Die Autoren danken Sharmin Hossain für die Zeitraffer-Film Wachstumschancen eines unreifen Neuronen und Derek Dunfield für die elektronenmikroskopischen Bildern von SCE micromicropipette Tipps.

Gerätesatz-up: <ol><li> Die elektrische Ausrüstung für diese Technik erforderlich sind, ein Stimulator, ein Oszilloskop und einer Mikropipette Halter mit einem Silberdraht in die Mikropipette eingefügt ausgestattet. Wir verwenden in der Regel einem Axon Instrumente Axoporator 800A Stimulator, aber auch andere gemeinsame Stimulatoren wie Grass Instrumente SD9 Stimulatoren sind auch für Single-Cell-Elektroporation geeignet. Der Stimulator ist es, die headstage, die mit dem Silberdraht-Elektrode im Inneren der Glasmikropipette enthält eine interne Durchführung Lösung gelegt werden Schnittstellen verbunden. Die anderen führen aus dem Stimulator ist das Oszilloskop-Eingang, der auch die Signale von der Kaulquappe externen Masse verbunden. Die Kaulquappe externen Masse ist einfach ein Silberdraht, dass in elektrotonischen Kontakt mit der Kaulquappe bei der Elektroporation bleibt. Die Schaltung ist abgeschlossen, wenn der Mikropipette in Kontakt mit der Kaulquappe gelegt wird. </li><li> Einzel-Zell-Elektroporation erfordert ein Mikroskop mit einem gut funktionierenden Abstand (mindestens 5 cm), da hierdurch Spielraum und ermöglicht die Mikropipette in einem Winkel von ca. 30-45 Grad gebracht werden. </li></ol> Herstellung von Mikropipetten: Vorbereitung der entsprechenden Pipetten ist ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll. Die Schwierigkeit liegt in Abwägung einer schmalen Spitze (weniger als 1 &amp;mgr; im Durchmesser) mit einer, die nicht leicht zu brechen, wenn Punktion des Gewebes. Wir haben auch festgestellt, dass die Spitzen mit einem Kegelwinkel von mehr als 10 Grad vorzuziehen sind. <ol><li> Bereiten Sie ein gezapftes Mikropipette mit einer Spitze Durchmesser von weniger als 1 &amp;mgr; und eine Spitze Kegelwinkel von mehr als 10 Grad. <ol><li> Borosilikatglas mit einem internen Filament mit einem Außendurchmesser von 1,5 mm und einem Innendurchmesser von 0,75 mm ist für diesen Zweck gut geeignet. <ol><li> Die relativ dickem Glas sorgt für eine gewisse Steifigkeit an der Spitze. </li><li> Die internen Filament in der Zeichnung zurück gefüllten Flüssigkeit in Richtung der Mikropipette Spitze wichtig. </li></ol></li></ol></li><li> Herstellung von geeigneten Tipps werden oft mehrere Änderungen an beobachteten Ergebnisse. Verschiedene Gewebe kann eine Spitze mit einem etwas anderen Form oder Durchmesser. </li></ol> Einzel-Zell-Elektroporation Protokoll: Für neue Nutzer, ist es ratsam, mit fluoreszierenden Farbstoffen Dextran beginnen, da, anders als genetisch kodierte fluoreszierende Proteine, können sie sofort unter Epifluoreszenz gesehen werden. Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen ermöglicht dem Anwender, direkt sehen die Lage der Mikropipette Spitze innerhalb des Gewebes, und auf der Elektroporation gibt ein sofortiges Feedback, ob das Gerät ordnungsgemäß eingerichtet und ob die Mikropipette Spitze angebracht ist. <ol><li> Füllen Mikropipette mit Lösung der Verbindung entweder durch eine Be-Spritze oder durch Verfüllen elektroporiert werden. <ol><li> Bei Verwendung von Plasmid-DNA, dass die Proben Endotoxin-frei sind, und bei einer Konzentration zwischen 1-2μg/ml, hergestellt in Wasser. </li><li> Die Konzentration der fluoreszierenden Farbstoffe Dextran sollte empirisch ermittelt werden. Wir verwenden oft fluoreszierende Farbstoffe in Wasser auf etwa 300 pm verdünnt. </li><li> Typischerweise sind Mengen von 0,5-1μl ausreichend. </li><li> Vor dem Laden, kurz