Die Autoren bedanken sich bei der Freimann Life Science Center und Center for Zebrafisch Wissenschaftliches Personal danken für ihre Pflege und Wartung der Zebrafisch.

1. Morpholino Zubereitung: <ol><li> Alle Morpholino-Oligos sollten individuell gestaltet und bestellt durch GeneTools (Philomath, OR). Wir verwenden die positiv geladenen Lissamin-tagged Morpholinos der Elektroporation Morpholinos in Richtung der negativen Elektrode zu fahren. Wir versuchten vergeblich, negativ geladene Fluorescein-markierten Morpholinos zur positiven Elektrode mit dieser Technik Ziel. Verdünnen Sie 300 nmol der Morpholino in 100 pl Nuklease-freies Wasser zu einer 3 mM Lösung zu erhalten. Aliquot der Morpholino in mehrere Paraffin versiegelt Mikrozentrifugenröhrchen. Getrennt von Licht bei Raumtemperatur. </li><li> Bestimmen Sie die Morpholino-Konzentration durch Verdünnen von 5 ul der Morpholino (oder Wasser verwendet werden, um die Morpholino als leere verdünnt) in 95 ul 0,1 N HCl. Stellen Sie die Spektralphotometer Wellenlängen (λ) bis 265 nm liegt. Berechnen Sie die Konstante für Ihre Morpholino mit folgender Gleichung: Constant = Molekulargewicht insbesondere Ihre morpholino X 1000/molar Absorption. </li><li> Sie werden das Molekulargewicht und die molare Extinktion Daten auf dem &quot;Oligo Properties&quot; Blatt mit jeweils Morpholino erhalten haben. Analysieren Sie die leere zum Ausgangswert Lesungen zu überprüfen und zu Lesungen der verdünnten Morpholino. Multiplizieren Sie die Absorption bei 265 nm von jedem Morpholino durch seine bestimmte Konstante und mit dem Verdünnungsfaktor, um die Konzentration in ng / ul erhalten. Teilen Sie diese Zahl durch das Molekulargewicht und der Konzentration in mM bestimmen. Verdünnen Sie die Morpholino, falls erforderlich, auf eine Arbeitskonzentration. </li></ol> 2. Entfernen Sie die äußere Schicht der Hornhaut: <ol><li> Anesthetize 6-12 Monate alten erwachsenen Zebrafisch in Tricaine oder 2-Phenoxyethanol bei 1,0 mg / ml in Zebrafisch-Tank Wasser. </li><li> Wrap Zebrafisch in einem feuchten Stück Küchenpapier, für die Kiemen, sondern verlassen das Auge ausgesetzt. Die umwickelten Fisch ist unter einem Stereoskop platziert und die Vergrößerung wird erhöht, bis der Durchmesser des Auges füllt etwa ein Drittel derdes Gesichtsfeldes (Abbildung 1). </li><li> Mit Dumont Nr. 5 Pinzette greifen die äußeren Hornhaut in der Nähe der Augenspalte. Dieses Gewebe wird in roter Farbe und der Aufschrift &quot;OC&quot; in Abbildung 1. Es gibt einen leichten Vorsprung oder Lippe durch den Pfeil mit der Aufschrift &quot;CL&quot; angezeigt. Ziehen Sie in einem flachen Winkel (zB 10 Grad) über das Auge auf die äußere Hornhaut zu entfernen. Mit der Praxis kann dies in einer Bewegung abgeschlossen sein. Wenn der Pinzette rutschen, wieder greifen das Gewebe wieder in einem flachen Winkel ziehen, bis entfernt. Ein gut befestigt Hornhaut kann das Auge aus der Steckdose verdrängt werden, wenn gezogen wird. Sie können das Auge davor verdrängt durch Verstetigung mit einem anderen Satz von Pinzetten zu halten. </li></ol> 3. Hornhautschnitt und Morpholino-Injektion: <ol><li> Unmittelbar nach dem Entfernen der äußeren Hornhaut, machen einen kleinen Schnitt in der Hornhaut, wo die Schüler erfüllt die Iris (Abbildung 2). Dies geschieht mit Hilfe einer Saphir-Skalpell (siehe Materialien). </li><li> Last 0,5 ul des 3,0 mM Morpholino-Lösung in eine Hamiltauf Spritze mit einer 33-Gauge abnehmbar, blunt-end-Nadel (siehe auch Material) ausgestattet. Pipette auf und ab, um Luftblasen in der Leitung zu entfernen. Schieben Sie die Nadel in den Glaskörper durch den Schnitt (Abbildung 2). Setzen Sie die Nadel zu weit, oder Sie werden Löcher in die Netzhaut oder verdrängen die Linse. </li><li> Spritzen Sie das Morpholino-Lösung in den Glaskörper Raum. Je nach Alter der Fische wird die Glaskörper Raum halten ~ 0,5 pl. Sie sollten visualisieren ungefärbte Glaskörper ein Auslaufen des Einschnitts, wie sie von der Morpholino-Lösung versetzt wird. Inject, bis