Diese Arbeit wurde von einem Lundbeck Junior Group Leader-Stipendium für LNN unterstützt. PWW erkennt Zuschussfinanzierung Unterstützung von den Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC). Wir danken auch den dänischen Molekulare Bildgebung in der Biophotonik Center an der University of Southern Denmark für den Zugriff auf Spinning-Disk-Mikroskopie.

Erwerb von EGFP-markierte Proteine ​​in der Plasmamembran für die KIC-Analyse kann auf einem Epifluoreszenzmikroskop, einem TIRF-Setup oder auf einem Spinning-Disk-Mikroskop eingestellt, um Bilder der Membran von Interesse erwerben geführt werden. Das Kamerapixelgröße sowie der Zeit zwischen Einzelbildern ist für die Analyse benötigt. Bildsequenzen von 100-1,200 Rahmen mit einer Rahmenrate von 4-30 Hz für die Analyse verwendet werden. Während der Erfassung, ist es wichtig, um die Membran scharf während der gesamten Dauer der Bilderzeugungs halten und sich auf einen Bruchteil der Flachmembran, in der die Fluoreszenz gleichmäßig verteilt. Umzug Vesikel, hervorstehende Membranbereiche und Zellorganellen kann später im Analyseprozess beschnitten werden. Die Erfassungszeit sollte so gewählt werden, dass es keine Drift oder Bewegung der Zelle. KIC-Code Skripte für MATLAB zu erhalten, wenden Paul Wiseman (Paul.Wiseman @ McGill.ca). Das erste Mal die KIC-Code verwendet wird, geöffnet MATLAB und klicken Sie auf Datei, dann set path, klicken Sie dann auf Add mit Unterordnern und finden Sie den Ordner auf dem Computer, in dem die KIC-Code befindet. Dann klicken Sie auf OK, speichern und schließen. Jetzt mit der Analyse von Kulturen in den nächsten Punkten beschrieben fortsetzen. 1. Importieren Sie die Bildsequenz in der Nähe in einem Imaging-Analyse-Programm als TIFF-Stapel Speichern Sie die Datei mit dem Namen: stack1.tif. <ol><li> Wählen Sie eine rechteckige Region of Interest (ROI) auf dem flachen Teil der Membran ohne bewegliche Zellorganellen und hervorstehende Membran Regionen. Die Erntemenge wird so gewählt, dass genügend Statistiken sind für eine gute k 2 Grundstücke erzeugt. </li><li> Schneiden Sie das Region und speichern Sie die Ernte als TIFF-Datei in einem entsprechenden Ordner. Wenn es mehrere Pflanzen aus dem gleichen Film, verwenden Sie eine Reihe Schritt, z. B. &quot;stack1crop.tif&quot;, &quot;stack1crop2.tif&quot;, &quot;stack1crop3.tif&quot;. </li><li> Legen Sie den Ordner lokal mit den Kulturenauf dem Computer, nicht auf einem Server, während Sie KIC-Analyse. </li></ol> 2. Importieren Sie die Feldfrüchte in die Analyse-Software One by One, um die Analyse durchzuführen <ol><li> Offene MATLAB und geben Sie &quot;icsgui&quot; im Befehlsfenster, und drücken Sie ENTER. ICS-GUI ist die ausführbare Namen für das Bild-Korrelationsspektroskopie grafische Benutzerschnittstellenprogramm. </li><li> In der ICS-GUI auf die Registerkarte &quot;KIC&quot;. Ein Screenshot des Analysefensters ist in Fig. 1 gezeigt. </li><li> Suchen Sie den Ordner mit dem Namen des Ordners &quot;MATLAB-Code&quot; und navigieren Sie zu der Datei mit dem Dateinamen &quot;Scripts&quot; und öffnen Sie diese durch Doppelklick. Alternativ der rechten Maustaste auf die Datei und wählen Sie &quot;Öffnen mit MATLAB&quot; oder gehen Sie zu Datei, in MATLAB offen und öffnen Sie das Script-Datei. Diese Datei wird als Editor. </li><li> Im Editor navigieren Sie zu &quot;Load KIC Datensätzen&quot;, dann kopieren oder Typ Dateinamen und Ordner in die Kommandozeile, die beginntmit img = zB &quot;C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif&quot;. In der Kommandozeile unter dem Ordner die Anzahl der Frames analysiert werden - z. B. [1:500]. Verwenden Sie die gleichen Einstellungen für alle Folge-Filme in der Datenreihe. Wenn es Fokusdrift in späteren Bildern, sollten diese von der Analyse ausgeschlossen werden. </li><li> Im Editor klicken Sie auf &quot;Speichern&quot; und dann auf &quot;bewerten Zelle&quot;. Der Datensatz wird nun in in die Analyse-Software geladen. </li><li> In der KIC Analyse-Fenster in der GUI, geben Sie die Einstellungen für die Analyse: <ol><li> Unclick &quot;T cell&quot;-Boxen. </li><li> Geben die Anzahl der Zeitverzögerungen zu analysieren. Die Anzahl der Zeitverzögerungen (τ) wird Einfluss auf die Diffusions Grundstück haben und muss so gewählt werden, dass die Diffusion Handlung ist linear sein. Beginnen Sie mit der Eingabe 25 und dann, wo die Diffusions