zentrifugieren Lösungen mit hoher Geschwindigkeit auf die Menge der Partikelreste in die Mikropipette, die zu Verstopfungen führen kann gezogen zu reduzieren. </li><li> Luftblasen in der Spitze oft beeinflussen Stromfluss und sollte durch kräftiges flicking der Mikropipette vor der headstage Montage verdrängt werden. </li></ol></li><li> Legen Sie Mikropipette in den Halter oder headstage auf einem 3-Achs-Mikromanipulator montiert. Stellen Sie sicher, dass Silber Drahtelektrode in Mikropipette eingelegt ist, und ist in elektrotonischen Kontakt mit der internen Lösung. </li><li> Anesthetize Kaulquappen durch Eintauchen in 0,02% MS-222 (3-Aminobenzoesäure-ethylester) in Kaulquappenaufzuchtschränke Medium (Steinberg-Lösung, pH 7,4) vorbereitet. <ol><li> Wir benutzen normalerweise Bühne 44-48 Albino Xenopus laevis Kaulquappen in unseren Experimenten. </li><li> Kaulquappen sind in der Regel voll narkotisiert nach ca. 5 Minuten. </li><li> Mehrere Kaulquappen kann betäubt werden gleichzeitig von Wartezeiten zu reduzieren, aber meiden MS-222 für einen Zeitraum von mehr als 1 Stunde. </li></ol></li><li> Übertragen einer einzigen Narkose Kaulquappe zur Elektroporation Kammer mit einem Kunststoff-Transfer Mikropipette. <ol><li> Die Elektroporation Kammer kann problemlos in-house durch Schnitzen einer Kaulquappe-förmigen Hohlraum in einem kleinen Sylgard ® Silikon-Block und das Einfügen von einem silbernen Erdungskabel in den Hohlraum, so dass es in elektrotonischen Kontakt mit der Kaulquappe in der Kammer gemacht werden. </li></ol></li><li> Position Kaulquappe Dorsalseite bis mit einem feuchten Pinsel. </li><li> Senken Sie die Mikropipette, bis er in Kontakt mit der Haut ist, direkt angrenzend an die Region von Interesse. <ol><li> Targeting Regionen mit dicht gepackten Zellkörper wird deutlich erhöhen Chancen auf eine erfolgreiche Elektroporation.Wir typischerweise Ziel der Kaulquappe Tectum opticum. </li><li> Bringen Sie die Mikropipette in einem Winkel von 30 bis 45 Grad. Flachere Flugbahn machen Hautpunktion schwieriger, während steilere Winkel oft den Blick behindern. </li></ol></li><li> Fortsetzung Senkung der Mikropipette wird zunächst Grübchen der Haut, und dann passieren in das darunter liegende Gewebe. <ol><li> Oberflächliche Zellen werden in vivo-Bildgebung bevorzugt, und kann dadurch sichergestellt werden, dass die Mikropipette Spitze langsam auf Dellen in der Haut verringert ausgerichtet sein. </li></ol></li><li> Man sollte ständig die Mikropipette Widerstand einmal im Gewebe platziert. Bei Verwendung eines Axoporator 800A (Axon Instruments), Widerstände von ca. 10-40MΩ sind optimal. Resistance ist ein guter Indikator dafür, ob die Spitze Durchmesser eignet sich für Single-Cell-Elektroporation. <ol><li> Hohe Mikropipette Widerstände (&gt; 100MOhm) sind bezeichnend für verstopfte Tipps oder Mikropipetten mit Tipps, die zu schmal sind. </li><li> Low Mikropipette Widerstände (&lt;10 M) sind ein Hinweis auf eine Spitze Durchmesser, der zu groß ist, oft eine Folge einer gebrochenen Spitze. </li><li> Wenn Sie einen Stimulator, der nicht zur Verfügung stellt eine direkte Widerstand zu messen, kann Mikropipette Widerstand indirekt durch Beobachtung der Amplitude der Spannungsimpulse vom Oszilloskop (siehe unten) gemessen. </li></ol></li><li> Spannung anlegen zu trainieren. <ol><li> Für Plasmid-DNA, Züge Puls festgestellt, dass die effektivste bestehen aus negativen Rechteckimpulse 1ms Dauer, bei 300Hz mit Impulsfolge Dauer von 500ms geliefert. <ol><li> Die Impulsspannung ist empirisch ermittelt, so dass die Amplitude der Impulse auf dem Oszilloskop gemessen zwischen 0,75 und 1.5μA