Diese Studie wurde von Juvenile Diabetes Research Foundation zu gewähren 5-2007-97 (zum VEP), National Institute of Diabetes and Digestive und Nierenkrankheiten unterstützt gewährt R01DK064973 (zum VEP), R01DK48494 (bis LHP), T32DK07074 (unterstützt SCE), K01DK083552 (zu MDK) und durch P60DK20595 an die University of Chicago Diabetes Research and Training Center. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung der NIDDK oder die NIH.

1. Pre-Injektion Vorbereitungen <ol><li> Schnell den Fisch für mindestens 24 Stunden vor der Injektion. Dies wird der Darm leer Glühlampe (Magen) Inhalt. Die grundlegende Fasten-Protokoll ist, um die Fische zu übertragen, um ihre normale Dichte, um einen sauberen Tank, dann zurückzuhalten Essen. Für längerfristige Fasten, dass strengere Bedingungen erfordert (z. B. für Blutzucker-Studien), siehe zusätzliche Überlegungen in die Diskussion. </li><li> Bereiten Cortland Salzlösung (Perry et al., 1984). Für eine 100 ml Volumen, lösen sich die folgenden in destilliertem Wasser: 725 mg NaCl (124,1 mM) 38 mg KCl (5,1 mM) 41 mg Na 2 HPO 4 (2,9 mm) 24 mg MgSO 4 ∙ 7H 2 O (1,9 mm) 16 mg CaCl 2 ∙ 2H 2 O (1,4 mM) 100 mg NaHCO 3 (11,9 mm) 4 g Polyvinylpyrrolidon (PVP) (4%) 1.000 USP Einheiten Heparin Filter, sterilisieren und bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie das Mikroskop. <ul><li> Decken Sie die Mikroskop-Basis mit Plastikfolie zum Schutz im Falle von Leckagen. </li><li> Legen Sie ein Papiertuch auf der Oberseite des Plastikverpackung. Der OP-Tisch wird auf der Oberseite des Papiertuch zu sitzen. </li><li> Pre-adjust konzentrieren, indem Sie die OP-Tisch und die Konzentration auf den Schwamm. </li></ul> Tipp: Legen Sie Ihren Finger auf dem Schwamm und konzentrieren sich auf die. Dies wird zu beseitigen oder zu minimieren weiterer Schwerpunkt Einstellung, wenn der Fisch auf dem OP-Tisch. </li><li> Wiegen der Fische. <ul><li> Füllen Sie ein 500 mL Becherglas etwa 1 / 3 voll mit Fisch Betriebswasser. </li><li> Tarieren. </li><li> Sammeln Sie die Fische mit einem Netz. Wick überschüssige Wasser weg aus dem Netz und Fisch durch kurzes Betupfen das Netz auf Papierhandtücher. Übertragen Sie die Fische in das Becherglas. </li><li> Wiegen der Fische. </li><li> Übertragen Sie die Fische, um eine saubere Tank. </li><li> Übertragen Sie jede wog Fisch seine eigene Bezeichnung Tank. </li><li> Berechnen Sie das Injektionsvolumen für jeden Fisch auf Fisch Gewicht. </li></ul></li><li> Bereiten Sie die Spritze und verwandte Injektionsmaterial. Für die Injektion, empfehlen wir eine 35G abgeschrägte Stahlnadel und einem 10 ul Nanofil Mikrospritze. Bereiten Sie die Nanofil Spritze und Schlauch Silflex folgenden Anweisungen des Herstellers. Es ist wichtig, keine Blasen aus der Spritze und Schlauch entfernen. Nach dem Befüllen der Spritze und Schlauch, montieren Sie die Spritze an der Pumpe, und das Programm das Injektionsvolumen für die ersten Fische. </li><li> Bereiten Sie den OP-Tisch. <ul><li> Schneiden Sie einen weichen Schwamm (z. B. # L800-D, Jaece Industries), so dass es ungefähr 20 mm in der Höhe ist. Auf dem flachen Gesicht, machen einen Schnitt, 10-15 mm tief ist. Dieser Schnitt wird der Trog, dass der Fisch für die Injektion hält. </li><li> Setzen Sie den Schwamm in eine 60 mm Petrischale. </li><li> Stellen Sie die Petrischale mit Schwamm in einen angemessen dimensionierten Pipettenspitze box Deckel. Der Deckel muss groß genug sein, um Wasser zu halten, um zur Erhaltung der Schwamm Temperatur, aber es sollte flach genug, um nicht in die Quere kommen. Wir verwenden einen Deckel von einem P200 Spitze Box, 11,4 cm L x 7,7 cm B x 1,5 