Diese Arbeit wird durch NHMRC Programm Grant # 568969 (PSS) und der Medizinischen Fakultät der University of New South Wales, Stem Cell Initiative (KSS) unterstützt.

Alle der unten beschriebenen Verfahren werden unter aseptischen Bedingungen in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank durchgeführt. Reagenzien und Geräte verwendet werden in der untenstehenden Tabelle aufgelistet. 1. Herstellung von 1,1% Alginat (w / v) <ol><li> In 0,275 g gereinigtes Natriumalginat (high Glucuronsäure-Gehalt ≥ 60%, Viskosität&gt; 200 mPa · s, und Endotoxin ≤ 100 EU / g) in einem sterilen 50 ml-Röhrchen und 25 ml sterilem 0,1% Gelatinelösung früheren (0,5 g hergestellt gelatin/500 ml Milli-Q-H 2 O gelöst und durch Autoklavieren). </li><li> Vortex das Rohr für ca. 30 Sekunden, um die teilweise aufzulösen Alginatpulver legen Sie dann das Rohr auf einer Orbitalmischer bei 10 xg über Nacht (Raumtemperatur). </li><li> In 2,778 ml von 9% steriler NaCl (4,5 g NaCl/50 ml Milli-Q-H 2 O) in 25 ml Alginatlösung. Vortex das Rohr für etwa 30 Sekunden durch Zentrifugation bei 95 × g für 5 min. </li><li> Bewahren Sie die Alginat-Lösung bei 4 °, C für die kurzfristige Lagerung (1-2 Monate) oder bei -20 ° C für die langfristige Lagerung (ungefähr ein Jahr). </li></ol> 2. Vorbereitung von CaCl 2 Fällbad <ol><li> Man löst 14,7 g CaCl 2. 2H 2 O und 2,38 g HEPES in 1 Liter Milli-Q H 2 O. </li><li> Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4. </li><li> Sterilisieren Sie die Lösung mit dem 0,22 um-Filter. </li><li> Fällbad kann bei Raumtemperatur (6-12 Monate) gelagert werden. </li></ol> 3. Herstellung von Lösung Entkapseln <ol><li> In 500 ml Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (D-PBS), 50 ml 0,5 M EDTA und 5 ml 1 M HEPES. </li><li> Sterilisieren mit einem 0,22 um Filter oder Autoklaven bei 121 ° C für 20 min. </li><li> Bewahren Sie die decapsulating Lösung bei Raumtemperatur (6-12 Monate). </li></ol> 4. Vorbereitung von Serum-Ersatz (SR) Medium <ol><li> Vor der Einkapselung vorbereiten SR Medium im Voraus, da debeschrieben in der Tabelle von spezifischen Reagenzien und Geräte. </li></ol> 5. Vorbereitung der ROCK-Inhibitor (Y-27632) <ol><li> Verdünnte Y-27632 Pulver in 0,1% humanes Serumalbumin (HSA) in D-PBS, um einen 5 mM Lösung herzustellen. </li></ol> 6. Vorbereitung für die Verkapselung von HES <ol><li> Pre-behandeln die Zellen mit Kulturmedien mit 10 uM von ROCK-Inhibitor (RI) für zwei Stunden bei 37 ° C (vor Licht schützen) ergänzt. </li><li> Nach der Behandlung RI, waschen Sie die Zellen mit D-PBS zweimal verdrängen die Zellen von Kulturplatten enzymatisch mit Accutase für 10 min bei 37 ° C </li><li> Vorsichtig kratzen die Zellen mit der Pipette oder Zellschaber und sammeln sich in einem 15 ml-Tube. Neutralisieren Sie die Accutase mit SR Medium im Verhältnis 1:1. </li><li> Um eine einzelne Zellsuspension herzustellen, filtern Sie die neutralisierte Zellen unter Verwendung eines 40 um Filter zu sammeln und in einem frischen 50 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen in der Lösung unter Verwendung eines Hämozytometers bestimmt. </li&gt; <li> Zentrifugieren der Zellsuspension 95 xg für 5 min und vorsichtig den Überstand verwerfen danach. Waschen Sie die Zellen mit vorgewärmten 0,9% NaCl. Zentrifugieren 95 xg für 5 min und den Überstand verwerfen. </li></ol> 7. Verkapselung der Zellen <ol><li> Eine 1 ml-Spritze an einem weichen Kunststoffschlauch 14G x 2 &quot;IV-Katheter. Dies wird verwendet, um die Zellsuspension auf der Spritzenpumpe geladen werden, wie in 1 gezeigt anzusaugen. </li><li> Die Zellen mit vorgewärmter