ist. </li></ol></li><li> Für fluoreszierende Farbstoffe Dextran, sind positive Rechteckimpulse von 300μs Dauer bei einer Frequenz von 300Hz mit Impulsfolge Dauer von 10 ms ausgeliefert. <ol><li> Wie das Protokoll für die DNA, ist die Impulsspannung empirisch ermittelt, so dass die Amplitude der Impulse auf dem Oszilloskop gemessen zwischen 0,75 und 1.5μA ist. </li><li> Zusätzliche Anpassungen der Stimulus-Parameter können basierend auf der Beobachtung der Ergebnisse der Elektroporation unter Epifluoreszenz vorgenommen werden. <ol><li> Wenn elektroporierten Zellen dim erscheinen sollte Pulsparameter schrittweise angehoben werden, bis die Zellen heller erscheinen. </li><li> Auf der anderen Seite, wenn Cluster von Zellen markiert sind, sollten Pulsparameter reduziert, bis einzelne Zellen markiert werden. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Retract Mikropipette in eine andere Stelle innerhalb des Gewebes wieder einsetzen und anwenden Spannung zu trainieren. <ol><li> Zur Verbesserung der Ausbeute, wir in der Regel elektroporieren mehreren Standorten in jeder Hemisphäre der Kaulquappe Tectum opticum mit ausreichendem Abstand zu gewährleisten, dass markierte Zellen nicht überlappen. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die Elektroporation Kaulquappe in einen Behälter mit Steinbergs Aufzucht Lösung. <ol><li> Kaulquappen werden schnell aus der Narkose innerhalb weniger Minuten wiederherzustellen. </li></ol></li><li> Das gleiche Mikropipette kann für zahlreiche Kaulquappen verwendet werden. Es ist wichtig, stets die Amplitude der Pulse auf dem Oszilloskop beobachtet. <ol><li> Wenn die Pulsamplitude bleibt nach einem erheblichen Anstieg ihrer Pulsintensität niedrigen dies ist wahrscheinlich ein Ergebnis der Spitze verstopft, oft gesehen, wenn Elektroporation viele Kaulquappen in einer Sitzung. <ol><li> Eine Methode, um eine kleine Spitze verstopfen verdrängen ist auf einen einzigen positiven Impuls nach dem Einlegen der Mikropipette in das Gewebe gelten. </li><li> Wenn die verstopfen nicht verdrängt werden kann, oder Verstopfung häufig auftritt, ersetzen Sie die Mikropipette. </li></ol></li><li> Wenn die Pulsamplitude wie vor sehr groß, nachdem deutlich verringert die Pulsparameter, ist dies ein Zeichen dafür, dass die Spitze gebrochen und muss ersetzt werden. </li></ol></li></ol> Screening für die erfolgreiche elektroporierten Zellen: <ol><li> Nach der Elektroporation sind Kaulquappen markierten Zellen mit einer aufrechten Epifluoreszenzmikroskop abgeschirmt. </li><li> Im Fall von Fluoreszenzfarbstoffen kann Kaulquappen schon nach 30 Minuten nach der Elektroporation zu sehen sein. <ol><li> Wir haben jedoch festgestellt, dass längere Intervalle mit geringeren Hintergrundfluoreszenz Ebenen zugeordnet sind. </li></ol></li><li> Für genetisch kodierte fluoreszierende Proteine, ist das Screening in der Regel mindestens 12 Stunden nach der Elektroporation durchgeführt. <ol><li> Zellen, die fluoreszierende Proteine ​​weiterhin heller mit der Zeit, also dim Zellen kann nach einer weiteren Pause von 12-24 Stunden erneut kontrolliert werden. </li></ol></li><li> Kaulquappen werden betäubt, wie oben beschrieben, in einen Sylgard ® Kammer und Deckglas. Individuelle Kaulquappen werden dann unter Epifluoreszenz untersucht. <ol><li> Beachten Sie, dass eine übermäßige Exposition gegenüber Epifluoreszenz Licht wird in Phototoxizität, dass die markierten Zellen zu töten führen kann. Daher verringert sich die Menge der Zeit, dass die Zellen mit dem fluoreszierenden Licht ausgesetzt werden. </li></ol></li><li> Zurück Kaulquappen in den Behälter mit Steinbergs Aufzucht Lösung. </li></ol>