Handlung ist linear abnehmen. τ ist die Anzahl der Zeitverzögerungen der KIC-Analyse vergleicht und eine Zeitverzögerung ist die Zeit, bwischen einem Rahmen und die nächste. Der kleinste Wert, der eine lineare Handlung gibt gewählt werden. Die maximale Anzahl von Zeitverzögerungen ist so gewählt, daß eine lineare Regression erhalten wird, die Wahl eines höheren Wertes werden die Daten, die nicht Leitung angebracht werden können herzustellen. </li><li> Geben Sie die maximale k 2-Wert (siehe Kreis 1 in Fig. 1), ist es in der Regel 20-50. Eine gute k 2 Grundstück ist ein Plot, in dem es viele Datenpunkte, die entlang einer Linie verteilt sind. Beginnen Sie mit der Eingabe 70 und dann ausgewertet, nachdem die k 2 und Diffusion Grundstücke zu verringern, und wählen Sie den niedrigsten Wert, wo die Datenpunkte gruppieren sich um eine gerade Linie. Der k-2-Wert ist der eckige Größe der k-Raumvektor im Fourierraum. Zunächst sollte die Analyse wiederholt, bis die besten Werte ermittelt werden, dann verwenden Sie die gleichen Einstellungen für alle folgenden Filme in der Datenreihe aber immer überprüfen, ob die gewählten Einstellungen geben eine gute Anpassung an die Daten werden: gut k 2 Grundstückeund einer linearen Diffusions Handlung. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Einstellungen speichern und fahren&quot;. </li><li> Klicken Sie &quot;Ja&quot;, um alle Grafiken zeigen. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Load Bild-Serie&quot; (siehe Kreis 2 in Abbildung 1), dann klicken Sie auf &quot;Arbeitsplatz&quot;. </li><li> Wählen Sie &quot;imgSerCrop&quot;, klicken Sie dann auf &quot;Import aus Workspace&quot;. </li><li> Geben Sie die Einstellungen für die Erfassung Abbildungssystem. In der Box &quot;Pixelgröße&quot; geben Sie die projizierten Pixelgröße für die Imaging-System, mit der die Bildstapeln erworben werden. Für AQP3-EGFP, 0,111 verwendet. Geben Sie im Feld &quot;Geben Sie die Zeit (en) zwischen den Bildern&quot;, 0,1150 für AQP3-EGFP verwendet. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Wählen ROIs&quot;, geben Sie &quot;1&quot;, klicken Sie auf OK und &quot;ganze Bild zu verwenden.&quot; </li><li> Klicken Sie auf &quot;Do KIC Analyse&quot; und klicken Sie auf Ja zu &quot;unbeweglich Filterung&quot; zu tun. Die Ergebnisse werden automatisch als Bilder zu öffnen. </li><li> Minimieren Sie das Einstellungsfenster, minimieren die Zelle info window, und das Fenster Photophysik zu minimieren. Im Fenster Dynamik, überprüfen Sie, dass die Dynamik Plot zeigt eine lineare Anpassung der Daten auf eine Linie mit einer negativen Steigung bedeutet, dass die Datenpunkte korrelieren und freie Diffusion ausgegangen werden. Aufzeichnen des Diffusionskoeffizienten für den bestimmten Zeitverzögerung und K 2 Einstellungen (es ist nicht notwendig zu beachten die Standardabweichung der Anpassung). Die Datenpunkte in den k 2 Grundstücke müssen auf der ganzen Linie für die gegebene Zeitverzögerungen geclustert werden. </li><li> Tick ​​Feld &quot;Speichern offenen Zahlen als Bilder&quot;, klicken Sie dann auf &quot;Speichern offenen Zahlen als Bilder&quot;, um zu speichern Ergebnisdateien. Speichern Sie in einem neuen Ordner unter C: Users Dokumente AQP3diffusion. Klicken Sie auf &quot;klare aktuellen Daten&quot; und weiter mit der Analyse des nächsten Ernte. </li></ol></li></ol> 3. Durchschnitts des berechneten Diffusionskoeffizient berechnet, um eine Übersicht über die analysierten Daten Get <ol><li> Geben Sie die einzelnen Diffusionskoeffizienten von jedem ROI in einem spreadsheet (stellen Sie sicher zu beachten die τ und k 2-Werte), verwenden Sie die Namen der Pflanzen, wie oben dargelegt. </li><li> Berechnen Sie die durchschnittliche Diffusionskoeffizienten und Standardabweichung mit einem Tabellenkalkulationsprogramm. </li><li> Führen Sie einen Kolmogorov-Smirnov-Test oder t-Test auf statistische Unterschiede zu bewerten mit einem 5%-Signifikanzniveau. Quantitave Vergleiche zwischen Zellen (beispielsweise gegen nicht-behandelten behandelt) hergestellt werden kann. </li><li> Öffnen Sie die Tabelle Version der Diffusionsstücke, die durch die Analyse-Software für jede Kultur erzeugt wurde, und der Mittelwert der Daten für jeden Zustand für jede Zeitverzögerung. Erstellen Sie einen neuen gemittelten Diffusions Grundstück für die Präsentation in Papiere oder Präsentationen. </li></ol>

