RAW Wünsche an die Mitglieder des Zon und Davidson Forschungslabors für ihre unzähligen Beiträgen zu helfen, Strategien, schrittweise diese Dissektionstechnik haben bei erwachsenen Zebrafisch geformt Laufe des letzten Jahrzehnts entwickeln danken. Darüber hinaus möchten wir unsere Dankbarkeit für die Mitarbeiter der Notre Dame-Zentrum für Zebrafisch Forschung für eine ausgezeichnete laufenden Tierhaltung Betreuung unserer Zebrafisch Kolonie auszudrücken. RAW sammelte Forschungsmittel aus dem NIH-NIDDK Zuschussvergabe DK083512 und großzügige Labor Anschubfinanzierung von der University of Notre Dame.

1. Dissection der erwachsenen Zebrafisch Niere von einer nicht fixierten Tier Probe <ol><li> Wählen Sie einen erwachsenen Zebrafisch zwischen 3-6 Monaten im Alter für die Präparation. </li><li> Euthanize die Fische, indem Sie sie in eine Schale mit 0,2% Tricaine pH 7,0 für ca. 4-5 Minuten und beobachtete sorgfältig, um zu sehen, dass die Kiemen bewegen und das Herz aufhört zu schlagen aufhören. </li><li> Mit einem Löffel, heben Sie den Fisch aus dem Tricaine Bad in eine kleine Menge der Lösung, giesst die Lösung und sanft Ort das Tier auf einem Papiertuch. </li><li> Mit einem scharfen Paar Dissektion Schere in den Kopf des Tieres zu entfernen, so dass ein Schnitt direkt hinter den Kiemen Operculum (Abb. 1, Weg A). Entsorgen Sie den Kopf in einer biohazard Abfallbehälter. </li><li> Verwenden Sie das Sezieren einer Schere, um den Körper des Tieres geöffnet, durch einen langen ventralen Inzision, beginnend mit dem Kopf und endet bei der Schwanz an der Basis der Schwanzflosse (Abb. 1, Weg B). </li><li> Entfernen Sie die inneren Organe des Tieres mit einem Paar Dissektion Pinzetten / Pinzette und lege sie in biohazard Abfall. Achten Sie darauf, die dorsale Körperwand Pinsel, da dies die Lage der Niere (Abbildung 2). Wenn Sie ein weiblicher Fisch ausgewählt haben, müssen Sie sich entwickelnden Eier Schaufel aus der Körperhöhle, die am leichtesten getan werden kann, mit einer abgewinkelten Pinzette oder einer Pinzette. </li><li> Verwenden Sie Dissektion Nadeln pin offenen Körper Wände zu einer Dissektion Tablett, und der Winkel der Pins so, dass die Niere visualisiert werden können. Die Niere wird besitzen eine charakteristische Form (Kopf, Rumpf / Sattel, Schwanz) und Farbe, die mit schwarz gefärbte Pigmentierung (Abbildung 2) durchsetzt. Möglicherweise finden Sie auch die Aorta mit dem peripheren Blut, die nach unten läuft der Mittellinie des Organs Struktur gefüllt. </li><li> Verwenden feinen Pinzette auf die Niere aus dem dorsalen Körperwand zu lösen, mit einer Pinzette auf die Niere heben Sie die Orgel aus dem Bindegewebe, die ihm zugrunde liegenden trennen. </li><li> Sanft legen Sie die Niere in das gewünschte Fahrzeug für weitere Studien an lebenden Zellen, wie ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 1x PBS für FACS Vorbereitung. </li></ol> 2. Vorbereitung und Präparation der erwachsenen Zebrafisch Niere von einer festen Tier Probe <ol><li> Bereiten Sie eine Lösung aus 4% paraformaldehyde/1X PBST. Kochen Sie die Lösung für die PFA in Lösung auflösen, dann die Mischung wird