Die Autoren möchten die Freimann Life Science Center und Center for Zebrafisch-Forschung Mitarbeiter danken für ihre Pflege und Wartung des Zebrafisch.

1. Resuspendieren Morpholino <ol><li> Verdünnen von 300 nM Fluorescein-markierten Morpholino in 100 ul Nuklease-freies Wasser zu einer etwa 3 mM Lösung zu machen. Der Morpholino-Lösung wird in mehrere Paraffin versiegelt Mikrozentrifugenröhrchen aliquotiert und bei Raumtemperatur gelagert und lichtgeschützt aufbewahren. </li><li> Um die genaue Konzentration bestimmen, Morpholino, verdünnen 5 ul der Morpholino-Lösung (oder Wasser als Blindprobe) in 95 ul 0,1 N HCl. Stellen Sie eine Grundlinie auf einem Spektrophotometer bei 265 nm mit dem Wasser leer, und dann bestimmen, das Lesen der verdünnten Lösung Morpholino. Multiplizieren Sie den Morpholino-Absorption bestimmt durch seine konstante und mit dem Verdünnungsfaktor, um die Konzentration in ng / ul bestimmen. Das Morpholino konstanten wird wie folgt berechnet: Morpholino konstant = Molekulargewicht der Morpholino-X 1000/molar Absorption. Das Molekulargewicht und molarer Extinktion für die Morpholino können auf dem &quot;gefunden werdenOligo-Eigenschaften &quot;Blatt mit dem Produkt geliefert. Teilen Sie den Morpholino-Konzentration in ng / ul, durch das Molekulargewicht, um die Konzentration in mM zu bestimmen. Verdünnen Sie die Morpholino, falls notwendig, zu einer funktionierenden Konzentration, in der Regel 1,2 mm. </li></ol> 2. Fin Amputation <ol><li> Anesthetize erwachsenen Zebrafisch entweder Tricaine oder 2-Phenoxyethanol 1,0 mg / ml Wasser in dem Tank. </li><li> Amputieren die Rippe mit einem sterilen Skalpell oder Rasierklinge proximal zu dem ersten Verzweigungspunkt lepidotrichial. Dies sollte in der gleichen proximal / distalen Position auf jedem Tier (z. B. 7 Knochensegmente distal von der Rippe Gürtel) durchgeführt werden. WICHTIG: achten Sie darauf, perfekt senkrecht geschnitten, um den anterioren / posterioren Ebene des Tieres. Winkelschnitte wird in unebenem fin Auswuchs der dorsalen und ventralen Hälften der Flosse führen. </li><li> Bringen Sie den Fisch mit einem Tank. Wir pflegen in der Regel die Fische bei 33 ° C, um die Regeneration zu erhöhen. Je nach experimentellem Design, wAIT 0-2 Tage nach der Amputation (dpa) Flosse für Regeneration, um vor der Einführung des Morpholino beginnen. Alternative Ansätze sind in der Diskussion besprochen, unten. </li></ol> 3. Morpholino Injektion <ol><li> Der Tag vor dem Einspritzen des Morpholino, machen eine Injektion Platte (Abbildung 2). Achten Sie darauf, ausgeschnitten eine Kerbe an einem Ende des Brunnens, die Stabilisierung der Fisch für die Mikroinjektion Prozedur hilft. </li><li> Bei 2 dpa, bereiten Sie das Mikro-Einspritzvorrichtung und Morpholino-Lösung. </li><li> Verdünnen Sie die Fluorescein-markierten Morpholino auf die richtige Konzentration (empfehlen, beginnend mit 1,2 mM) und in einem 65 ° C warmes Wasserbad, für 5 Minuten. </li><li> Ziehen Sie die Nadel aus Glas für die Mikro-Injektion mit einer Nadel Abzieher. </li><li> Legen Sie die Nadel mit der Morpholino (Hinweis: je nachdem, ob Sie Back-Füllung oder laden Sie Ihre Front-Nadel wird entscheiden, ob Sie die Nadel zuerst laden, oder schneiden Sie die Spitze zuerst). </li><li> Schneiden Sie die Spitze vor der Nadel in einemn Winkel. </li><li> Befolgen Sie die Anweisungen Ihres Mikro-Einspritzsystem, um eine etwa 5 nl Blase der Morpholino pro Injektion zu injizieren. Größere Mengen von Morpholino könnte stören das Gewebe. </li><li> Betäuben die Fische und auf Injektion Platte. Entfernen Sie das gesamte überschüssige Flüssigkeit und richten Sie die Nadel an die entsprechende Stelle, knapp distal des knöchernen ray (Abbildung 3). Mit Hilfe eines Mikroskops und Mikroinjektion Apparat geeignet für Morpholino-Injektionen (siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien), injizieren die Morpholino in die Flosse von vorne nach hinten, wie in Abbildung 3 dargestellt. Die Injektion von hinten nach vorne bewirkt, dass der Finne Gewebe aufzurollen während der Injektion und ist sehr schwierig. </li><li> Führen Sie die Nadel vorsichtig in das regenerative Gewebe, genau distal zu jedem knöchernen ray (mit &quot;1&quot; in Abbildung 3) und schieben, bis distal im Blastem befindet (&quot;2&quot; in Abbildung 3). Achten Sie darauf, die Nadel durch die Push-enReifen fin. Wenn die Nadel korrekt lokalisiert ist, spritzen sie den Morpholino (dh klicken Sie auf eine Zeit). Bei 1,2 mm, wird das Fluorescein-markierte Morpholino Lösung gelb-grün, selbst bei normalen Lichtverhältnissen. Mit jeder Injektion, ein gelbes &quot;puff&quot; von Morpholino-Lösung visualisiert werden können, hilft die Lokalisierung der Injektion zu dem Blastem. Etwa 75 nl (10-15 Klicks) von Morpholino-Lösung sollte pro knöchernen ray injiziert werden. ~ 1 Sek. Pause zwischen zwei Klicks. Wir injizieren nur die Rückenseite, mit dem ventralen wie Elektroporation, nur Kontrolle. Alternativ könnte man wiederholen Sie diese ganze Prozedur mit einem Morpholino Kontrolle auf der ventralen Hälfte der Flosse. </li></ol> 4. Die Elektroporation der Morpholino <ol><li> Unmittelbar nach der Injektion der Morpholino, entfernen Sie die Injektion Platte aus dem Mikro-Injektionsgeräts. Füllen Sie die Injektion Platte gut mit der Anästhesie-Lösung, bis der Fisch unter Wasser. Die Elektroporation wird unter der Wasserlinie durchgeführt. </li> &lt;li&gt; Ein 3 mm Durchmesser Platinplatte Pinzette Elektrode (650-P3 CUY Pinzette, Protech International) lokalisiert die Impulse, um etwa die Hälfte der Flosse. Achten Sie darauf, die Elektroden an der Flosse Gewebe berühren. Um sicherzustellen, dass die Elektroden nicht berühren fin Gewebe, drehen Sie den Fisch auf seiner dorsalen Seite und schauen Sie geradeaus auf der Mittellinie für die Elektroporation. </li><li> Elektroporieren sowohl die dorsalen und ventralen Seiten der Finne mit einem CUY21 Square Wave Electroporator (Protech International, Inc.) (für eine nicht-spezifische Effekte zu steuern Elektroporation). Wischen Sie die Elektroden mit einem feuchten Kimwipe nach jeder Elektroporation, um alle Blasen, die sich gebildet haben können, zu entfernen. Wenn sie nicht entfernt werden, ein Mini-Ladung aufbaut, die anzieht das Gewebe in Richtung der Elektrode. Die Elektroporation Parameter sollten auf zehn aufeinander folgenden Pulsen von 50 ms eingestellt werden, bei 15 V mit einer 1 sec Pause zwischen den Impulsen. </li><li> Den Fisch auf einen Objektträger oder eine Petrischale und schnell Bild der Flosse, und achten Sie auf note der dorsal / ventral Orientierung. Dieses Bild wird für das Nachwachsen Analyse am nächsten Tag verwendet werden. Bringen Sie den Fisch in den Tank. </li></ol> 5. Analyse <ol><li> Wenn das Zielprotein, die in Expression wurde geklopft für die richtige Finne Regeneration erforderlich ist, sollte ein dramatischer Unterschied zwischen den dorsalen und ventralen Hälften der Flosse klar sein, 1 Tag nach der Elektroporation (Abbildung 5B). </li><li> Bei 3 dpa, nehmen Sie ein anderes Bild von der Flosse eines jeden Fisch und die Zuordnung dieses Bild mit den entsprechenden 2 dpa-Bild (Abbildung 5B). Die natürlichen Schwankungen in der Seitenflosse Pigmentierung Muster zwischen Tieren können Sie korrekt zu identifizieren einzelnen Fische. </li><li> Mit NIH Image, verfolgen Sie die 2 und 3 dpa dpa Bereiche sowohl der dorsalen und ventralen Hälften (5B). </li><li> Um% Bereich des dorsalen gegen die ventrale Verwendung folgender Formel bestimmen: (- Dorsal Dorsal 2dpa 3DPA) / (Ventrale 3DPA -<html> Ventrale 2dpa) x 100 =%-Bereich </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse <ol><li> Wir