cm ist D. </li></ul> Diese drei Elemente zusammen (Schwamm in Petrischale in Feld Deckel) montiert bilden den OP-Tisch. </li><li> Bereiten Sie die Narkose. <ul><li> Machen Sie mit crushed ice cubes aus Fisch-Anlage Wasser. </li></ul> Tipp: Mit typischen Eiswürfelbehälter, wird es 3 Fächer nehmen zu 10-12 Fische zu betäuben. <ul><li> Füllen Sie ein sauberes Eiskübel mit zerstoßenem Eis. </li><li> Setzen Sie den OP-Tisch in einen größeren Behälter wie ein 2,4-Liter-Rubbermaid Lebensmittel Vorratsbehälter. </li><li> Gießen Sie etwas Wasser Anlage (warm) in den äußeren Behälter und dem OP-Tisch. Halten Sie eine Reserve von warmen Anlage Wasser in der Nähe. </li><li> Legen Sie ein Thermometer in den äußeren Behälter. </li></ul></li></ol> 2. Anästhesie, Injection und Recovery <ol><li> Legen Sie die Betäubung äußeren Behälters plus OP-Tisch neben dem Mikroskop. Haben die Eimer mit Eis-Chips in der Nähe. </li><li> Bringen Sie die Wassertemperatur auf 17 ° C durch Zugabe von Eis-Chips. Wichtig: Nicht unter 17 ° C gehen für diesen Schritt. </li><li> Verwenden Sie ein Netz, um die Fische zu den äußeren Container übertragen. </li><li> Langsam Eis-Chips auf den Behälter, um die Temperatur zu senken, um 12 ° C im Laufe von mehreren Minuten. </li><li> Monitor Fisch Verhalten: Bei 17 ° C oder etwas tiefer, die Fische in der Regel seine Brustflossen horizontal ausbreiten, Keuchen, und haben eine schnelle Operculum Bewegungen. Als die Temperatur sinkt, wird der Fisch langsamer und schließlich schwimmen stoppen Schwimmen. Da die chirurgische Ebene der Narkose kam, wird keuchend zu stoppen und Operculum Bewegungen werden langsamer. Der Fisch ist fertig für die Injektion, wenn sie nicht reagieren, mit denen umgegangen wird. Für die meisten Fische, 12 ° C ausreichend ist. Größere Fische erfordern kälter water. </li><li> Da die erforderliche Temperatur (~ 12 ° C oder kälter), drücken Sie auf den Schwamm, um es zu sättigen erreicht. </li><li> Halten Sie Ihre Finger in das kalte Wasser ausreichend, so dass sie sich nicht erwärmen die Fische und bringen sie aus der Narkose während der Handhabung. </li><li> Mit kalten Fingern sanft Transfer der Fische in den Trog des Schwammes. Positionieren Sie den Fisch mit dem Bauch nach oben und die Kiemen in den Trog. </li><li> Schnelle Übertragung der OP-Tisch mit dem Mikroskop Bühne. </li><li> Arbeiten schnell, vorsichtig die Nadel in der Mittellinie zwischen den Bauchflossen. Die Nadel sollte kranial Punkt und näher an den Beckengürtel als den Anus eingeführt werden. Sie sollten in der Lage zu fühlen, wenn die Nadel tief ist, um den Körper Wand. Spritzen Sie das entsprechende Volumen und ziehen Sie die Nadel. </li><li> Nach der Injektion sofort in den Fisch wieder in die Warm-Wasser (~ 28,5 ° C) Tank für die Verwertung durch die Freigabe der Fisch aus dem Schwamm über dem Tank Wasser. Tipp: Wenn der Fisch nicht beginnen Schwimmen sofort, ihm helfen, indem Sie vorsichtig wirbelnde Wasser zu den Kiemen zu erholen. </li><li> Überprüfen Sie die Nadel. Gelegentlich einer Skala können beigefügt werden und sollten vor der nächsten Injektion entfernt werden. </li><li> Für nachfolgende Injektionen, mit warmem Wasser Anlage zur Betäubung Kammer Wassertemperatur wieder zu erhöhen, um 17 ° C vor der Einführung der nächsten Fisch. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2126/2126fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Repräsentative Ergebnisse nach intraperitonealer Injektion von 0,5 mg / g Glucose oder Fahrzeug. Die Fische wurden für 72 Stunden vor der Injektion gefastet. Die x-Achse zeigt die Zeit, nach der Injektion. Mittelwert ± SEM.