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	<li>Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+single-cell+electroporation+for+transfer+of+DNA+and+macromolecules.">In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules.</a> Nature Protocols. 1, 1267-1272 (2006).</li><li>Dunfield, D., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation.">Single cell electroporation.</a> Encyclopedia of Neuroscience (4th Ed.). , .</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo.">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li></ol>

Einzel-Zell-Elektroporation (SCE) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Bestimmung der Genfunktion und Durchführung von gezielten genetischen Manipulation. Die Transparenz des Albino-Kaulquappe und die Zugänglichkeit des Gehirns lässt sich dieses Modell, das ideal für die Visualisierung von neuronalen Wachstums-und intrazelluläre Ereignisse innerhalb eines lebenden Organismus geeignet. SCE ermöglicht die Visualisierung des Wachstums eines einzelnen Neurons, und Zell-autonome Manipulationen innerhalb eines ansonsten unveränderten Geh...

single cell electroporation in vivo within the intact developing brain

Einzel-Zell-Elektroporation (SCE) ist eine spezialisierte Technik ermöglicht die Bereitstellung von DNA oder andere Makromoleküle in einzelne Zellen innerhalb intakten Gewebe, auch in vivo Präparate. Der entscheidende Vorteil dieser Technik ist, dass experimentelle Manipulationen an einzelnen Zellen durchgeführt werden, während die umgebenden Gewebe unverändert, so unterscheiden Zell-autonome Effekte aus, die sich aus globalen Behandlungen. Wenn mit fortgeschrittenen In-vivo-Bildgebung kombiniert, ermöglicht SCE von fluoreszierenden Markern direkte Visualisierung der zellulären Morphologie, Zellwachstum, und intrazelluläre Ereignisse, auf Zeitskalen von Sekunden bis zu Tagen. Während diese Technik in einer Vielzahl von in vivo und ex vivo Präparaten verwendet wird, haben wir diese Technik für den Einsatz in Xenopus laevis Kaulquappen optimiert. In diesem Video-Beitrag, Detail, das wir das Verfahren für die SCE von einem fluoreszierenden Farbstoff-oder Plasmid-DNA in die Neuronen im intakten Gehirn des Albino Xenopus Kaulquappen. Wir diskutieren auch Methoden, um die Ausbeute zu optimieren, und zeigen Beispiele von Live-Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Imaging von Neuronen Fluoreszenz von SCE gekennzeichnet.

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Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Einzel-Zell-Elektroporation (SCE) ist eine spezialisierte Technik, die Abgabe von DNA oder andere Makromoleküle in einzelne Zellen innerhalb intakten Gewebe, auch in vivo Präparate. Hier haben wir ausführlich das Verfahren für die SCE von einem fluoreszierenden Farbstoff-oder Plasmid-DNA in die Neuronen im intakten Gehirn des Xenopus laevis Kaulquappen.

Single Cell Elektroporation in vivo innerhalb der intakten sich entwickelnde Gehirn

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

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13.2K Aufrufe.  University of British Columbia - UBC. Einzel-Zell-Elektroporation (SCE) ist eine spezialisierte Technik, die Abgabe von DNA oder andere Makromoleküle in einzelne Zellen innerhalb intakten Gewebe, auch in vivo Präparate. Hier haben wir ausführlich das Verfahren für die SCE von einem fluoreszierenden Farbstoff-oder Plasmid-DNA in die Neuronen im intakten Gehirn des Xenopus laevis Kaulquappen.