eine kleine Menge von Morpholino-Lösung tritt aus dem Schnitt. Sie sollten deutlich sichtbar die Lissamin-tagged Morpholino im Inneren des Auges. </li><li> Nach der Injektion Rückkehr der Fische in den Tank zu erholen. Wir in der Regel nur zu injizieren dem linken Auge, mit dem rechten Auge als injizierten Kontrolle, aber die Elektroporation von beiden Augen möglich ist. </li></ol> 4. Elektroporation: <ol><li> Folgendedie Injektion von etwa 10 Fisch-, re-betäuben einer injizierten Fische und wickeln Sie es in ein feuchtes Stück Küchenpapier, nur für die Kiemen, sondern verlassen das Auge ausgesetzt. Übertragen Sie die Fische in eine Petrischale. Setzen Sie auf Latex oder ähnliche Handschuhe, um Kontakt mit der Narkose zu vermeiden. Während sanft Halten der Fische auf den Boden der Schale, füllen Sie die Schale mit Anästhesie (Abbildung 3, links). </li><li> Ein 3-mm-Durchmesser Platinplatte Elektrode (siehe Materialien) lokalisiert die Elektroporation Impulse etwa die Hälfte der Netzhaut. Wir typischerweise Ziel der dorsalen Retina. Drücken Sie vorsichtig die positive Elektrode nach unten auf der ventralen Hälfte des Auges. Mit der äußeren Hornhaut entfernt, ist das Auge leicht gedreht, Freilegung der dorsale Teil des Augapfels. </li><li> Während noch nach unten drücken auf der Bauchseite des Auges, statt der negativen Elektrode in der Nähe (~ 1 bis 2 mm) der exponierten dorsalen Hälfte des Auges. Achten Sie darauf, nicht auf die negative Elektrode direkt zu berühren, um das Auge, das wird in schädlichen Ergebnisder dorsalen Retina. Sobald Sie den richtigen Abstand zwischen den Elektroden zu ermitteln, verwenden Sie die Stellschraube am Griff der Elektroden an, dass Ausbreitung zu halten, wenn Elektroporation. Dies hält die negative Elektrode einen optimalen Abstand vom Augapfel, wenn die positive Elektrode unten in Position gedrückt. </li><li> Elektroporieren das Auge mit einem CUY21 Square Wave Electroporator (siehe Materialien). Die Elektroporation Parameter sollten auf zwei aufeinander folgende 50-ms Impulse gesetzt werden, bei 75 V mit einem 1-Sekunden-Pause zwischen den Impulsen. </li><li> Zurück Fische in den Tank. Wir beginnen normalerweise unser Protokoll für konstantes Licht-induzierten Netzhautdegeneration unmittelbar nach der Elektroporation. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: <ol><li> Für 3-5 Tage nach der Elektroporation (abhängig von der Stabilität der Morpholino), kann die Lissamin Label visualisiert werden in allen Netzhautschichten in einer geschnittenen Netzhaut (Abbildung 4). Dieses dient als Bestätigung für das Vorhandensein vonder markierten Morpholino. </li><li> Wir können voller Protein Knockdown von bis zu 3-5 Tage nach der Elektroporation zu erreichen, abhängig von der Wirksamkeit der Morpholino (Abb. 5). In der Regel während der Licht-Therapiestudien ernten wir die Augen auf 3 oder 4 Tage nach Morpholino Elektroporation. Und Verarbeitung des Gewebes für die Immunhistochemie 15; Dies wird durch Entfernen des gesamten Auges mit Dumont # 5B Zange mit gebogenen Enden (Materials Abbildung 6) durchgeführt. Wie bei jedem Knockdown-Technik, muss eine Demonstration effizienter Knockdown gezeigt, um den Phänotyp zu bestätigen. Daher empfehlen wir den Erhalt Antiseren für Ihr Protein von Interesse. Alternativ, wenn und Antikörper nicht zur Verfügung steht und die Morpholino darauf gerichtet, die Spleiß-Akzeptor oder Donator Ort in der prä-mRNA entweder, blockiert effizientes Spleißen der mRNA. In diesem Fall ist es möglich, Reverse-Transkriptase-PCR verwenden, um die flankierenden Sequenzen in der morphant RNA-Amplifikation und bestimmen die Effizienz der Blockierung der normalen splicIng. Muster. </li><li> Wenn die Netzhaut geschnitten aus Nase, um die zeitliche auf der dorsalen ventralen Achse sind, stellen die schraffierten blauen Feldern (Abbildung 6) die Bereiche der Netzhaut, die meist aus der Elektroporation Veranstaltung selbst sind beschädigt. Die schattierten rosa Box stellt den Bereich, der für