<ol>
	<li>Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G., Hoar, W. S., Randall, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+methods+for+the+study+of+gill+physiology.">Perfusion methods for the study of gill physiology.</a> Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water. , 325-388 (1984).</li><li>Brown, L. A., Stoskopf, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+restraint.">Anesthesia and restraint.</a> Fish Medicine. , 79-90 (1993).</li><li>Eames, S. C., Philipson, L., Prince, V. E., Kinkel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+sugar+measurement+in+zebrafish+reveals+dynamics+of+glucose+homeostastis.">Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostastis.</a> Zebrafish. 7, 205-213 (2010).</li><li>Chavin, W., Young, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+in+the+determination+of+normal+serum+glucose+levels+of+goldfish+Carassius+auratus+L.">Factors in the determination of normal serum glucose levels of goldfish Carassius auratus L.</a> Comp Biochem Physiol. 33, 629-653 (1970).</li><li>Groff, J. M., Zinkl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematology+and+clinical+chemistry+of+cyprinid+fish.+Common+carp+and+goldfish.">Hematology and clinical chemistry of cyprinid fish. Common carp and goldfish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2, 741-776 (1999).</li><li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+and+raising+zebrafish.">Keeping and raising zebrafish.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , 7-37 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (1995).</li><li>Iwama, G. K., Ackerman, P. A., Hochachka, P. W., Mommsen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetics.">Anaesthetics.</a> Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Volume 3: Analytical Techniques. , 1-15 (1994).</li><li>Reavill, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+diagnostic+and+clinical+techniques+for+fish.">Common diagnostic and clinical techniques for fish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9, 223-235 (2006).</li><li>Stoskopf, M. K., Stoskopf, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery.">Surgery.</a> Fish Medicine. , 91-97 (1993).</li></ol>