<ol>
	<li>Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=k-Space+image+correlation+spectroscopy:+A+method+for+accurate+transport+measurements+independent+of+fluorophore+photophysics.">k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics.</a> Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).</li><li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+Applications+to+membrane+dynamics.">Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).</li><li>Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lateral+diffusion+of+membrane+molecules+with+quantum+dots.">Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots.</a> Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat Methods. 5, 695-702 (2008).</li><li>Pinaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+partitioning+of+a+glycosyl-phosphatidylinositol-anchored+protein+in+glycosphingolipid-rich+microdomains+imaged+by+single-quantum+dot+tracking.">Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking.</a> Traffic. 10, 691-712 (2009).</li><li>Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+analysis+of+single-molecule+tracking+data+by+comprehensive+testing+against+Monte+Carlo+simulations.">Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations.</a> Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).</li><li>Durisic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+correction+of+blinking+bias+in+image+correlation+transport+measurements+of+quantum+dot+tagged+macromolecules.">Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules.</a> Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).</li><li>Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+regulated+membrane+diffusion+of+a+green+fluorescent+protein-aquaporin+2+chimera.">cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera.</a> Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).</li><li>Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+in+the+endoplasmic+reticulum+of+an+aquaporin-2+mutant+causing+human+nephrogenic+diabetes+insipidus.">Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus.</a> The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).</li><li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+image+correlation+spectroscopy+(PICS):+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data.">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys J. 92, 613-621 (2007).</li><li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy:+concept+and+application.">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).</li><li>Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., L&#248;cke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+cAMP+increases+aquaporin-3+plasma+membrane+diffusion.">Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Dieses Papier präsentiert eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Überblick darüber, wie die KIC Analyseverfahren gelten für Diffusionskoeffizienten von Mikroskopiebilder von Proteinen mit fluoreszierenden Proteinen markiert bestimmen. Die Analyse ist unabhängig von der Wahl Sonde mit einem sehr breiten Dynamikbereich bei der Etikettierung Dichte und kann somit auch Proteine ​​mit Quantenpunkten sowie Farbstoffe und fluoreszierende Proteine ​​wie EGFP angewendet werden. Gültige Diffusionskoeffizienten für die Proteine ​​zu berechnen, gibt es mehrere wichtige Schritte, die optimiert wurden. Es ist wichtig, Bild markierten Proteine ​​nur auf der Membran. Wenn es zusätzliche bewegte Objekte wie Bläschen oder Zellorganellen in der Bildfolge analysiert werden, werden diese auf den berechneten Diffusionskoeffizienten, die in Unter-oder Überschätzung der Diffusionskoeffizienten führt bei. Nach den oben aufgeführten Schritte, ist die GUI-Code für die KIC benutzerfreundlich einnd Analyse ist schnell. Es umfasst mehrere Schritte durchschnittlich: sowohl der Kreismittelung und die Berechnung der Steigung der Piste Diffusions Grundstück als Funktion der Zeitverzögerungen, die schnelle Erstellung eines durchschnittlichen und statistisch signifikanten Wert für den Diffusionskoeffizienten erleichtert. So wird im Vergleich zu der umfassenden Analyse erforderlich, um Diffusionskoeffizienten von SPT Versuche, KIC berechnen ist benutzerfreundlich, schnell und kann ohne spezielle Ausbildung in der Biophysik durchgeführt werden. Wenn die Analyse ergibt sich ein negativer Diffusionskoeffizienten oder einer horizontalen Diffusion Grundstück umfasst die Fehlersuche visuelle Inspektion der Ernte zu sehen, ob es alle hier beschriebenen Anforderungen erfüllt. Kulturen, die zu klein sind, können unphysikalischen negativen Diffusionskoeffizienten ergeben und muss entsorgt werden. Um einen Diffusionskoeffizienten berechnen, ist es oft möglich, eine neue Ernte an anderer Stelle in der Datenmenge, die für Analyse oder erhöhen Sie einfach die Ernte machenGröße, wenn möglich. Diese Technik kann auf die meisten Datensätze angewendet werden, aber derzeit können KIC Analyse nur die Berechnung der durchschnittlichen Diffusionskoeffizienten und können nicht unterscheiden verschiedene Protein Migrationsmuster erzeugen oder Bahnen. Mit KIC können Diffusionskoeffizienten leicht extrahiert werden und Diffusion eines Proteins kann beispielsweise zwischen behandelten und nicht-behandelten Zellen oder zwischen einem Wildtyp-und ein mutiertes Protein, das zeigen wird, wenn die Behandlung von Mutationen induzieren Unterschiede in der Verbreitung und damit verglichen werden möglicherweise in Protein-Protein-und / oder Protein-Lipid-Wechselwirkungen. Plasmamembran durch Diffusion von AQP2 FRAP gemessen wurde gezeigt, dass bei der Zugabe von Forskolin, einer cAMP-Agonisten 10 zu verringern, und darüber hinaus im ER, eine mutierte Version von AQP2 verursacht Diabetes insipidus, anders als Wildtyp AQP2 9 diffundiert. Obwohl es möglich ist, Diffusionskoeffizienten aus einzelnen Teilchen d berechnenata mit mittleren quadratischen Verschiebung, Schritt-oder Partikelgrößenanalyse Bildkorrelationsspektroskopie 2,11,12, können diese Analyseverfahren rechenintensive und häufig erfordern benutzerdefinierte geschrieben Computeralgorithmen. Der Vorteil der hier vorgestellten KIC-Protokoll ist, dass es relativ unabhängig von Markierungsdichte und rechnerisch einfach ist. Dieser Spaziergang durch KIC Analyse wird daher nützlich für viele Zellbiologen, die leicht an ihrer Membran-Protein von Interesse kann es sein, gelten.