Alginatlösung in einer Dichte von 1,25 Millionen Zellen / ml Alginat. Vorsichtig mit der Spritze zu mischen und zu vermeiden Blasen zu erzeugen. </li><li> Einrichten des Wulstes Generator, Spritzenpumpe und die Luft-Durchflußmesser wie in 1 gezeigt. Weitere Details dieser Vorrichtungen sind in Tabelle der Reagenzien und Geräten angegeben. </li><li> Mit den Zellen in die Spritze gesaugt, verwerfen Sie den Kunststoffschlauch von IV-Katheter und legen Sie die Spritze mit der Kapselung Maschine. Stellen Sie sicher, dass es eine 10 cm Abstand sein<html> zwischen das Ende der Einkapselungsmaschine und die Sammelstelle wie in 1 gezeigt. </li><li> Kapseln der Zellen, indem die Spritzenpumpe mit 20 ml / h, Luftdurchsatz in 8 l / min und einem Druck von 100 kPa (die Größe der Kapseln können durch Veränderung der Luftmenge geändert werden). </li><li> Sammeln Sie die verkapselten Zellen in eine Petrischale (100 x 15 mm) mit 20 ml vorgewärmten Fällbad für 7 min, um die Kapseln zu stabilisieren gefüllt. </li><li> Übertragen Sie die verkapselten Zellen durch leichtes Ansaugen in 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 20 ml 0,9% NaCl gefüllt. </li><li> Willkommen, dass die Kapseln in den Boden des Röhrchens absetzen dann vorsichtig der Überstand verworfen. Wiederholen Sie den Waschvorgang mit 0,9% NaCl. </li><li> Resuspendieren Sie die verkapselten Zellen in vorgewärmten Kulturmedium mit der RI (10 uM), Transfer in eine Kulturflasche ergänzt und bei 37 ° C / 5% CO 2. </li></ol> 8. Differenzierung von hES-Encapsulated zu DA-Neuronen ve_content &quot;&gt; Die gekapselte hESC sind mit RI für 3 Tage vor der Differenzierung behandelt. <ol><li> Samen der Maus Stroma-Zelllinie, PA6 Zellen bei einer Dichte von 1,0 x 10 4 pro cm 2 in 0,1% Gelatine beschichteten T75-Kolben und den Zustand der Zellen in PA6 DA neuronalen Differenzierung Medium (Tabelle Materialien) 24 Stunden vor der Differenzierung. </li><li> Übertragen der Kapseln in einen 50 ml-Zentrifugenröhrchen und es ihnen ermöglichen, in den Boden des Rohrs zu regeln. </li><li> Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Kapseln in PA6 Zelle klimatisierte DA neuronalen Differenzierung Medium. </li><li> Kultur der gekapselte hESC mit der PA6 Zellmonolayer (9 x 10 6 hESCs pro 7,5 x 10 5 PA6-Zellen) für 28 Tage mit einem Medienwechsel an Tag 4 und jeden zweiten Tag danach (ändern nur die Hälfte des Mediums jedes Mal). </li><li> Nach 3 Wochen in Kultur mit PA6-Zellen, zu ergänzen, die neurale Differenzierung DA-Medium mit 100 ng / ml SHH und 100 ng / ml FGF8a für die restliche Woche. </li&gt; </ol> 9. Decapsulation von Encapsulated hESC <ol><li> Saugen Sie die Kapseln in einem 15 ml-Zentrifugenröhrchen und es ihnen ermöglichen, am Boden des Röhrchens zu begleichen. Dann vorsichtig den Überstand verwerfen. </li><li> Waschen Sie die Kapseln mit D-PBS zweimal. Lassen Sie die Kapseln am Boden des Röhrchens absetzen entfernen Sie dann den Überstand. </li><li> 5 ml decapsulating Lösung für die Kapseln. Mischen Sie die Suspension gründlich durch Absaugen vor der Inkubation bei Raumtemperatur für 4-5 min. </li><li> Zentrifugieren Sie die nebennierenlosen Zellen bei 95 xg für 3 min und den Überstand verwerfen. </li><li> Waschen des Zellpellets mit D-PBS, gefolgt von Zentrifugation bei 95 × g für 3 min. Wiederholen. </li><li> Die nebennierenlosen Zellen können weiter kultiviert als Mono-oder verwendet für Downstream-Analyse. </li></ol> 10. Repräsentative Ergebnisse Der Durchmesser der Alginat-Mikrokapseln ist 400-500 um. Die Anzahl der Zellen innerhalb der Kapsel war eine Schätzung dered