Morpholino Einführung in Netzhautzellen durch die Elektroporation ausgerichtet ist. </li></ol><img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Entfernung der epithelialen Schichten der Hornhaut. Die linke Tafel zeigt die wichtigsten strukturellen Merkmale des Auges, einschließlich der Linse (L), der Glaskörper (Vit), der Netzhaut (R), der äußeren Hornhaut (OC), die innere Hornhaut (IC) und die Hornhaut Vorsprung ( CL). Die Orientierung des Auges ist in der unteren rechten Ecke des ersten Panel dargestellt und beschriftet anterior (A), posterior (P), dorsal (D) und ventralen (V). Die rote Färbung zeigt die äußere Hornhaut wird entfernt. Die zweite Pfanne<html> el zeigt, wie die Zange verwendet werden, um die Hornhaut Vorsprungs zu erfassen und die äußeren Hornhaut in das Auge ziehen in einem flachen Winkel (dritter Teil). Das rechte Bild zeigt, wie eine zweite Zange zu stabilisieren das Auge eingesetzt werden können, während Sie den Hornhaut. <img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung der Schritte in die intravitreale Injektion von Morpholino beteiligt. Durch einen kleinen Schnitt in das Auge, wo der Schüler erfüllt die Iris (linkes Bild) gemacht. Die entstandene Lücke sollte gerade groß genug für eine 33-Gauge-Nadel, die mit dem Morpholino-Lösung eingesetzt werden soll (Mitte) gefüllt ist. Langsam injizieren 0,5 ul-Lösung in den Glaskörper (rechtes Bild). Sie sollten visualisieren eine kleine Menge von Glaskörper-Lösung aus dem Einschnitt kommen, wie der Glaskörper wird teilweise durch mit Morpholino (rechtes Bild) Lissamin-Tag ersetzt. ig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3. Schematische Darstellung des allgemeinen Elektroporation Verfahren. Die betäubten Fische, die intravitreal mit dem Morpholino injiziert wurde, wird sanft in feuchten Papiertuch (links) gewickelt. Das Papiertuch sollte sich auf die Kiemen, aber nicht behindern das Auge (Mitte). Drücken Sie vorsichtig die positive Elektrode auf den ventralen Teil des Auges, so dass die dorsale Hälfte des Auges zu drehen aus der Steckdose. Legen Sie die negative Elektrode ca. 1 mm von der dorsalen Hälfte des Auges und starten Sie die Elektroporation (rechts). <img alt="Abbildung 4." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig4.jpg" /> Abbildung 4. Confocal image Vergleich einer Netzhaut ohne intravitreal Injektion eines Lissamin-tagged Morpholino (A) und einer Netzhaut intravitreal einschleusen und mit den Lissamin-tagged Morpholino (B) elektroporiert elektroporiert. Die Lissamin Label ist in allen Netzhautschichten und Zelltypen gefunden. ROS-, Stab äußerenSegmente; ONL, äußeren Körnerschicht; INL, innere Körnerschicht; GCL, Ganglienzellschicht. <img alt="Abbildung 5." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig5.jpg" /> Abbildung 5. Konfokalen Bildern verglichen PCNA Immunolokalisation in Netzhaut mit einem Kontroll-Mor (linkes Bild) und Netzhaut mit einem Anti-PCNA Morpholino (rechte Bilder) vor lichtinduzierten Absterbens der Sehzellen elektroporiert elektroporiert. Dark-angepasst erwachsene Albino Zebrafisch wurden in konstanten intensives Licht für 1, 2 oder 3 Tage nach der Elektroporation der Morpholino platziert. Die Steuerung Morpholino nicht erhöht PCNA-Expression in der Licht-geschädigten Netzhaut zu unterdrücken. Die anti-PCNA Morpholino effizient niedergeschlagen PCNA-Protein-Expression durch drei Tagen konstant intensive Licht führen. <img alt="Abbildung 6." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig6.jpg" /> Abbildung 6. Schaltplan (links) zeigt Enukleation des Auges für processing und Kryoschneiden, die entlang der dorsalen ventralen Achse erfolgt. Die rosa farbigen Feld (rechts) zeigt die Netzhaut Region mit der größten Menge an Protein Knockdown mit dieser Technik. Die blau unterlegten Kästen stellen Bereiche dar, die am häufigsten durch die Elektroporation Ereignis beschädigt sind. Die Orientierung des Auges ist anterior (A), posterior (P), dorsal (D) gekennzeichnet sind, und ventralen (V).