Intraperitoneale Injektion erfolgt in fünf Schritten: Fasten, Wäge-, Anästhesie, Einspritzung und Erholung. Für jeden Schritt gibt es Best Practices, die den Erfolg sicherstellen können. Success beinhaltet eine gesunde Fische Patienten sowie eine gute experimentelle Ergebnis. Fasten: Ein 24-stündigem Fasten sollte der Darm leer Glühbirne. Diese Praxis ist aus dem Fisch veterinärmedizinischen Literatur (zB Brown 1993) übernommen. Zusätzliche Fasten Überlegungen werden im Folgenden erörtert. Längerfristige Fasten: Wir haben festgestellt, dass ein 72-stündigem Fasten erforderlich ist, um den Blutzucker zu einem Basisniveau vor der Injektion zu verringern (Eames et al, 2010.). Wir haben auch festgestellt, dass für die Glucose-Studien gibt es mehrere Verfahren, die erforderlich sind, um sicherzustellen, dass die Fische richtig gefastet werden. Beginnen Sie mit einem sauberen Behälter (kein Schmutz auf der Unterseite). Tanks sollten offline, klar als &quot;Fasten&quot; bezeichnet und in einem Ort, wo begeisterte Fisch Pflegepersonal nicht zu füttern. Beurteilen Sie die äußere Umgebung des Tanks und Schritte unternehmen, um den Fisch ins von Störungen betonte verhindern, denn Stress ist bekannt, Blutzucker (Chavin und Young, 1970.; Groff et al, 1999) zu erhöhen. Zum Beispiel hatten wir ein Fasten Experiment, in dem ein Radio täglich auf der Bank, die halten den Fischbecken wurde betrieben wurde. Wir fanden, dass Blutzucker war ungewöhnlich hoch und festgestellt, dass die Fische durch die Vibrationen wurden betont. Ein weiterer Stressfaktor ist Überbelegung. Fische sollten in einer Dichte, die mit guten Fisch Tierhaltung entspricht gehalten werden. Für Empfehlungen, siehe Brand et al. (2002) und Westerfield (1995). Wir haben gute Ergebnisse Fasten unsere Fische bei einer Dichte von 10-12 Fische in einem 9-Liter-Tank (mit 3 Schichten von Marmor nimmt einige dieser Lautstärke) hatte. Die Trennung der Geschlechter kann Stress verursachen, so dass wir empfehlen, einen Mixed-sex Bevölkerung während des Fastens. Dies bedeutet, dass Eier gelegt werden können, und die Eier müssen abgesondert, so dass sie nicht gegessen werden. Ein einfacher Weg, um Eier absondern zu den Tankboden mit 2-3 Lagen von Kugeln zu decken. Die Wasserqualität muss durch die Beseitigung Eier und Abfall und durch den Austausch etwa 10-15% des Beckenwassers, täglich gepflegt werden. Zum Entfernen von Eiern und Abfall, Siphon funktioniert gut. Wiegen: Bei der Abwägung Fische, die nicht betäubt, sollte darauf geachtet werden, um Wasser zu übertragen aus dem Netz zu minimieren und in das Becherglas, um genaue Gewicht zu gewährleisten. Wenn das Netz (mit Fisch) auf Küchenpapier abgetupft wird, kann die Mehrheit der überschüssiges Wasser entfernt werden, und das Gewicht genau gemessen werden kann. Es kann einfacher sein, um die Fische vor dem Wiegen zu betäuben, aber wir haben nicht die möglichen Auswirkungen der Anästhesie ein Fisch zweimal an einem Tag getestet. Wir haben unsere Technik durch Wiegen der Fische zuerst mit dem Netting / Blot-Methode und dann wieder den Fisch wiegt, nachdem es wurde betäubt getestet und sanft trocken getupft. Wir fanden keinen signifikanten Unterschied im Gewicht zwischen den Methoden (P = 0,7927, t-Test). Darüber hinaus haben wir getestet, ob das Netzwerk / Blotting-Verfahren betroffen Blutzucker im Vergleich zu lediglich die Übertragung der Fische in den Becher so schnell wie es saldiert (kein Löschpapier). Wir fanden keinen signifikanten Unterschied in Blutzuckerspiegel zwischen den beiden Methoden der Übertragung (P = 0,2241, t-Test). Betäubende: Chemische Anästhesie kann für viele Studien. Hier haben wir kaltes Wasser Anästhesie als Alternative gezeigt, weil viele Anästhetika (einschließlich tricaine/MS-222 (Brown, 1993)), den Blutzuckerspiegel erhöhen. In früheren Studien haben wir festgestellt, dass kaltes Wasser nicht den Blutzuckerspiegel erhöhen im Zebrafisch (Eames et al., 2010). Für Kaltwasser Anästhesie, sollte die Temperatur langsam gesenkt werden. Die Rate der Abnahme scheint sich auf die Größe des Fisches ab, wobei kleinere Fische gehen unter schneller als größere Fische. Nach der Injektion, können Sie beobachten, dass der Fisch ist zu langsam erholt sich von der Narkose (siehe unten). Dies kann auftreten, wenn entweder die Starttemperatur zu niedrig ist, oder wenn die Temperatur zu schnell abnimmt. Der Ausgangspunkt ist zu niedrig, wenn die Fische Kurven seitlich beim Betreten des Wassers. Wenn die Starttemperatur korrekt ist, wird der Fisch aus dem Gleichgewicht zunächst aufrecht zu erhalten. Sie wird ihre Brustflossen in eine horizontale Position drehen, Keuchen, und haben eine schnelle Operculum Bewegungen. In der Regel wird es schwimmen. Da die Temperatur abnimmt, wird Bewegungen zu verringern und die Fische werden das Gleichgewicht zu verlieren. Ein chirurgischer Ebene der Anästhesie ist erreicht, wenn die Fische ohne Reaktion behandelt werden kann. Um die Fische unter Narkose, müssen Sie Ihre Finger kalt werden, so halten sie in dem Wasser vor dem Umgang mit dem Fisch. Der Schwamm muss auch kalt gehalten werden bei der gleichen Temperatur wie das Wasser für die Betäubung der Fische benutzt. Es ist wichtig, um den Schwamm mit Wasser, das sufficie ist gesättigtntly kalt Narkose zu halten, wenn die Fische auf sie gelegt wird. Injection: Vor der Durchführung von Injektionen, möchten Sie vielleicht wenigstens ein Fisch sezieren, um ein Gefühl für Körper Wandstärke bekommen. Dies kann Ihnen helfen zu beurteilen, wie weit die Nadel muss einfügen, um die Bauchhöhle gelangen. Darüber, wie man die Nadel legen, können Sie sich die Wand des Körpers &quot;geben&quot;, wenn die Nadel in die Bauchhöhle. Während der Injektion Schritte, damit die Patienten zufrieden. Achten Sie darauf, den Schwamm mit der richtigen Temperatur kaltes Wasser gesättigt ist, um die Fische aus Wiederbelebung während der Injektion zu verhindern. Ein gut gesättigt und weichen Schwamm ist zur Minimierung der Schäden an der Waage und Schleim Abdeckung der Haut wichtig. Ein gut gesättigten Schwamm ist auch für die Führung der Kiemen belüftet wichtig. Wir empfehlen den Schaum Schwamm unten unter Materialien aufgeführt. Schließlich, sobald der Fisch betäubt, schnell zu arbeiten, um die Zeit, dass die Fische unter sich zu minimieren. Recovery: Die Fische sollten aus der Narkose praktisch beim Eintritt in die warme Beckenwasser zu erholen. Wenn der Fisch beginnt nicht schwimmen sofort vorsichtig schwenken, das Wasser zu den Kiemen zur Erholung beschleunigen. Wenn die Wiederherstellung langsam ist, dann den Fisch ging unter viel zu schnell und Sie sollten die Anästhesieverfahren entsprechend anpassen. Die möglichen Ursachen für die langsame Erholung sind unter Betäubung diskutiert.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Foam Sponge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jaece Industries</td>
<td>L800-D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 mm Petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipet tip box lid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>not too deep, e.g. 1.5 cm</td>
</tr>
<tr>
<td>Plastic storage container</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>deep, e.g. 7 cm </td>
</tr>
<tr>
<td>Thermometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Crushed ice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>made from facility water</td>
</tr>
<tr>
<td>Warm facility water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1 liter or more</td>
</tr>
<tr>
<td>500 ml beaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>for weighing</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoFil syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
<td>NANOFIL</td>
<td>or Hamilton syringe</td>
</tr>
<tr>
<td>35 gauge needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>NF35BV-2</td>
<td>beveled</td>
</tr>
<tr>
<td>Silflex tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>SILFLEX-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraMicroPump III and Micro4 controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>UMPS-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foot switch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>15867</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic wrap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paper towels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cortland salt solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