Die vierdimensionale Raum-Zeit-Organisation und die seitliche Beweglichkeit der Plasmamembran-Proteine ​​sind streng reguliert und können in Protein-Funktion, Aktivität und Protein-Protein-Wechselwirkungen eine Rolle spielen. Die laterale Diffusion von Plasmamembranproteinen, wird traditionell von der Berechnung Diffusionskoeffizienten für Einzelpartikel aus Zeitraffer-Bildgebung von Quantenpunkt-oder Farbstoff markierte Plasmamembran-Proteine ​​2-4 untersucht. Dieser Ansatz erfordert das Einführen eines extrazellulären Tag in der Plasmamembranprotein für Quantenpunkt oder Farbstoffmarkierung, die die Proteinfaltung und die Funktion beeinträchtigen können und daher nicht für einige Proteine ​​erreicht werden. Die sterische Volumen einer Quantenpunkt ist gezeigt worden, um die Diffusion des Proteins 5 zu verlangsamen und weiterhin nur ein winziger Bruchteil der Proteine ​​in der Bevölkerung mit Quantenpunkten markiert ist, und es ist nicht bekannt, ob diese Fraktion repräsentativ ist für die Gesamt Pool von Plasmamembranproteinen. Einzelpartikel tracking (SPT) Messungen der Diffusionskoeffizienten von Bild-Serie von Quantenpunkt-markierten Proteine ​​beinhaltet Zuordnung der abgebildeten Spitzenpositionen der Partikel mit zweidimensionalen Gauß-Anfälle durch umfangreiche Analysealgorithmen gefolgt. Die Analyse ist sehr rechenintensiv und erfordert umfangreiche nicht-lineare Kurvenanpassung in jedem Einzelbild einer Zeitraffersequenz, um Näherungen der Objektpunktverteilungsfunktion (typischerweise zweidimensionale räumliche Gauß) und anschließender Verknüpfung der Partikelpositionen in Trajektorien beschreiben die Bewegung einzelner Moleküle 6,7. Eine kürzlich entwickelte Bildkorrelationsverfahren, k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie (KIC) ermöglicht relativ einfachen Messungen der Diffusionskoeffizienten von fluoreszenzmarkierten Plasmamembranproteinen. Die Möglichkeit, routinemäßig berechnen Diffusionskoeffizienten von Membranproteinen mit fluoreszierenden Proteinen markiert durch KIC ist ein einzigartiges Werkzeug, das hältmehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Quantenpunkt SPT Analyse: Keine Insertion von extrazellulärem Tags und zeitaufwendig extrazelluläre Markierung erforderlich ist (Zelllinien, die fluoreszierende Proteine ​​verwendet werden können); Diffusionskoeffizienten aus dem Gesamtpool von fluoreszierenden Proteinen im Vergleich zu einer Teilmenge mit Quantenpunkten markiert extrahiert; Analyse ohne die Notwendigkeit, einzelne Proteine ​​verfolgt einfach und die Analyse kann unter Verwendung einer vorhandenen Code ohne Erfordernis zusätzlicher Anwenderprogrammierung durchgeführt werden. Das Verfahren ist schnell, da es eine Mittelungstechnik, die eine schnelle Berechnung und die Berechnung der Diffusionskoeffizienten ermöglicht. Diese schnellen Diffusionsmessungen für das Protein Bevölkerung ergänzen die detaillierte Informationen molekularen Transport durch die sorgfältige SPT Methoden für eine Teilmenge der Bevölkerung erhalten. KIC Zeit korreliert Fluoreszenzmikroskopie Bildfolgen, die als erste Fourierraum transformiert worden sind, und dadurch trennt fluorescence Schwankungen durch Photophysik von den zur molekularen Transport ein. Als Ergebnis kann die Anzahl KIC Dichte zu bestimmen, Durchflussgeschwindigkeit und Diffusion von fluoreszenzmarkierten Molekülen während unvoreingenommene durch komplexe Photobleichen oder blinkt der Fluorophore. Dies macht KIC ein nützliches Werkzeug für die schnelle Bestimmung der Diffusionsdynamik des fluoreszenzmarkierten Zellmembranproteinen, ohne dass individuelle Schreib Algorithmen. Neben der fluoreszenzmarkierten Proteine, KIC auch auf Quantenpunkt-markierten Membranproteine ​​8 angewendet werden. Dieses Papier bietet eine Schritt-für-Schritt-Einführung, wie man KIC verwenden, um Diffusionskoeffizienten von EGFP-markierten Plasmamembran-Proteine ​​durch den Nachweis, wie man die Ernte zu platzieren, wie man den Code und wie man die generierten Plots, auszuwerten extrahieren, aus dem Diffusions Koeffizienten extrahiert. Als Beispiel Daten durch Spinning-Disk-Mikroskopie-Set im internen Halbtotalreflexion erhalten fluoreszierennce (TIRF)-Modus, einer Nieren-Wasser-Kanal-Protein Aquaporin-3 (AQP3) mit EGFP markiert wird vorgestellt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31600-083</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td>10082147</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicilin&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/13752?lang=en&amp;region=DK">13752</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15160070</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11860038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol red free medium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11880-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8418?lang=en&amp;region=DK">D8418&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15630056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Apparatus</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spinning Disk Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Ti Eclipse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:71px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">Ixon+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy measurement of diffusion coefficients of egfp-tagged plasma membrane proteins using k-space image correlation spectroscopy