auf 4 ° C und 0,1% Dimethylsulfoxid. Wir haben den größten Erfolg mit Gewebe Bewahrung vor mit frisch zubereiteten PFA-Lösungen wie zum gefrorenen Aliquots entgegen. Machen Sie genügend Lösung tauchen erwachsenen Zebrafisch beim Präparieren. </li><li> Füllen Sie eine Dissektion Tablett mit genug Fixierung Lösung tauchen erwachsenen Zebrafisch während der Präparation. Wir führen die weiteren Schritte mit diesem Fach unter dem Mikroskop positioniert, die in einer chemischen Motorhaube platziert werden können, um die Exposition der Fixierung Gerüche vermieden werden. </li><li> Wählen Sie einen erwachsenen Zebrafisch zwischen 3-6 Monaten im Alter für die Präparation. </li><li> Euthanize die Fische, indem Sie sie in eine Schale mit 0,2% Tricaine pH 7,0 für ca. 5 Minuten und beobachtete sorgfältig, um zu sehen, dass die Kiemen und Herz aufhören zu schlagen. </li><li> Mit einem Löffel, heben Sie den Fisch aus dem Tricaine Bad in eine kleine Menge der Lösung, giesst die Lösung und sanft Ort das Tier auf einem Papiertuch. </li><li> Mit einem scharfen Paar Dissektion Schere in den Kopf des Tieres zu entfernen, so dass ein Schnitt direkt hinter den Kiemen Operculum (Abb. 1, Weg A). Entsorgen Sie den Kopf in einer biohazard Abfallbehälter, und sofort Platz das Tier in die PFA-haltigen Präparation Fach. </li><li> Verwenden Sie das Sezieren einer Schere, um den Körper des Tieres geöffnet, durch einen langen ventralen Inzision, beginnend mit dem Kopf und endet bei der Schwanz an der Basis der Schwanzflosse (Abb. 1, Weg B), und halten den Körper teilweise während der Überflutung das Verfahren. </li><li> Entfernen Sie die inneren Organe des Tieres mit einem Paar Dissektion Pinzetten / Pinzette und lege sie in biohazard Abfall. Achten Sie darauf, die dorsale Körperwand Pinsel, da dies die Lage der Niere (Abbildung 2). </li><li> Verwenden Sie Dissektion Nadeln pin offenen Körper Wände und Winkel die Stifte, so dass die Niere visualisiert werden können. Die Niere wird besitzen eine charakteristische Form (Kopf-, Sattel, Schwanz) und Farbe, die mit schwarz gefärbte Pigmentierung (Abbildung 2) durchsetzt. Möglicherweise finden Sie auch die Aorta mit dem peripheren Blut, die nach unten läuft der Mittellinie des Organs Struktur gefüllt. </li><li> Fix die Probe über Nacht, indem das Fach bei 4 ° C, wenn Sie bei der Organisation der gewünschten Proben fertig sind. </li><li> Am nächsten Tag, entfernen Sie die PFA-Lösung aus der Schublade und ersetzen mit 1x PBST. </li><li> Verwenden feinen Pinzette vorsichtig lösen die Niere aus dem dorsalen Körperwand, mit einer Pinzette auf die Niere heben Sie die Orgel aus dem Bindegewebe, die ihm zugrunde liegenden trennen. Das Nierengewebe wird weich und geschmeidig aus der DMSO in die Fixierlösung, die es ermöglichen, die gesamte Niere Orgel in einem Stück zu sezieren. </li><li> Verwenden Sie eine breiteBohrung Transfer-Pipette auf die Niere in ein Mikrozentrifugenröhrchen Platz. </li><li> Die Niere kann nun weiter bearbeitet werden, um histologische oder whole mount in situ Genexpression Studien über die gewünschte Studie basiert befragen. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: Die Schritte, die in Abbildung 1 schematisch dargestellt sind, zeigen die Zerlegung Verfahren. Die Niere kann anhand ihrer charakteristischen Form und Färbung, und anatomische Lage an der dorsalen Wand des Tieres Körperhöhle identifiziert werden, wie in Abbildung 2 dargestellt. Nach der Präparation einer festen Nieren Probe whole mount in situ Hybridisierung kann zur Lokalisierung der Expression eines Gens von Interesse sein, wie in Abbildung 3 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1: Verfahren, die einen direkten Zugang zum Präparieren der Zebrafisch erwachsenen Nieren ermöglicht. (A) eingeschläfert Zebrafisch ist in schrittweise zerlegt (durch Zahlen und Pfeile), um den Forscher am einfachsten Zugriff auf die komplette Niere Organ. Bilder von der Bauchhöhle vor (B) und nach (C) Entfernung der Bauchorgane. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2:. Visualisierung der Zebrafisch-Niere in einer nicht fixierten Probe Nach Entnahme von Organen in der Leibeshöhle, erscheint die Niere als eine einzelne, abgeflachte Organ, das Anhänger der dorsalen Körperwand über Bindegewebe (A) ist, und wurde schematisiert (B) an ihre anatomische Form zu zeigen. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3: Whole mount in situ Hybridisierung auf dem gesamten erwachsenen Nieren-Orgel durchgeführt. (A) cadherin17 Transkripte sind in den Tubulus der erwachsenen Nieren Nephrone erkannt, vergrößert in (A &#39;). (B) mafba Transkripte proximalen Nephron Zelltypen in der adulten Niere (zu vergleichen, um ganze Tubulus in Panel A) lokalisiert sind. (B&#39; ) Eine vergrößerte Ansicht mafba Ausdruck zeigt, dass Transkripte sind speziell auf die Podozyten (P) Zellen des Blutes Filter (Glomerulus) und proximalen Tubulus (PCT) lokalisiert.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Adulte Stammzellen sind dynamisch und wesentliche Komponenten, die den erwachsenen Körper Form 1 aufrecht zu erhalten. Adulte Stammzellen können auch dazu dienen, Schäden entgegenwirken, die den Körper entstehen während der Erkrankungen und der Dysfunktion oder Verlust von adulten Stammzellen, um den Rückgang der Organfunktion führen und hat in Verbindung gebracht, um Krebs Malignome fahren und tragen zur Alterung. Adulte Stammzellen weisen zelluläre Eigenschaften, die sie von differenzierten Zelltypen unterscheiden. Bei der Zellteilung werden adulte Stammzellen in der Lage sich selbst zu erneuern und die Produktion von Vorläuferzellen, die wiederum Anlass zu verschiedenen differenzierten Nachkommen geben können. Es besteht ein großes Interesse für das Verständnis der Signalwege, die die Zelle Schicksal Entscheidungen und Wirksamkeit von adulten Stammzellen aufgrund ihrer wichtigen Rolle in Gewebshomöostase 1 zu regeln. Zum Beispiel sind viele Wissenschaftler, die derzeit versuchen, die Signale, die verschiedene erwachsenen Stammzell-Populationen in ihrer Nische, oder spezielle Mikroumgebung, und wie diese Nische wird durch humorale Faktoren beeinflusst halten zu identifizieren. Adult hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) sind pluripotente Zellen, die