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P., Song, P., McDermott, J., Brewer, J., Perry, M., Zhang, X., Hyde, D. R., Godwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fin+regeneration+using+in+vivo+electroporation+of+morpholinos+against+fgfr1+and+msxb.">Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb.</a> Dev. Dyn. 235, 336-346 (2006).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. 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Wir haben nichts zu offenbaren

Vor kurzem wurden zwei Microarray-Analysen der Veränderungen der Genexpression, die während der Regeneration der entweder das Licht geschädigte Netzhaut oder eine chirurgisch-herausgeschnitten Retina-Patch 10, 16 aufgetreten. Beide Studien ergaben zahlreiche Gene, die signifikante Veränderungen in der Expression zeigten, entweder steigend oder fallend, die wahrscheinlich für verschiedene Ereignisse, die während der Netzhaut Regeneration auftreten, wie re-entry der Müller Gliazellen in den Zellzyklus notwendig, weiterhin die Proliferation und Migration der neuronalen Vorläuferzellen, um die beschädigte Netzhaut, und die Differenzierung der neuronalen Vorläuferzellen in die richtige neuronalen Zelltyp. Während ein direkter Vergleich dieser beiden Microarray-Datensätze Kandidatengene, die in dieser zellulären Vorgänge beteiligt sein können, zeigen letztlich diese Gene und ihre kodierten Proteine ​​muss daraufhin getestet, ob sie notwendig für die neuronale Regeneration sind. Hier beschreiben wir eine leistungsfähige loss-of-function-Ansatz zur conditiointern Knockdown Proteine ​​von Interesse in der erwachsenen Zebrafisch Retina. Diese Technik wurde verwendet, um sowohl extra-und intrazellulären Proteinen, sowie Signalmoleküle, Transkriptionsfaktoren und Proteine ​​für die DNA-Replikation 17-19 erforderlich studieren. So hat diese Methode unser Verständnis des molekularen Mechanismus zugrunde liegenden erwachsenen Retina Regeneration im Zebrafisch unterstützt. Wir testeten mehrere Elektroporation (Spannung, Anzahl der Impulse, Zeit zwischen den Impulsen), bevor eine erfolgreiche Protokoll wurde erreicht. Ein früherer Bericht der Elektroporation Morpholinos in die regenerierende Zebrafisch Schwanzflosse verwendet 10 Impulse bei einer niedrigen Spannung (15 V) 20. Da die erwachsenen Zebrafisch Retina durch mehrere Zellschichten umgeben ist und nicht leicht zugänglich Pinzette Elektroden wurden die Parameter in der Flosse verwendet bei effizienter Elektroporation Morpholinos in die Erwachsenenwelt Netzhaut erfolglos. Umgekehrt kann eine hohe Spannung (100 V) oft resulted in den Tod, um die Fische. Kürzlich, 5 Impulse von 80 V wurde beschrieben, um Plasmid-DNA in der neugeborenen Maus pup Netzhaut 21 elektroporieren. Wir fanden, dass ein etwas weniger intensiv 2 Impulse von 75 V in erfolgreiche Elektroporation des Morpholinos führte in die Erwachsenenwelt Zebrafisch Retina mit dem Überleben von 100% der behandelten Fische. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Entfernung der äußeren meisten (oder externen meisten) Komponente der Hornhaut stark erhöht die Elektroporation Effizienz. Die Erhöhung der Anzahl der Impulse kann die Notwendigkeit für Entfernung dieses Gewebes kann aber auch dazu führen, größere Gewebeschäden. Umfangreiche Kontroll-Studien zeigten, dass diese Parameter zu keinerlei signifikanten retinalen Zelltod oder ändern Sie die spezifische zelluläre Reaktionen während Photorezeptor Regeneration 19 beobachtet. Gain-of-function-Studien sind derzeit nicht möglich, mit dieser Technik in vivo, durch unsere Unfähigkeit, konsequent elektroporieren großen Ribonukleinsäuren in allen retinal Zellen. Allerdings schlägt der Erfolg der Elektroporation Plasmide in der Maus Netzhaut in vivo