haben immer Assay zur Flosse Auswuchs bei 3 dpa, oder 24 HPE (Stunden nach der Elektroporation). Zu diesem Zeitpunkt sollte die Fluorescein-markiertem Morpholino vorhanden sein in der dorsalen Hälfte der Lamelle (Supplemental 1 und 6A). Es ist normal, um zu sehen, einige nachgestellte bis auf die Ebene der Amputation. </li><li> Es sollte kein Unterschied zwischen den dorsalen und ventralen Seiten in der Seitenflosse injiziert und durch Elektroporation mit der Steuerung Morpholinos (6B) sein. </li><li> Wenn die experimentellen Morpholino zielt ein essentielles Protein für Flosse Auswuchs, sollte ein dramatischer Unterschied zwischen den dorsalen und ventralen Seiten beobachtet werden (Abbildung 6c). </li><li> Wenn die Elektrode berührt die Flosse bei der Elektroporation, wird das Gewebe erscheinen braun (fast in Erscheinung verbrannt) und nekrotisch. </li></ol>&quot;Src =&quot; / files/ftp_upload/3632/3632fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Schematische Darstellung der verschiedenen Ereignisse, die während fin Regeneration auftreten. Die zugrunde liegenden Zeiten für jedes Ereignis in Stunden nach der Amputation (HPA) angegeben und entsprechen einem Tank Temperatur von 33 ° C. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig2.jpg" /> Abbildung 2. A. Schematische Darstellung der Einspritzplatte, die aus Agarose hergestellt ist und enthält eine kleine, gut, um den Fisch während des Mikroinjektion Morpholino halten. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig3.jpg" /> Abbildung 3. Schematische Darstellung der Morpholino Mikroinjektion. A. Legen Sie den Fisch in die Schüssel mit dem Kopf des Fisches in der Kerbe ausgeschnitten des Brunnens, die helfen, die Fische bleiben stabil wird. B. Bei geringer Vergrößerung, ordnen Sie die Nadel, so dass es ist in der Nähe des regenerierende Gewebe der Rippe. C </strong&gt; Bei höherer Vergrößerung, spritzen sie den Morpholino distalen jedem knochigen Fin Ray (dh in jedem Blastem). Die Nadel sollte in das Gewebe direkt distal des knöchernen ray (1), und dann weiter zu dem Ort des Blastem (2). Hinweis: Die grünen Punkte im Schaltplan sind nur dazu gedacht, um den Ort der Injektion zu zeigen. Der Morpholino kann kurz visualisiert werden als grün / gelb &quot;puff&quot; nach jeder Injektion, jedoch ist diese nicht fortbestehen wie in der schematischen gezeigt. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig4.jpg" /> Abbildung 4. Schematische Darstellung der Finne Elektroporation. A. Nach Mikroinjektion, legen Sie den Fisch in einer Petrischale voller Anästhesie und elektroporieren sowohl die dorsale und ventrale Hälften. B. Achten Sie darauf, nicht berühren fin Gewebe. Die Elektroden sollten ~ 1 mm von dem Gewebe platziert werden. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig5.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 5. Schematische Darstellung der Methoden zur Flosse Auswuchs Hemmung zu berechnen. A. Nehmen Sie ein Bild von der Flosse eines jeden Fisch bei 2 dpa, entweder unmittelbar vor oder nach Morpholino-Injektion und Elektroporation. Verfolgen Sie die regenerierbaren Gewebes sowohl der dorsale (grün) und ventralen (blau) Hälften der Flosse mit NIH Image, (schwarz gestrichelte Linien). B. Bei 3 dpa, nehmen Sie ein anderes Bild von jeder Rippe und wieder verfolgen die dorsalen und ventralen Bereichen von Nachwachsen mit NIH Image. C. Subtrahieren Sie die Fläche des erneuten Wachstums bei 2 dpa vom Gesamtbetrag Nachwachsen bei 3 dpa sowohl für die dorsalen und ventralen haves. Der Bereich der dorsalen Prozent gegenüber ventralen Nachwachsen kann mit folgender Formel berechnet werden: ((D 3DPA - D 2 dpa) / (V 3DPA - V 2dpa)) x 100. Prozent Hemmung = 100 - Prozent Area. <img alt="6" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig6.jpg" /> 6. Beispiele für