Kraftstoff die kontinuierliche Verjüngung der Blutkörperchen bei Tieren 8. Hämatopoese ist eine lebendige Prozess, der ständig laufende während der Lebensdauer eines Wirbeltier-Organismus, weil die reifen differenzierten Blut Zelltypen kurzlebig sind und müssen daher regelmäßig erneuert werden. Als sie sich teilen, Versorgung HSCs dieser entscheidenden Nachfrage durch Selbst-Erneuerung und Herstellung einer Reihe von Vorläufern, die Anlass zu der erythroiden, Megakaryozyten, lymphoiden und myeloischen Linien. Jede dieser Blut Zelltypen führt einzigartige Funktionen in den Kreislauf, einschließlich der Bereitstellung der Gasaustausch im Gewebe, so zum Abdichten von Verletzungen der Blutgefäße durch die Bildung von Blutgerinnseln oder Abwehrmechanismen gegen eindringende Krankheitserreger. Während HSCs seit vielen Jahren erkannt haben, bleiben eine Fülle von faszinierenden Fragen offen über diese faszinierenden Zellen. Jüngste Studien haben Unterklassen von HSK mit verschiedenen langfristigen Selbst-Erneuerung Eigenschaften und die Aufklärung der Nische Komponenten und signalisiert, dass HSC Verhalten modulieren 8 identifiziert. Der Zebrafisch gehört heute zu den Eckpfeilern der Hämatopoese Forschung Paradigmen, basierend auf der genetischen und molekularen Eigenschaften von diesem Tiermodell 8. Forschung unter Verwendung der Zebrafisch hat zu neuen Einsichten über HSC Biologie, die mit höheren Wirbeltiere wie Säuger konserviert sind, betonen die biomedizinischer Relevanz von Fisch Blutuntersuchungen 8 geführt. Historisch gesehen hat das Wissen über HSCs ebnete den Weg für die Expeditionen versucht, herauszufinden, ob andere Körperorgane durch adulte Stammzellen beibehalten werden. Zahlreiche erwachsenen Stammzell-Populationen sind jetzt geschätzt auf zu existieren, reicht über verschiedene Strukturen aus dem Gehirn in den Darm, Haut und Skelettmuskulatur. Fortsetzung der Bemühungen in der Stammzell-Bereich suchen, um herauszufinden, wie adulte Stammzellen oder sogar andere differenzierte Zelltypen können verbesserte Wirksamkeit in verschiedenen Einstellungen anzuzeigen. Im Hinblick auf die Niere, hat es große Debatten unter Nephrologen, ob Nieren-Stammzellen 16 vorliegen worden. Unabhängige Erkenntnisse haben Populationen von Nierenzellen in Säugetieren, die in unterschiedlichem Maße von regenerativen Potential besitzen dokumentiert, aber ein zusammenhängendes Verständnis dieser Berichte ist noch nicht erreicht werden. Interessanterweise gibt es starke Hinweise auf die Vorstellung, dass viele Fischarten Zellen, die robust Kraftstoff Regeneration geschädigter Nephrone können sowie wachsen völlig neue Nephrone im Erwachsenenalter 9 besitzen unterstützen. Neuere Arbeiten haben die molekulare Kennzeichen der erwachsenen Nieren-Stammzellen in der Zebrafisch 10,11 identifiziert, und demonstrierte die Selbst-Erneuerung Potenz dieser sogenannten renalen Stammzellen / Vorläuferzellen (RPCs) 11. Zukünftige Studien sind notwendig, um festzustellen, ob analog Nierenzellen in Säugern sind. Dennoch kann weiterhin Untersuchungen über die zellulären und molekularen Mechanismen, die Fische RPCs