Lateral Diffusion und Kompartimentierung der Plasmamembran-Proteine ​​sind fest in Zellen reguliert und damit das Studium dieser Prozesse werden neue Erkenntnisse zur Plasmamembran-Protein-Funktion und Regulation offenbaren. Kürzlich, k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie (KIC) wurde entwickelt, um ein Routine-Messungen der Diffusionskoeffizienten direkt aus Bildern von fluoreszierend markierten Plasmamembran-Proteine, die von Photophysik Sonde eingeführt systematischer Fehler vermieden zu ermöglichen. Obwohl die theoretische Grundlage für die Analyse kompliziert ist, kann das Verfahren durch Nicht-Experten unter Verwendung einer frei verfügbaren Code zum Diffusionskoeffizienten von Proteinen messen implementiert werden. KIC berechnet eine Zeitkorrelationsfunktion von einem Fluoreszenzmikroskopie Bildstapel nach Fourier-Transformation jedes Bild, um gegenseitige (k-) Raum. Anschließend Kreismittelung, natürlichen Logarithmus-Transformation und lineare passt zu der Korrelationsfunktion ergibt sich die Diffusionskoeffizienten. DiesPapier bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Bildanalyse und Messung von Diffusionskoeffizienten über KIC. Zuerst wird eine hohe Bildrate Bildsequenz eines fluoreszierend markierten Plasmamembranprotein mit einem Fluoreszenzmikroskop erfasst. Dann wird ein Bereich von Interesse (ROI) zu vermeiden intrazellulären Organellen, Vesikel bewegt oder hervorMembranBereiche ausgewählt. Die ROI-Stapel in einem frei verfügbaren Code importiert und mehreren definierten Parameter (siehe Abschnitt Methode) sind für die KIC Analyse gesetzt. Das Programm erzeugt dann einen &quot;Hang Pisten&quot; Handlung aus den k-Raum-Zeit-Korrelationsfunktionen und der Diffusionskoeffizient wird aus der Steigung des Grundstücks berechnet. Unten finden Sie eine Schritt-für-Schritt-Verfahren, um die KIC Diffusionskoeffizient eines Membranproteins messen mit der renalen Wasserkanal Aquaporin-3 mit EGFP als kanonische Beispiel verschlagwortet.