erwarteteErgebnisse. A. Fluoreszenzbild, die eine Fluorescein-markierten Kontroll-Mor in der dorsalen Hälfte der Rippe, 24 Stunden nach der Elektroporation (HPE). B. Hellfeldaufnahme einer Rippe, die injiziert und wurde durch Elektroporation mit einem Kontroll-Mor in der dorsalen Hälfte . Das Bild zeigt gleich das Nachwachsen der beiden dorsalen und ventralen Hälften einer Flosse, 24 HPE. C. Hellfeldaufnahme einer Flosse, die injiziert und mit einem experimentellen Morpholino in der dorsalen Hälfte wurde elektroporiert. Das Bild zeigt die Hemmung des erneuten Wachstums auf der dorsalen / injizierte Seite. Die Linie zeigt die Menge an Nachwachsen bei 2 dpa, unmittelbar vor der Morpholino-Injektion und Elektroporation. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig7.jpg" /> Abbildung 7. Schematische Darstellung einer alternativen Injektion und Elektroporation Verfahren zur Target-Proteine ​​bei der Wundheilung und Blastembildung beteiligt. A. Spritzen Sie die Morpholinozwischen den einzelnen knöchernen Fin Ray auf der dorsalen Hälfte der Flosse. B. elektroporieren die Morpholino wie normal. C. amputieren die Flosse unmittelbar proximal (~ 1 knöchernen Segment) an der Injektionsstelle. D. Die Fluorescein-markierten Morpholino beobachtet werden kann Wunde in Epithel und Blastem bei 24 HPE. <img alt="8" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig8.jpg" /> Abbildung 8. Mit der Technik zur Wunde Epithel und Blastembildung zielen. A. Hellfeldaufnahme einer Flosse bei 24 hPa, die injiziert und wurde durch Elektroporation mit einer Kontrollgruppe Morpholino unmittelbar vor der Amputation. B. Fluoreszenzbild von Flosse in Panel A. Hinweis gezeigt dass das injizierte dorsalen Hälfte der Flosse zeigt eine gute Aufnahme der Morpholino in der regenerierbaren Gewebes. C -. C &quot;Höhere Vergrößerung des dorsalen Hälfte der Flosse in Panels gezeigt A und B. Die Injektionsstellen sind oft noch sichtbar (Pfeilspitzen), Aber viele Zielzellen migriert haben, um in Epithel und Wunde Blastembildung (Pfeil) zu beteiligen. <img alt="Abbildung 9" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig9.jpg" /> Abbildung 9. Mit der Technik, um Zellen, die das Blastem. A. Fluoreszenz und Hellfeld eingefügten Bilder zeigen eine Flosse injiziert und elektroporiert mit Morpholino sowohl auf der dorsalen und ventralen Hälften bilden die Migration anzusprechen. Der Finne wurde dann bei zwei Ebenen amputiert. Die dorsale Hälfte reduziert wurde unmittelbar distal der Injektionsstelle, wo, wie das ventrale Hälfte 9-10 knöchernen Segmenten distal der Injektionsstelle wurde geschnitten. B. Bei 24 hPa, zeigen die Fluoreszenz-und Hellfeld eingefügten Bilder, die Morpholino wurde zum dorsalen migriert regenerieren (1), aber nicht die ventrale regenerieren (2), was anzeigt, dass nur die Zelle unmittelbar proximal zu dem Schnitt Seite auf Blastembildung teilnehmen. Die beiden weißen Pfeile zeigen den Pegel jedes AmputationEbene. Panels mit 1 und 2 auf der rechten Seite des Bildes zeigen eine höhere Vergrößerung Blick auf die dorsale und ventrale Hälften der Flosse, beziehungsweise. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3632/Suppl_Fig1_JoVE.mov">Zusätzliche 1.</a> Ein Video eines konfokalen z-Stapel einem Bereich entsprechend der Position eines Blastem einer Rippe injiziert und mit einer Steuerung elektroporiert Morpholino ist. Das Bild wurde bei 24 HPE übernommen. Da eine einzelne Fluoresceinmoleküls nicht visualisiert werden können, können nicht alle der Morpholino visualisiert oder quantifiziert. Allerdings geben diese Bilder einen Eindruck von den verschiedenen Graden der Aufnahme, die sichtbar gemacht werden kann in den Zellen, aus einzelnen punktförmigen Punkte, um ganze Zellen voll von fluoreszierenden Morpholino. Auf dem Standbild, wird die Orientierung gezeigt. Maßstab: 25 Mikron.