regulieren Einblick in die regenerative Leistungen können in der Säugetierniere stimuliert werden können. Es ist offensichtlich, dass noch viel über RPCs verstanden werden, und dass die vielen Tools nun auch für die Zebrafisch-Forscher kann implementiert, um diese faszinierenden Fragen anzugehen. In diesem Protokoll, beschreiben wir unsere Methode zur anatomischen Identifizierung und Präparation des erwachsenen Zebrafisch Niere. Alternative Schritte können verwendet werden, um die Nieren, wie das Öffnen der Bauchhöhle mit einer ventralen Schnitt mit einer Schere zerschneiden Dissektion werden, aber wir haben den größten Erfolg beim Zugriff auf die gesamte Niere, wenn die Bauchdecke wird merken offen und der Kopf wird entfernt angetroffen. Blut und Nieren Wissenschaftler gleichermaßen, zu isolieren und mit diesen Zelltypen arbeiten möchten, können Sie entweder Dissektion Methode. Es sollte angemerkt werden, dass die Methode, die wir beschreiben, für die Isolierung und working mit dem Zebrafisch erwachsenen Nieren ist sicherlich nicht an Wissenschaftler, die zu Fragen der Erwachsenenbildung Stammzellbiologie zu verfolgen, als das Sezieren von diesem Organ können die Untersuchungen über die Forscher weitere Untersuchungen zu Themen wie Physiologie der Alterung zu erleichtern möchten begrenzt. Darüber hinaus kann diese Methode mit anderen Technologien wie Transgenik gekoppelt werden, um so molekular-Label und dann zu reinigen und zu studieren diskreten Subpopulationen von Blut oder Nierenzellen aus Wildtyp-und genetisch mutierte Zebrafische 11. Wir freuen uns, derart detaillierte Reinigungsverfahren von Stamm-und Vorläuferzellen Zelltypen ist von entscheidender Bedeutung, um zu gewinnen Wissen darüber, wie ihr Verhalten reguliert wird, als operative Tests wie Transplantation oder Vorläuferzellen Kultivierung der Grundlage bilden, durch die die Wirksamkeit und die Identität dieser Zellen ist definiert. Jüngste Fortschritte in der hämatopoetischen Vorläuferzellen Kultur Methoden öffnen viele neue Wege für die Studie und kann zu Kultivierung der Nierenfunktion Bevölkerung 17 angepasst werden. Zebrafisch chemische Genetik wurden bei der Ermittlung von Wegen, die HSZ-und Nierenfunktion Vorfahren in verschiedenen Kontexten 18-20 modulieren, und wird auch weiterhin eine sinnvolle Möglichkeit, die im Kombination mit den oben zellbiologischen Techniken Test erfolgreich zu sein. Zusammengenommen gibt es eine Reihe von bahnbrechenden Beiträge auf den Gebieten der Hämatologie und Nephrologie mit dem Zebrafisch-Modell gewesen, und die weitere Forschung in diesen Arenen Versprechungen zu führen weitere transformative Einblicke in den kommenden Jahren.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Dissection Schere </td><td> Roboz </td><td> RS-5882 </td></tr><tr><td> Dissektionszangen </td><td> Roboz </td><td> RS-5010 </td></tr><tr><td> Dissection abgewinkelten Pinzette </td><td> Roboz </td><td> RS-5058 </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Sigma </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Electron Microscopy Dienstleistungen </td><td> 19210 </td></tr></tbody></table>