durch Berechnen der Gesamtzahl der Zellen durch die Gesamtzahl von Kapseln pro Lauf unterteilt. Daher wurden etwa 5,0 × 10 4 Zellen pro Kapsel geschätzt. Daraus gehen wir davon aus, dass die maximale Anzahl von Zellen kann die Kapsel enthalten etwa 1,0 x 10 5 ist. Die Lebensfähigkeit der verkapselten hESC ist&gt; 80% (Abbildung 2) wie durch Verwendung Carboxyfluoresceindiacetat succinimidly Ester (CFDA) / Propidiumiodid (PI)-Assay bestimmt. Wir haben die Bedingungen von HES-Kapselung durch eine Verringerung der Alginat-Konzentration von 2,2% auf 1,1% gesunken und durch Änderung der Fällbad von Bariumchlorid zu Calciumchlorid optimiert. Von diesen Bedingungen haben wir gezeigt, dass nur die Zellen, die mit 1,1% Calciumalginat verkapselt waren, konnten überleben, vermehren sich und bilden EBs in vitro ein. Zur weiteren Optimierung der Bedingungen, die Auswirkungen von Kulturmedien und RI, Y-27632 wurden untersucht. Die Daten, wie in Abbildung 2 und 3 zeigen, dass die präsentierte RI Prévented Dissoziation-induzierten Apoptose und die Lebensfähigkeit der Zellen aufrecht erhalten und gefördert Clusterbildung 1,6. Außerdem war die Lebensfähigkeit der verkapselten hESC in HFF-CM + RI kultiviert deutlich höher als andere Gruppen ohne RI-Supplementierung, aber das war nicht signifikant unterschiedlich zu gekapselten hESC in SR + RI kultiviert. In ähnlicher Weise erhöhte Zellproliferation mit BrdU-Assay von 25% bis 75% als einzelne Zellen in Cluster (3), entwickelt. Apoptoseassay durch TUNEL zeigte, dass die einzelnen Zellen in Mikrokapseln in der SR-Medium apoptotischen waren (Daten nicht gezeigt), während die abgerufenen Cluster der HFF-CM waren überwiegend negativ für TUNEL. Bis zu einem gewissen Ausmaß, HFF-CM mit bFGF ergänzt gefördert das Überleben und die Proliferation von eingekapselten HES in Abwesenheit von Y-27632. Die Behandlung mit Y-27632 vor (2 Stunden) und nach der Verkapselung (für weitere 4 Tage) deutlich verbesserte Lebensfähigkeit, der Vermehrung und Clusterbildung von verkapselten hESCin 1,1% Calcium-Alginat-Mikrokapseln. Bisher haben wir gezeigt, dass gekapselten hESC erfolgreich auf definitive Entoderm 1 unterschieden werden. Hier untersuchten wir die Anwendung der Verkapselung von Zellen als 3D-Plattform, um gekapselte hESC in DA-Neuronen zu differenzieren. hESC, die Embryoidkörpern (EB) in Kapseln gebildet waren direkte differenzierte und auf Entkapselung unter den beschriebenen Bedingungen zeigten eine progressive neuronale Morphologie (Abbildung 4) nach 2-3 Tagen Kultur mit mehr als 90% Lebensfähigkeit. Genexpressionsanalysen zeigten eine Down-Regulation von pluripotenten Marker, während OCT4 neuroprogenitor Marker, PAX6 und DA neuronalen Marker, TH wurden nach 7 Tagen der Differenzierung (5A) hochreguliert. Immunfluoreszenz-Färbung zeigte, dass differenzierte HES PAX6-positiv (&gt; 80%), aber OCT4-negativ waren am Tag 7. Weitere differenzierte hES zeigte TH-positiv (&gt; 90%) Neuronen nach 21 Tagen (Abbildung 5B). Western-Blot-Analyse zeigte auch,eine Hochregulation der Expression TH ab Tag 14 (5C), während PAX6 Expression wurde nach Tag 21 nach unten reguliert. Im Vergleich dazu die Zellen unter zweidimensionalen (2D)-Umgebung unter ähnlichen Bedingungen kultiviert (zB RI Vorbehandlung für 2 Stunden und RI Nachbehandlung für 3 Tage vor der Differenzierung) gehalten einen hohen Prozentsatz von Pax6-positiven Zellen (&gt; 80 %) während der Differenzierung und Zeit waren nicht so effizient bei der Differenzierung zu TH-positiven Zellen (&lt;60%) wie in 3D-Umgebung durch Kapselung (5A und C) zur Verfügung gestellt.