Geeignete Bildstapeln mit KIC analysiert erwerben können unterschiedliche Mikroskopsystemen verwendet werden. Es ist möglich, Bildsequenzen aus einem Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskop sowie ein TIRF-oder Spinning-Disk-Setup zu analysieren. Die Membran muss ohne großen bewegten Zellorganellen oder beweglichen Vesikel / Objekte flach sein. Dieser Beitrag stellt eine Zeitraffer-Bildfolge von AQP3 mit EGFP markiert live MDCK Zellen auf einer sich drehenden Scheibe Mikroskop mit Fokus auf der Plasmamembran mit einer Bildrate von 9,2 Hz eingestellt abgebildet. Der Fokus wurde auf der basalen (unten) Plasmamembran gesetzt. Die Daten wurden vor kurzem in AJP Zelle 13 veröffentlicht. Fig. 2A zeigt ein Bild der Zelle. Die Maßstabsleiste ist 10 mm und beispielsweise ROI Pflanzen werden in Rechtecke markiert. Für die Auswahl der Pflanzen ist es wichtig, an der Peripherie der Zelle, wo die Membran einheitlich und flach, so dass nur eine zweidimensionale Diffusions visualisiert beschneiden. Cell Organellen, Vesikel und Membran Vorsprünge vermieden werden und es ist wichtig für die Analyse, dass es keine Drift während der Zeitspanne. Beispiele von Pflanzen, die von der Analyse ausgeschlossen werden würden, werden in den 2B und 2C dargestellt. Bewegen Vesikel Beitrag zur Korrelation (Fig. 2B) und die Löcher in der Membran, die in diesem Fall geringfügig bewegen (Fig. 2C) offensichtlich nicht in die Analyse einbezogen werden. Es ist auch wichtig, dass der ROI Ernte ist groß genug, um eine ausreichende räumliche Abtastung für die Analyse (für die Bildgebung mit einer hohen NA Objektiv eine Mindest linearen Größe von 32 Pixel ist eine vernünftige Richtlinie) zu haben. Für dieses Datensatzes ein 60X (NA 1.40) verwendet wurde. 3A zeigt die Diffusion Grundstück von einer Ernte mit KIC erzeugt. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um den Diffusionskoeffizienten eines Proteins mit EGFP (oder einem anderen fluoreszierenden Protein) markiert finden werden, einen Farbstoffoder Quantenpunkte. Die Steigung der Kurve in der Diffusionsstück ist einfach die Negativen der Diffusionskoeffizient. In diesem Fall ist der Diffusionskoeffizient von AQP3-GFP war 0,0104 ± 0,0040 &amp;mgr; m 2 / s ist. 3B ist eine berechnete Diffusionsstück mit zu vielen Zeitverzögerungen in diesem Fall die Analyse wiederholt wurde, jedoch mit weniger Zeitverzögerungen, so daß die Diffusions Grundstück linear ist. 4A stellt eine typische k 2 Grundstück. Dies ist der radial gemittelten und ln transformiert Korrelationskurve für eine ausgewählte Zeitverzögerung. Von diesen k 2 Grund die Neigung gegen die Zeit aufgetragen nacheilt und das Ergebnis ist die Diffusionsstück wie in 3A gezeigt. Bei der Überprüfung der k 2 Grundstücke, ist es wichtig, dass die Passform wird ausgewertet. 4B ist ein Beispiel für ak 2 Grundstück, für die kann geschlossen werden, dass die Ernte ist zu klein und konnte nicht, wie es sollte analysiert werden,haben eine negative Steigung und Verfall linear bis zu einem Rauschen. 4C ist ein Beispiel für ak 2 Grundstück, das mit einem reduzierten maximalen k 2 Wert wie die Passform erneut analysiert werden muss, ist nicht mehr gut (wie durch die Erhöhung der Reststoffe in größeren k beurteilt 2 Werte). In diesem Fall muss die Analyse ausgeführt werden wieder die Eingabe einer geringeren maximalen k 2-Wert, in diesem Fall 25. Abbildung 5 zeigt eine gemittelte Diffusions Grundstück, gemittelt über 10 Kulturpflanzen. Der Diffusions Grundstück wurde in der Excel-Datei aus der Analyse gefunden, und alle Diffusions Plots können jetzt für alle Pflanzen aus dem gleichen Versuch gemittelt werden. In der daraus resultierenden Diffusions Grundstück verschiedene Behandlungen der Zelle kann in der gleichen Figur kombiniert werden. Parallel Trendlinien sind gleich Diffusionskoeffizienten und nicht parallelen Trendlinien zeigen ungleiche Diffusion. In dieser Figur ist die AQP3-EGFP Diffusionskoeffizienten (Daten von AJP Zelle 13) berechnet. Abbildung 1. Screenshot der KIC Analysefenster. In diesem Fenster die KIC-Analyse durchgeführt wird. Die Kreise zeigen an, welche Tasten für die einzelnen Schritte in dem Protokoll zu drücken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51074/51074fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51074/51074fig2highres.jpg" width="300" /> Abbildung 2. Disk-Image einer Zelle, die GFP Spinning. (A) Repräsentatives Bild eines MDCK-Zell stabil exprimieren AQP3-GFP und repräsentativen Kulturen gezeigt. Das Bild wird auf einer Drehscheibe Mikroskop mit Fokus in der Nähe des basalen Plasmamembran erworben. (B) Repres<html> entative Ernte, die von der Analyse ausgeschlossen wurde in KIC, da es sich bewegenden Bläschen, die auf die Diffusionskoeffizienten beitragen können. (C) Ein Beispiel für eine Kultur, in der es ein Loch in der Membran, damit diese Kultur wurde von der Analyse ausgeschlossen. Alle Maßstabsbalken sind 10 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51074/51074fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51074/51074fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Diffusion Parzellen. (A) Ein Vertreter Diffusions Grundstück, in dem alle Punkt sind nahe an der Linie fit. Dies ist eine gute Diffusions Grundstück, weil die Daten sind linear. (B) Ein Beispiel für eine Diffusions Grundstück, für das die Analyse muss mit einer geringeren Anzahl von timelags erneuert werden.<html> 3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51074/51074fig4highres.jpg" width="300" /> 4. Beispiele für k 2 Grund. (A) Ein Beispiel für ein gut k 2 Diagramm, in dem die Datenpunkte gleichmäßig auf beiden Seiten des Linienanpassung verteilt. (B) Ein Beispiel von ak 2 Grundstück für eine Ernte kleiner als die optimale Größe. In diesem k 2 Grundstück, ist die Neigung der Linie fit positiv, sollte es negativ und damit die Ernte wird von der Analyse ausgeschlossen werden. (C) Das k 2 Plot zeigt, dass die Analyse muss mit einer geringeren maximalen k 2-Wert, um den Teil des k 2 Grundstück wählen wiederholt werden waren die Daten gleichmäßig auf beiden Seiten der Linie fit verteilt.oad/51074/51074fig4highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51074/51074fig5highres.jpg" width="500" /> Abbildung 5. Gemittelten Diffusions Handlung. Gemittelten Diffusions Ein Grundstück, das über 10 Kulturen gemittelt wurde.