dissection of the adult zebrafish kidney

Die Forscher arbeiten in dem aufstrebenden Gebiet der adulten Stammzellen Biologie versuchen, die Signale, die das Verhalten und die Funktion von Stammzellen während der normalen Homöostase und Krankheit Staaten regeln zu verstehen. Das Verständnis von adulten Stammzellen hat breite reichende Folgen für die Zukunft der Regenerativen Medizin 1. Zum Beispiel kann ein besseres Wissen über adulte Stammzellen Zellbiologie erleichtern die Gestaltung der therapeutischen Strategien in welchen Organen ausgelöst werden, um sich selbst oder auch die Schaffung von Verfahren für den Anbau von Organen in vitro, die in Menschen 1 transplantiert werden können heilen. Der Zebrafisch hat sich zu einem leistungsstarken Tiermodell für die Untersuchung von Wirbeltieren Zellbiologie 2. Es hat eine umfangreiche Dokumentation und Analyse der embryonalen Entwicklung im Zebrafisch 3 wurde. Erst vor kurzem haben Wissenschaftler versucht, erwachsene Anatomie und chirurgische Dissektion Techniken 4-Dokument, da es eine progressive Bewegung innerhalb der Zebrafisch-Community, um die Anwendungen dieser Forschung Organismus Studien mit Erwachsenen zu erweitern wurde. Zum Beispiel gibt es den Ausbau Interessen bei der Nutzung Zebrafische, um die Biologie von adulten Stammzell-Populationen zu untersuchen und anspruchsvollen Erwachsenen-Modelle von Krankheiten wie Krebs 5. Historisch gesehen hat die Isolierung des Zebrafisch erwachsenen Nieren wurden für die Untersuchung Hämatopoese instrumental, als die Niere der anatomischen Lage der Blutkörperchen in Fischen 6,7 ist. Die Niere ist von Nephron Funktionseinheiten in arborized Regelungen gefunden, um hämatopoetische Gewebe, das in den Zwischenräumen verteilt ist umgeben sind. Die hämatopoetischen Komponente besteht aus hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) und ihre Nachkommen, dass die Niere leben, bis sie unheilbar unterscheiden 8. Darüber hinaus ist es nun klar, dass eine Gruppe von renaler Stamm / Vorläuferzellen (RPCs) bewohnen auch der Zebrafisch Nieren Orgel und ermöglichen sowohl Nieren-Erneuerung und Wachstum, wie in anderen Fischarten 9-11 beobachtet. Im Lichte dieser neuen Entdeckung ist die Zebrafisch-Niere ein Organ, dass der Standort von zwei spannende Möglichkeiten für adulte Stammzellen Zellbiologie Studien Häuser. Es ist klar, dass viele offene Fragen und konnte mit diesem experimentellen System bedient werden. Zur Förderung Expansion auf diesem Gebiet, ist es von Vorteil, um detaillierte Methoden der Sichtbarmachung Dokument und dann die Isolierung des erwachsenen Zebrafisch Niere Organ. Dieses Protokoll Einzelheiten unseres Verfahrens zur Dissektion der erwachsenen Nieren von beiden fixierten und fest Tieren. Dissection der Niere Organ kann zur Isolierung und Charakterisierung von hämatopoetischen und renalen Stammzellen und ihren Nachkommen mit etablierten Techniken wie Histologie, Fluoreszenz-activated cell sorting (FACS) 11,12, expression profiling 13,14 und 11,15 Transplantation werden. Wir hoffen, dass die Verbreitung dieses Protokolls werden die Forscher mit dem Wissen, dass die breitere Verwendung von Zebrafisch-Studien, die letztlich für die Anwendung beim Menschen übersetzt werden kann umzusetzen.

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Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Der Zebrafisch Niere ist die Heimat sowohl Nieren-und blutbildenden adulten Stammzellen / Vorläuferzellen, und stellt eine hervorragende Gelegenheit, diese Zelltypen und ihre Nachkommen in einem Wirbeltier Modell-Organismus zu studieren. Hier zeigen wir eine detaillierte Analyse Verfahren, dass der Forscher ermöglicht zu erkennen und operativ zu entfernen, die erwachsenen Zebrafisch Niere, die für Anwendungen wie Zellisolation, Transplantationsmedizin und Expressionsstudien von Nieren-und / oder Blut Zellpopulationen verwendet werden können.

Präparation des Adult Zebrafisch Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Research

JoVE Journal

Biology

36.5K Aufrufe.  University of Notre Dame. Der Zebrafisch Niere ist die Heimat sowohl Nieren-und blutbildenden adulten Stammzellen / Vorläuferzellen, und stellt eine hervorragende Gelegenheit, diese Zelltypen und ihre Nachkommen in einem Wirbeltier Modell-Organismus zu studieren. Hier zeigen wir eine detaillierte Analyse Verfahren, dass der Forscher ermöglicht zu erkennen und operativ zu entfernen, die erwachsenen Zebrafisch Niere, die für Anwendungen wie Zellisolation, Transplantationsmedizin und Expressionsst...

Serie: Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Die Transplantation von Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafisch

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Forschung

Biologie

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Gross und Fine Dissection of Inner Ear Sinnesepithelien in Adult Zebrafisch ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection von Organen aus dem Adult Zebrafisch

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Intraperitoneale Injektion in Adult Zebrafisch

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Die Transplantation von Zellen direkt in die Niere von Adult Zebrafisch

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

Herz Dissection in Larven, juvenile und adulte Zebrafisch, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in das Regenerations Adult Zebrafisch Leitwerk

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging Adult Zebrafisch

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Analyse der Nephron Zusammensetzung und Funktion im erwachsenen Zebrafisch Nieren

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...