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	<li>Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+microcapsule+for+propagation+and+directed+differentiation+of+hESCs+to+definitive+endoderm.">Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm.</a> Biomaterials. 31, 505-514 (2010).</li><li>Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+encapsulated+embryonic+stem+cells+after+transplantation.">Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation.</a> Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).</li><li>Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+benefit+of+human+embryonic+stem+cell+encapsulation+for+prolonged+feeder-free+maintenance.">The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance.</a> Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).</li><li>Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+for+stem+cell+differentiation.">Biomaterials for stem cell differentiation.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).</li><li>Orive, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+encapsulation:+promise+and+progress.">Cell encapsulation: promise and progress.</a> Nat. Med. 9, 104-107 (2003).</li><li>Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li><li>Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled,+scalable+embryonic+stem+cell+differentiation+culture.">Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture.</a> Stem Cells. 22, 275-282 (2004).</li><li>Drukker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+expression+of+MHC+proteins+in+human+embryonic+stem+cells.">Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).</li><li>Calafiore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+Technical+Procedures+for+Microencapsulation+of+Human+Islets+for+Graft+into+Nonimmunosuppressed+Patients+With+Type+1+Diabetes+Mellitus.">Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus.</a> Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).</li><li>Cho, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).</li><li>Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+stromal-derived+inducing+activity+in+the+generation+of+dopaminergic+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Mehrere Studien mit embryonalen Stammzellen der Maus und menschlichen embryonalen Stammzellen haben die Vorteile der 3D-Kultur-System in den Bereichen Biomaterialien und Tissue Engineering 2,3 demonstriert. Wir verwendeten Kalzium-Alginat-Mikrokapseln als eine geeignete Plattform, um 3D-Vermehrung und Differenzierung embryonaler Stammzellen im Vergleich zu Barium-Alginat studieren seit hESC zeigten signifikant höhere Rentabilität als in Calciumalginat als Barium-Alginat verkapselt. Diese Kultur System ermö...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Hinweise </td></tr><tr><td> Alginat (Pronova UP MVG) </td><td> NovoMatrix </td><td> 4200101 </td><td> hohe Glucuronsäure Gehalt ≥ 60%, Viskosität&gt; 200 mPa s, und Endotoxin &lt;100 EU / g </td></tr><tr><td> Gelatine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890-100G </td><td></td></tr><tr><td> 0,9% NaCl </td><td> Baxter Healthcare </td><td> AHF7123 </td><td></td></tr><tr><td> Typ J1 Wulst Generator </td><td> Nisco Engineering Inc </td><td> SPA-0447 </td><td></td></tr><tr><td> Multi-Phaser Spritzenpumpe </td><td> New Era Pump Systems Inc </td><td> Modell NE-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Ezi-Flow-Medical-Durchflussmesser </td><td> Gascon-Systeme</td><td> G0149 </td><td></td></tr><tr><td> Y-27632 </td><td> Merck </td><td> 688000 </td><td></td></tr><tr><td> Human Serum Albumin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4327-1G </td><td></td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Millipore </td><td> SCR005 </td><td></td></tr><tr><td> 14G x 2 &quot;IV-Katheter </td><td> Terumo </td><td> SR-OX1451C </td><td></td></tr><tr><td> Knockout-DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 10829-018 </td><td> Für SR mittel (basal) </td></tr><tr><td> Glutamax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> Für SR Medium (2 mM) </td></tr><tr><td> Knockout Serumersatz </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> Für SR-Medium (20%) </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td><td> Für SR-Medium (2,5 U / ml) </td&gt; </tr><tr><td> Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) </td><td> Invitrogen </td><td> 41400045 </td><td> Für SR Medium (1x) </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td> Für SR-Medium (0,1 mM) </td></tr><tr><td> MEM NEAA Lösung </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> Für SR Medium (5 mM) </td></tr><tr><td> Glasgow Minimum Essential Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 11710035 </td><td> Für DA neuronalen Differenzierung mittel (basal) </td></tr><tr><td> Knockout Serumersatz </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> Für DA neuronalen Differenzierung Medium (10%) </td></tr><tr><td> Natriumpyruvat </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td> Für DA neuronalen Differenzierung Medium (1 mM) </td></tr><tr><td> MEM NEAA Lösung </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> Für DA nEURAL Differenzierungsmedium (0,1 mM) </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td> Für DA neuronalen Differenzierung Medium (0,1 mM) </td></tr><tr><td> Sonic Hedgehog (SHH) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1314-SH-025/CF </td><td> Für DA neuronalen Differenzierung (100 ng / ml) </td></tr><tr><td> Fibroblasten-Wachstumsfaktor 8a (FGF8a) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 4745-F8-050 </td><td> Für DA neuronalen Differenzierung (100 ng / ml) </td></tr></tbody></table>