und der Zebrafisch Retina in Explantaten ist es immer noch eine Möglichkeit, in Zebrafisch-21, 22. Eine der Stärken dieser Technik ist die Elektroporation scheint effizient einführen Morpholino in all den verschiedenen retinalen Zelltypen. Allerdings wurde eine mögliche Schwäche, die Elektroporation effizient lieferte die Morpholino nur in die dorsalen und zentralen Netzhaut Regionen. Eine zweite Elektroporation Veranstaltung auf die ventrale Hälfte der Netzhaut führt zu einer guten Ausrichtung auf alle Ebenen, sondern führt oft zu Schäden. Diese räumliche Beschränkung wahrscheinlich war aufgrund der Form und Platzierung der Elektroden. Der Einsatz von maßgeschneiderten becherförmigen Elektroden, die um das Auge gebracht werden konnte verbessern kann diese Schwäche. Diese räumliche Beschränkung der Morpholino Lieferung beschränkt die Verwendung dieser Technik und schließt die Verwendung eines Assays erfolgreichh als ERG-Analyse, dass eine umfassende Beurteilung der Netzhaut benötigen würde. Anzumerken ist, dass wie bei jedem Morpholino Experiment, ist es ratsam, Ihre Ergebnisse bestätigen die Verwendung eines zweiten, nicht-überlappenden Morpholino auf die Ziel-mRNA werden. In einigen Fällen ist es möglich, auch elektroporieren zwei verschiedene Morpholinos gleichzeitig knockdown die Expression von zwei verschiedenen Proteinen. Wir haben gezeigt, das durch Klopfen Sie den Ausdruck sowohl der Pax6a und Pax6b Proteine, einzeln und in Kombination 18. Obwohl wir die Verwendung dieser Technik demonstriert mit unseren Licht-Schadensmodell, könnte es wahrscheinlich zur Regeneration in anderen Schäden Modelle 2-8 Studie werden oder verwendet werden, um die Funktion von Proteinen in der unbeschädigten Netzhaut zu untersuchen. Zum Beispiel könnte die Elektroporation von Morpholinos zum Knockdown die Expression bestimmter Kanäle oder Signaltransduktionsmoleküle in Ganglion oder Amakrinzellen werden und dann studieren die Funktion dieser SignalisierungWege in der visuellen Verarbeitung. Doch wie Morpholinos nur auf Übersetzung der neuen Protein, müsste man warten, bis endogenes Protein Umsatz erfolgt, bevor ein Test durchgeführt werden konnte. Je nach Stabilität des Proteins könnte, dass von Stunden auf Tage 18 Bereich.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> CUY21-EDIT oder CUY21-SC Rechtecksignal Elektroporator </td><td> Protech Internationalen </td><td> CUY21EDIT oder CUY21SC </td><td> Beide Geräte arbeiten nach diesem Protokoll </td></tr><tr><td> 3-mm Durchmesser Paddle-Elektroden </td><td> Protech Internationalen </td><td> CUY 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morpholino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morpholino sollte speziell entwickelt, um Ihre Protein von Interesse sein </td></tr><tr><td> 2-Phenoxyethanol </td><td> Sigma </td><td> 77861-1L </td><td> Anästhesie, verdünnt 1:1000 in Fisch System Wasser für Verfahren, 1:500 für Sterbehilfe </td></tr><tr><td> Dumont Nr. 5 Pinzette </td><td> World Precision Instruments </td><td>14095 </td><td> Jede Nr. 5 Pinzette mit der Arbeit </td></tr><tr><td> Dumont # 5B Pinzette mit abgewinkelten Spitzen </td><td> World Precision Instruments </td><td> 500234 </td><td> Wird verwendet, um entkernen Auge nach Euthanasie </td></tr><tr><td> Sapphire Blade, Double Edge Lanze, 1 mm breit, mit Sapphire Messergriff </td><td> World Precision Instruments </td><td> Blade: 500314 Griff: 500317 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton-Spritze mit abnehmbarem 33 gauge blunt-end Nadel </td><td> Hamilton Firma </td><td> Spritze: 87930 Needle: 7762-06 </td><td> Entfernen Sie die Nadel, die mit der Spritze kommt und ersetzen mit 33-Gauge blunt-end Nadel </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina

Viele verheerende erbliche Augenerkrankungen führen progressive, irreversible Blindheit, weil die Menschen nicht mehr regenerieren kann sterben oder krank Netzhautneuronen. Im Gegensatz dazu besitzt die erwachsenen Zebrafisch Retina die robuste Fähigkeit, spontan regenerieren jede neuronale Klasse, die in einer Vielzahl von verschiedenen Netzhauterkrankungen Modelle, einschließlich der Netzhaut Punktion, chemische Ablation, konzentriert hohen Temperaturen und intensive Licht-Behandlung 1-8 verloren. Unser Labor ausgiebig Regeneration der Photorezeptoren folgenden konstant intensive Licht-Behandlung und der inneren Netzhaut-Neuronen nach intravitrealen Ouabain Injektion 2, 5, 9 aus. In allen Fällen, wohnhaft Müller Gliazellen wieder in den Zellzyklus zu neuronalen Vorläuferzellen, die sich zu vermehren und auf die richtige Netzhaut, wo sie differenzieren sich in der mangelhaften Neuronen wandern weiter zu produzieren. Wir charakterisiert fünf verschiedenen Stadien während der Regeneration der Licht-damaged Netzhaut, die durch spezifische zelluläre Reaktionen hervorgehoben wurden. Wir identifizierten mehrere differentiell exprimierte Gene in jeder Phase des retinalen Regeneration durch mRNA-Microarray-Analyse 10. Viele dieser Gene sind auch entscheidend für okuläre Entwicklung. Um zu testen, die Rolle der einzelnen Kandidaten-Gen / Protein während Netzhaut Regeneration, mussten wir eine Methode zur bedingten Begrenzung der Ausdruck eines Kandidaten-Protein nur in Zeiten der Regeneration der erwachsenen Retina entwickeln. Morpholino-Oligos sind weit verbreitet, um den Verlust der Funktion der Proteine ​​während der Entwicklung von Zebrafisch, Xenopus, chick, Maus zu studieren, und Tumore in menschlichen Xenotransplantate 11-14. Diese modifizierten Oligos Basenpaar mit komplementären RNA-Sequenz zu blockieren das Spleißen oder Translation der Ziel-RNA. Morpholinos werden in der Zelle stabil und können beseitigt oder &quot;Knockdown&quot;-Protein-Expression für drei vor fünf Tagen 12. Hier,beschreiben wir eine Methode zur effizienten Knockdown Expression des Zielproteins in der erwachsenen Zebrafisch Retina. Dieses Verfahren verwendet Lissamin-markierten antisense Morpholinos, dass in den Glaskörper des erwachsenen Zebrafisch Auge injiziert werden. Mit Elektrode Pinzette ist das Morpholino dann in alle Zelltypen des dorsalen und zentralen Netzhaut elektroporiert. Lissamine bietet die Ladung auf dem Morpholino für die Elektroporation und visualisiert werden können, um die Anwesenheit der Morpholino in die Zellen der Netzhaut zu beurteilen. Bedingte Knockdown in der Netzhaut kann verwendet werden, um die Rolle von spezifischen Proteinen zu verschiedenen Zeiten während der Regeneration zu untersuchen. Darüber hinaus kann dieser Ansatz verwendet, um die Rolle von spezifischen Proteinen in der unbeschädigten Netzhaut, in solche Prozesse wie visuelle Signaltransduktion und visuelle Verarbeitung in Neuronen zweiter Ordnung zu studieren.