intraperitoneal injection into adult zebrafish

Ein praktisches Verfahren zur chemischen Behandlung von Zebrafisch ist das Reagens in den Tank Wasser, wo sie von den Fischen genommen wird eingeführt. Allerdings macht diese Methode ist es schwierig zu wissen, wie viel Reagenz absorbiert wird oder bis pro Fisch entnommen. Einige experimentelle Fragen, insbesondere im Zusammenhang mit metabolischen Studien kann besser durch die Bereitstellung einer definierten Menge zu jedem Fisch, auf das Gewicht angesprochen werden. Hier präsentieren wir eine Methode für die intraperitoneale (ip) Injektion in das Erwachsenenleben Zebrafisch. Injection in die Bauchhöhle, hinter dem Beckengürtel. Dieses Verfahren wird von veterinärmedizinischen Methoden für größere Fische abgestimmt sind. Es ist sicher, wie wir Null-Mortalität beobachtet haben. Zusätzlich haben wir gesehen, Blutungen an der Injektionsstelle in nur 5 von 127 Injektionen, und in jedem dieser Fälle die Blutung war kurz, mehrere Sekunden dauert, und die Menge Blut verloren war klein. Erfolg mit diesem Verfahren erfordert schonende Behandlung der Fische in mehreren Schritten einschließlich Fasten, Wäge-, Anästhesie, Einspritzung und Erholung. Vorsichtsmaßnahmen sind erforderlich, um Stress während des gesamten Verfahrens zu minimieren. Unsere Vorsichtsmaßnahmen gehören mit einem kleinen Injektionsvolumen und eine 35G Nadel. Wir verwenden Cortland Salzlösung als das Fahrzeug, das osmotisch für Süßwasserfische ist ausgewogen. Die Belüftung der Kiemen während der Injektion durch erste bringt die Fische in eine chirurgische Ebene der Anästhesie, die langsamen Bewegungen Operculum erlaubt gehalten, und zweitens, indem die Fische in einer Wanne in einem mit Wasser gesättigten Schwamm während der Injektion selber. Wir demonstrieren den Nutzen von IP Injektion durch die Injektion von Glucose und Überwachung der Anstieg des Blutzuckerspiegels und die anschließende Rückkehr zur Normalität. Wie Stress ist bekannt, dass Blutzucker in Knochenfische erhöhen, vergleichen wir den Blutzuckerspiegel in Fahrzeug-Injektion und nicht gespritzt Erwachsene und zeigen, dass das Verfahren nicht zu einem signifikanten Anstieg des Blutzuckerspiegels.

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Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Wir zeigen, intraperitoneale Injektion in das Erwachsenenleben Zebrafisch. Wir verwenden eine 10 ul Nanofil Mikrospritze durch eine Micro4 Controller und UltraMicroPump III geregelt. Diese Demonstration umfasst den Einsatz von kaltem Wasser als Betäubungsmittel.

Intraperitoneale Injektion in Adult Zebrafisch

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

intraperitoneal-injection-into-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

57.0K Aufrufe.  The University of Chicago. Wir zeigen, intraperitoneale Injektion in das Erwachsenenleben Zebrafisch. Wir verwenden eine 10 ul Nanofil Mikrospritze durch eine Micro4 Controller und UltraMicroPump III geregelt. Diese Demonstration umfasst den Einsatz von kaltem Wasser als Betäubungsmittel.

Serie: Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Die Transplantation von Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafisch

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Forschung

Biologie

Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus.  The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus. The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Die Injektion von dsRNA in Female A. aegypti Mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

Zebrafisch Gehirn Ventrikel Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Retro-Orbital-Injection in Adult Zebrafisch

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection von Organen aus dem Adult Zebrafisch

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

Direkte Lieferung von MIF Morpholinos Into the Zebrafisch Otocyst durch Injektion und Elektroporation Beeinflusst Inner Ear Entwicklung

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Die Transplantation von Zellen direkt in die Niere von Adult Zebrafisch

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Präparation des Adult Zebrafisch Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in das Regenerations Adult Zebrafisch Leitwerk

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...