Watch this Scientific Journal Video about Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy at JoVE.com

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Dieses Papier bietet eine Schritt für Schritt Anleitung, um die Fluktuationsanalyse-Technik k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie (KIC) zur Messung der Diffusionskoeffizienten von fluoreszenz in lebenden Säugerzellen gekennzeichnet Plasmamembranproteinen.

Einfache Messung des Diffusionskoeffizienten von EGFP-markierten Plasmamembranproteine ​​Mit k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

easy-measurement-diffusion-coefficients-egfp-tagged-plasma-membrane

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Aufrufe.  Aarhus University.  Dieses Papier bietet eine Schritt für Schritt Anleitung, um die Fluktuationsanalyse-Technik k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie (KIC) zur Messung der Diffusionskoeffizienten von fluoreszenz in lebenden Säugerzellen gekennzeichnet Plasmamembranproteinen. 

Serie: Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) of macromolecules, and can be applied to both in vitro and in vivo biological systems. Multi-fluorescence recovery after photobleaching is performed by photobleaching a region of interest within a fluorescent sample using an intense laser flash, then attenuating the beam and monitoring the fluorescence as still-fluorescent molecules from outside the region of interest diffuse in to replace the photobleached molecules. We will begin our demonstration by aligning the laser beam through the Pockels Cell (laser modulator) and along the optical path through the laser scan box and objective lens to the sample. For simplicity, we will use a sample of aqueous fluorescent dye. We will then determine the proper experimental parameters for our sample including, monitor and bleaching powers, bleach duration, bin widths (for photon counting), and fluorescence recovery time. Next, we will describe the procedure for taking recovery curves, a process that can be largely automated via LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) for enhanced throughput. Finally, the diffusion coefficient is determined by fitting the recovery data to the appropriate mathematical model using a least-squares fitting algorithm, readily programmable using software such as MATLAB (The Mathworks, Natick, MA).