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In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Eine Methode, bedingt Knockdown ein Zielprotein Ausdruck in der erwachsenen Zebrafisch Retina beschrieben, das geht intravitreal Injektion antisense Morpholinos und Elektroporation sie in der Netzhaut. Das resultierende Protein ist für mehrere Tage, die Prüfung des Proteins Rolle bei der Regeneration oder intakten Netzhaut ermöglicht klopfte.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

19.1K Aufrufe.  Wayne State University School of Medicine. Eine Methode, bedingt Knockdown ein Zielprotein Ausdruck in der erwachsenen Zebrafisch Retina beschrieben, das geht intravitreal Injektion antisense Morpholinos und Elektroporation sie in der Netzhaut. Das resultierende Protein ist für mehrere Tage, die Prüfung des Proteins Rolle bei der Regeneration oder intakten Netzhaut ermöglicht klopfte.

Serie: In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with imaging techniques, genetic manipulation, and electrophysiological recording. Here we present a simple interphase tissue culture system for adult rabbit retina that requires no specialized equipment and very little maintenance. We demonstrate the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells. Rabbit retinas cultured this way can be kept alive for up to 6 days with very little changes of the overall anatomical structure or the morphology of individual ganglion- and amacrine cells.

This article demonstrates the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells.

Organotypischen Kultur der Adult Kaninchen Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

Forschung

Biologie

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

Single Cell Elektroporation in vivo innerhalb der intakten sich entwickelnde Gehirn

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Retro-Orbital-Injection in Adult Zebrafisch

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection von Organen aus dem Adult Zebrafisch

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Intraperitoneale Injektion in Adult Zebrafisch

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

Direkte Lieferung von MIF Morpholinos Into the Zebrafisch Otocyst durch Injektion und Elektroporation Beeinflusst Inner Ear Entwicklung

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Die Transplantation von Zellen direkt in die Niere von Adult Zebrafisch

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Präparation des Adult Zebrafisch Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in das Regenerations Adult Zebrafisch Leitwerk

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

In ovo Elektroporation in embryonalen Hühnchenretina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...