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf-dependent+depletion+of+microRNA-133+promotes+appendage+regeneration+in+zebrafish.">Fgf-dependent depletion of microRNA-133 promotes appendage regeneration in zebrafish.</a> Genes Dev. 22, 728-733 (2008).</li><li>Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+adult+fish:+a+new+tool+to+study+fin+regeneration.">High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration.</a> Genesis. 32, 27-31 (2002).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Hier beschreiben wir eine leistungsstarke loss-of-function-Ansatz bedingt Knockdown Proteine ​​von Interesse während der Finne Regeneration in adulten Zebrafisch. Diese Technik wurde verwendet, um Gene zu studieren Gap Junction-, Signal-Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren, und microRNAs während regenerative fin Auswuchs 16, 20-22. Wir erwarten, dass diese Technik auch verwendet werden, um Gene für die Wundheilung und Blastembildung durch Anpassung der Technik erforderlich zu untersuchen. Zum Beispiel, injizierten wir elektroporiert und eine Kontrolle Morpholino in den Raum zwischen den knöchernen Flossenstrahlen auf der dorsalen Hälfte der Finne vor der Amputation (Abbildung 7). Wir haben dann die Flosse unmittelbar distal der Injektion Flugzeug amputiert. 24 hPa, beobachteten wir, dass die Morpholino-Zielzellen hatte distal, um sowohl die Wunde Epithel und Blastem (Abbildung 8) bilden migriert, was darauf hinweist, dass die Zellen während dieser frühen Phasen der Regeneration kann auch TargETED. Die Technik hat ein paar bemerkenswerte Einschränkungen. Zum Beispiel ist die Fluoreszenz von Fluorescein-nicht beibehalten folgenden Fixierung und Verarbeitung für die Immunhistochemie, die es unmöglich, eine bestimmte zelluläre Phänotyp (dh Zell-Proliferation) mit der Menge an Morpholino in einer Zelle korreliert ist. Darüber hinaus ist es nicht gelungen, dauerhaft die Elektroporation von Plasmiden in der Regeneration Heckflosse, obwohl eine vorherige Gruppe auch taten die erfolgreiche Elektroporation von DNA in Flossengewebes 23. Schließlich haben wir festgestellt, dass die Morpholino nur wirksam für ~ 48 Stunden nach der Elektroporation 21, die mit dieser Technik in seiner jetzigen Form für die Prüfung Gene bei der Differenzierung von neuen Zelltypen beteiligt ist untersagt. Zusätzliche Tests und Modifikation des Verfahrens, kann überwunden werden diese aktuellen Einschränkungen. Darüber hinaus ist es möglich, dass diese Technik verwendet werden könntenan Proteine ​​der Zellwanderung vom darunter liegenden Gewebe zum Blastem beteiligt zu testen. Zum Beispiel, injizierten wir und Elektroporation ein Steuersignal Morpholino in beide Seiten der Rippe (wie in 7 beschrieben) vor der Amputation. Wir haben dann die dorsale Hälfte der Finne unmittelbar distal der Injektion Flugzeug amputiert und wir amputiert die Bauchflosse viel mehr distal. Bei 24 hPa, hatten die Morpholino-positive Zellen auf der Rückenseite von der Injektionsstelle, um die darüber liegende Epithel und Wunde Blastem migriert. Das war jedoch nicht der Fall ist auf der Bauchseite (Abbildung 9). Dies stützt die Idee, dass nur die Zellen, die die Amputation Ebene zugrunde liegen, in der regenerative Reaktion teilnehmen. Diese Daten legen nahe, dass auch Proteine ​​für die Hypothese aufgestellt, um die Zellwanderung erforderlich getestet werden konnte mit Hilfe dieser Technik werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> CUY21-Edit oder CUY21-SC Rechtecksignal Elektroporator </td><td> Protech International </td><td> CUY21EDIT oder CUY21SC </td><td> Beide Geräte arbeiten nach diesem Protokoll </td></tr><tr><td> 3 mm Durchmesser Paddle-Elektroden </td><td> Protech International </td><td> CUY 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morpholino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morpholino sollte kundenspezifisch angefertigt, um Ihre Protein von Interesse sein </td></tr><tr><td> 2-Phenoxyethanol </td><td> Sigma </td><td> 77.861-1L </td><td> Anästhesie; verdünnten 1:1000 in Fisch System Wasser für Verfahren, 1:500 für Sterbehilfe </td></tr><tr><td> Micro-injectian der Pumpe </td><td> World Precision Instruments </td><td> PV830 Pneumatische PicoPump </td><td> Viele verschiedene Systeme Mikroinjektion verwendet werden könnten </td></tr><tr><td> Micro-Manipulator </td><td> World Precision Instruments </td><td> MMJR </td><td> Rechtshänder (MMJL für Linkshänder) </td></tr><tr><td> Micro-Injektionsnadeln, 1,0 mm Außendurchmesser </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B100F-4 </td><td> Dies sind Borosilikatglas Kapillaren, in eine Nadel gezogen </td></tr><tr><td> Nadelhalter </td><td> World Precision Instruments </td><td> 5430-ALL </td><td> Pico Düsensatz, stellen Sie sicher, Inset der Pipette 1,0 mm Dichtung </td></tr><tr><td> Nadel-Abzieher </td><td> Sutter </td><td> P-97 </td><td> Andere Mikropipette / Nadel Abzieher sollte auch funktionieren </td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Leica, Nikon, Zeiss </td><td> Anzahl variiert je nach Hersteller </td><td> Jede Stereomikroskop mit 20X-Optik und die Fähigkeit, mit Mikromanipulatoren arbeiten </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin

Bestimmte Arten von Urodelen und Knochenfische regenerieren kann ihren Geweben. Zebrafisch haben zu einem weit verbreiteten Modell, um die spontane Regeneration der adulten Geweben wie Herz 1, Retina 2, Rückenmark 3, Sehnerv 4, sensorischer Haarzellen 5 und Rippen 6 zu untersuchen. Der Zebrafisch Rippe ist eine relativ einfache Ansatz, die leicht manipuliert wird, um mehrere Stufen in epimorphe Regeneration zu studieren. Wundheilung, Blastembildung und Flosse Auswuchs: Klassischerweise wurde fin Regeneration durch drei Phasen gekennzeichnet. Nach Amputation Teil der Flosse, wuchert das umgebende Epithel und wandert über die Wunde. Bei 33 ° C, tritt dieser Prozess innerhalb von sechs Stunden nach der Amputation (hPa, 1B) 6,7. Als nächstes zugrunde liegenden Zellen aus verschiedenen Linien (z. B. Knochen, Blut, Gliazellen, Fibroblasten) Wiedereinstieg in den Zellzyklus zu einem proliferativen Blastem, während die darüber liegende Epidermis weiter zu vermehren (1D) 8. Auswuchs tritt als Zellen proximal zu dem Blastem in ihre jeweiligen Linien neu zu differenzieren, um neues Gewebe (1E) 8 zu bilden. Abhängig von der Höhe der Amputation, wird die volle Regeneration in einer Woche bis zu einem Monat abgeschlossen. Die Expression einer großen Anzahl von Gen-Familien, darunter wnt, Hox-, FGF, MSX, Retinsäure, sch, Kerbe, BMP und Aktivin A-beta-Gene, ist hochreguliert während bestimmter Phasen der Regeneration fin 16.09. Allerdings haben die Rolle dieser Gene und ihren codierten Proteinen während der Regeneration schwierig zu beurteilen, wenn ein spezifischer Inhibitor für das Protein existiert 13, eine temperaturempfindliche Mutante besteht, oder ein transgenes Tier (entweder Überexpression des Wildtyp-Proteins oder eine dominant -negatives Protein) wurde 7,12 erzeugt. Wir entwiped ein Reverse genetische Technik, um schnell und einfach testen Sie die Funktion eines Gens während der Finne Regeneration. Morpholino-Oligonukleotide werden häufig verwendet, um den Verlust von spezifischen Proteinen während der Zebrafisch, Xenopus, Huhn und Maus Entwicklung 17-19 studieren. Morpholinos Basenpaar mit einem komplementären RNA-Sequenz entweder Block-prä-mRNA-Splicing oder mRNA-Translation. Wir beschreiben ein Verfahren zur effizienten Einführung Fluorescein-markierten Antisense-Morpholino in Regenerieren Zebrafisch Rippen den Zuschlag Expression des Zielproteins. Der Morpholino wird in jede Blastem der regenerierenden Zebrafisch Schwanzflosse Mikro-Injektion und Elektroporation in die umliegenden Zellen. Fluorescein liefert die Ladung zu den Morpholino elektroporieren und die Morpholino im Flossengewebes visualisieren. Dieses Protokoll erlaubt bedingten Protein Knockdown, um die Rolle von spezifischen Proteinen während der regenerativen fin Auswuchs zu untersuchen. In der Discussion beschreiben wir, wie dieser Ansatz angepasst werden, um die Rolle von spezifischen Proteinen während der Wundheilung oder Blastembildung, sowie ein potentieller Marker für Zellmigration in Blastembildung zu untersuchen.