In this article we will describe the procedure for measuring diffusion coefficients using multi-photon fluorescence recovery after photobleaching. We will begin by aligning the laser along the optical path to the sample and determining the proper experimental parameters, then continue generating and finally fitting fluorescence recovery curves.

Mess-Diffusionskoeffizienten über Zwei-Photonen-Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Forschung

Biologie

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. Lipid rafts are membrane microdomains enriched in cholesterol and sphingolipids. They play a role in cellular physiological processes such as signalling, and trafficking1,2 but are also thought to be key players in several diseases including viral or bacterial infections and neurodegenerative diseases3.
Yet their existence is still a matter of controversy4,5. Indeed, lipid raft size has been estimated to be around 20 nm6, far under the resolution limit of conventional microscopy (around 200 nm), thus precluding their direct imaging. Up to now, the main techniques used to assess the partition of proteins of interest inside lipid rafts were Detergent Resistant Membranes (DRMs) isolation and co-patching with antibodies. Though widely used because of their rather easy implementation, these techniques were prone to artefacts and thus criticized7,8. Technical improvements were therefore necessary to overcome these artefacts and to be able to probe lipid rafts partition in living cells.
Here we present a method for the sensitive analysis of lipid rafts partition of fluorescently-tagged proteins or lipids in the plasma membrane of living cells. This method, termed Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), relies on the disparity in diffusion times of fluorescent probes located inside or outside of lipid rafts. In fact, as evidenced in both artificial membranes and cell cultures, probes would diffuse much faster outside than inside dense lipid rafts9,10. To determine diffusion times, minute fluorescence fluctuations are measured as a function of time in a focal volume (approximately 1 femtoliter), located at the plasma membrane of cells with a confocal microscope (Fig. 1). The auto-correlation curves can then be drawn from these fluctuations and fitted with appropriate mathematical diffusion models11.
FCS can be used to determine the lipid raft partitioning of various probes, as long as they are fluorescently tagged. Fluorescent tagging can be achieved by expression of fluorescent fusion proteins or by binding of fluorescent ligands. Moreover, FCS can be used not only in artificial membranes and cell lines but also in primary cultures, as described recently12. It can also be used to follow the dynamics of lipid raft partitioning after drug addition or membrane lipid composition change12.

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

A technique to probe the lipid raft partitioning of fluorescent proteins at the plasma membrane of living cells is described. It takes advantage of the disparity in diffusion times of proteins located inside or outside of lipid rafts. Acquisition can be performed dynamically in control conditions or after drug addition.

Bestimmung der Lipid Raft Partitionieren von Fluoreszenz-markierten Sonden in lebenden Zellen mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

Mapping molekulare Diffusion in der Plasmamembran durch Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen zur Strukturaufklärung von Makromolekulare Kristallographie Grown

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Die Cell-basierten L-Glutathion Schutz Assays zur Endozytose und Recycling von Plasmamembranproteinen Studieren

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imaging Plasmamembran Verformungen Mit pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and product development. Stress-strain relationships are typically obtained from mechanical testing data to enable comparative assessment among samples and in some cases identification of constitutive mechanical properties. However, errors may be introduced through the use of average strain measures, as significant heterogeneity in the strain field may result from geometrical non-uniformity of the sample and stress concentrations induced by mounting/gripping of soft tissues within the test system. When strain field heterogeneity is significant, accurate assessment of the sample mechanical response requires measurement of local strains. This study demonstrates a novel biomechanical testing protocol for calculating local surface strains using a mechanical testing device coupled with a high resolution camera and a digital image correlation technique. A series of sample surface images are acquired and then analyzed to quantify the local surface strain of a vascular tissue specimen subjected to ramped uniaxial loading. This approach can improve accuracy in experimental vascular biomechanics and has potential for broader use among other native soft tissues, engineered soft tissues, and soft hydrogel/polymeric materials. In the video, we demonstrate how to set up the system components and perform a complete experiment on native vascular tissue.

We describe the use of digital image correlation to characterize the local surface strain field on vascular tissue samples subjected to uniaxial tensile testing. These measurements facilitate precise quantification of the sample mechanical response and the generation of constitutive stress-strain relations.

Verwenden von Bildkorrelation Lokale Stämme auf Gefäßgewebeproben zu charakterisieren

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...

Einfache Messung des Diffusionskoeffizienten von EGFP-markierten Plasmamembranproteine ​​Mit k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie

Einfache Messung des Diffusionskoeffizienten von EGFP-markierten Plasmamembranproteine Mit k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie