden ausgewertet mit Hilfe von Monte-Carlo-Simulationen für unterschiedliche Kennzeichnung Dichte und Noise-Werte, die in der Regel stellen die beiden wesentlichen Einschränkungen für parallele Messungen bei hoher örtlicher und zeitlicher Auflösung. Die Nanometergenauigkeit 17 für einzelne Moleküle erhalten, unter Verwendung von entweder aufeinanderfolgenden Ein / Aus Photoschalten oder der nichtlinearen Optik, liefern kann, flächendeckende Betrachtungen. Dies ist die Grundlage von Nanoskopiemethoden 17 wie Sturm 18, PALM 19,20, 21 oder RESOLFT STED 22,23, which erfordert häufig den Imaging-fixierten Proben. Die zentrale Aufgabe ist die Erkennung und Einschätzung der beugungsbegrenzten Spitzen ausgehend von Single-Moleküle. Daher angemessene Annahmen wie z. B. Umgang mit einer konstanten Positionsgenauigkeit anstelle der Brownschen Bewegung, wird MTT unkompliziert für nanoskopische Analysen geeignet. Ferner kann MTT grundsätzlich in jedem Maßstab verwendet werden: nicht nur für Moleküle, sondern auch für Zellen oder Tiere, zum Beispiel. Daher ist ein leistungsfähiges MTT-Tracking-Algorithmus, der Anwendungen findet auf molekularer und zellulärer Skalen.

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Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target-Tracing ist ein Algorithmus für die Verfolgung von hausgemachten individuell markierten Moleküle in der Plasmamembran von lebenden Zellen entwickelt. Effiziente Erfassung, Abschätzung und Tracing-Moleküle im Laufe der Zeit bei hoher Dichte bieten eine benutzerfreundliche, umfassende Werkzeug, um nanoskalige Membran Dynamik zu untersuchen.

Mapping molekulare Diffusion in der Plasmamembran durch Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

mapping-molecular-diffusion-plasma-membrane-multiple-target-tracing

Research

JoVE Journal

Biology

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

17.1K Aufrufe.  Parc scientifique de Luminy. Multiple-Target-Tracing ist ein Algorithmus für die Verfolgung von hausgemachten individuell markierten Moleküle in der Plasmamembran von lebenden Zellen entwickelt. Effiziente Erfassung, Abschätzung und Tracing-Moleküle im Laufe der Zeit bei hoher Dichte bieten eine benutzerfreundliche, umfassende Werkzeug, um nanoskalige Membran Dynamik zu untersuchen.

Serie: Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Messen in der Nähe Plasmamembran und Global intrazellulären Calcium-Dynamics in Astrozyten

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Forschung

Biologie

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Quantitative Messung der GLUT4 Translokation an die Plasmamembran mittels Durchflusszytometrie

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Die Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

Real-time Analyse von Retinol Transport durch die Membran-Rezeptor von Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new insights to plasma membrane protein function and regulation. Recently, k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS)1&#160;was developed to enable routine measurements of diffusion coefficients directly from images of fluorescently tagged plasma membrane proteins, that avoided systematic biases introduced by probe photophysics. Although the theoretical basis for the analysis is complex, the method can be implemented by nonexperts using a freely available code to measure diffusion coefficients of proteins. kICS calculates a time correlation function from a fluorescence microscopy image stack after Fourier transformation of each image to reciprocal (k-) space. Subsequently, circular averaging, natural logarithm transform and linear fits to the correlation function yields the diffusion coefficient. This paper provides a step-by-step guide to the image analysis and measurement of diffusion coefficients via kICS.
First, a high frame rate image sequence of a fluorescently labeled plasma membrane protein is acquired using a fluorescence microscope. Then, a region of interest (ROI) avoiding intracellular organelles, moving vesicles or protruding membrane regions is selected. The ROI stack is imported into a freely available code and several defined parameters (see Method section) are set for kICS analysis. The program then generates a &#34;slope of slopes&#34; plot from the k-space time correlation functions, and the diffusion coefficient is calculated from the slope of the plot. Below is a step-by-step kICS procedure to measure the diffusion coefficient of a membrane protein using the renal water channel aquaporin-3 tagged with EGFP as a canonical example.

This paper provides a step by step guide to the fluctuation analysis technique k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) for measuring diffusion coefficients of fluorescently labeled plasma membrane proteins in live mammalian cells.

Einfache Messung des Diffusionskoeffizienten von EGFP-markierten Plasmamembranproteine ​​Mit k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imaging Plasmamembran Verformungen Mit pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

Bestimmung der Plasmamembran Partitionierung für peripher-assoziierte Proteine

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and activates the mixed lineage kinase-like domain pseudokinase, MLKL, to rupture or permeabilize the plasma membrane. Necroptosis is an inflammatory pathway associated with multiple pathologies including autoimmunity, infectious and cardiovascular diseases, stroke, neurodegeneration, and cancer. Here, we describe protocols that can be used to characterize MLKL as the executioner of plasma membrane rupture in necroptosis. We visualize the process of necroptosis in cells using live-cell imaging with conventional and confocal fluorescence&#160;microscopy, and in fixed cells using electron microscopy, which together revealed the redistribution of MLKL from the cytosol to the plasma membrane prior to induction of large holes in the plasma membrane. We present in vitro nuclear magnetic resonance (NMR) analysis using lipids to identify putative modulators of MLKL-mediated necroptosis. Based on this method, we identified quantitative lipid-binding preferences and phosphatidyl-inositol phosphates (PIPs) as critical binders of MLKL that are required for plasma membrane targeting and permeabilization in necroptosis.

We report methods for characterization of MLKL-mediated plasma membrane rupture in necroptosis including conventional and confocal live-cell microscopy imaging, scanning electron microscopy, and NMR-based lipid binding.