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In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Wir beschreiben ein Verfahren zur bedingten Knockdown die Expression eines Zielproteins im Erwachsenenalter Zebrafisch Flossenregeneration. Diese Technik beinhaltet Mikrospritzvorrichtung und Elektroporation Antisense-Oligonukleotid in Morpholinos Flossengewebes das Testen des Proteins Rolle in verschiedenen Stadien der Flossenregeneration, einschließlich Wundheilung, Blastembildung und regenerative Auswachsen ermöglicht.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in das Regenerations Adult Zebrafisch Leitwerk

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

in-vivo-electroporation-morpholinos-into-regenerating-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

16.8K Aufrufe.  University of Notre Dame. Wir beschreiben ein Verfahren zur bedingten Knockdown die Expression eines Zielproteins im Erwachsenenalter Zebrafisch Flossenregeneration. Diese Technik beinhaltet Mikrospritzvorrichtung und Elektroporation Antisense-Oligonukleotid in Morpholinos Flossengewebes das Testen des Proteins Rolle in verschiedenen Stadien der Flossenregeneration, einschließlich Wundheilung, Blastembildung und regenerative Auswachsen ermöglicht.

Serie: In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Die Transplantation von Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafisch

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Forschung

Biologie

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

Single Cell Elektroporation in vivo innerhalb der intakten sich entwickelnde Gehirn

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Retro-Orbital-Injection in Adult Zebrafisch

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection von Organen aus dem Adult Zebrafisch

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Intraperitoneale Injektion in Adult Zebrafisch

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

Direkte Lieferung von MIF Morpholinos Into the Zebrafisch Otocyst durch Injektion und Elektroporation Beeinflusst Inner Ear Entwicklung

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Die Transplantation von Zellen direkt in die Niere von Adult Zebrafisch

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Präparation des Adult Zebrafisch Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging Adult Zebrafisch

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...