alginate microcapsule as a 3d platform for propagation and differentiation of human embryonic stem cells (hesc) to different lineages

Menschliche embryonale Stammzellen (hES) werden als attraktive Alternative Quelle für Zellersatztherapie Schwellenländern, da sie in der Kultur erweitert werden kann, auf unbestimmte Zeit und unterschieden werden, um alle Zelltypen des Körpers. Verschiedene Arten von Biomaterialien wurden auch in Stammzellkulturen verwendet worden, um eine Mikroumgebung imitiert die Stammzellnische 1-3 bereitzustellen. Letzteres ist für die Förderung von Zelle-zu-Zell-Wechselwirkung, Zell-Proliferation und Differenzierung in spezifische Linien als auch Gewebe, unter Angabe eines dreidimensionalen (3D) Umgebung 4 wie Kapselung wichtig. Das Prinzip der Verkapselung von Zellen umfasst Einfangen von lebenden Zellen innerhalb der Grenzen der semipermeablen Membranen in 3D-Kulturen 2. Diese Membranen können für den Austausch von Nährstoffen, Sauerstoff und Impulse über die Membranen, während Antikörper und Immun-Zellen aus dem Wirt, der größer als der Kapsel Porengröße 5 sind ausgeschlossen. Hier vorab wirschickte einen Ansatz zur Kultur und zu differenzieren hESC DA-Neuronen in einer 3D-Mikroumgebung mit Alginat-Mikrokapseln. Wir haben uns verändert den Kulturbedingungen 2, um die Lebensfähigkeit der verkapselten hESC verbessern. Wir haben zuvor gezeigt, dass die Zugabe von p160-Rho-assoziierte Coiled-Coil-Kinase (ROCK)-Inhibitor, Y-27632 und menschliche fetale Fibroblast-konditionierten Mediums Serumersatz (HFF-CM) an die 3D-Plattform signifikant erhöht die Lebensfähigkeit der eingekapselten HES in dem die Zellen exprimiert endgültigen Endoderm Markergene 1. Wir haben nun diese 3D-Plattform für die Vermehrung von menschlichen embryonalen Stammzellen und effiziente Differenzierung zu DA-Neuronen verwendet. Protein-und Genexpressionsanalysen nach der letzten Stufe der DA neuronalen Differenzierung zeigte eine erhöhte Expression von Tyrosin-Hydroxylase (TH), ein Marker für die DA-Neuronen,&gt; 100 Falten nach 2 Wochen. Wir stellten die Hypothese, dass unsere 3D-Plattform mit Alginat-Mikrokapseln kann nützlich sein, um die Proliferation zu studieren und gerichtete Differenzierungvon HES auf verschiedenen Linien. Das 3D-System erlaubt auch die Trennung von Feeder-Zellen aus hES während des Prozesses der Differenzierung und hat auch Potenzial für Immun-Isolierung während der Transplantation in der Zukunft.

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Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Wir haben eine Mikroverkapselung Technik als eine effektive Plattform für 3D-Vermehrung und Differenzierung embryonaler Stammzellen zu Endoderm und dopaminerge (DA) Neurone optimiert. Es bietet auch eine Chance für Immun-Isolierung von Zellen aus dem Wirt während der Transplantation. Diese Plattform kann für andere Zelltypen angepasst werden.

Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

16.2K Aufrufe.  The University of New South Wales. Wir haben eine Mikroverkapselung Technik als eine effektive Plattform für 3D-Vermehrung und Differenzierung embryonaler Stammzellen zu Endoderm und dopaminerge (DA) Neurone optimiert. Es bietet auch eine Chance für Immun-Isolierung von Zellen aus dem Wirt während der Transplantation. Diese Plattform kann für andere Zelltypen angepasst werden.

Serie: Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

Rotierende Cell Culture Systems für Human Cell Culture: Human Trophoblastzellen als Modell

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Forschung

Biotechnik

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Entwicklung, Erweiterung und<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Zellzusammendrücken als Robust, Mikrofluidik Intrazelluläre Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Bestellen Einzelzellen und Einzel Embryos in 3D Confinement: Ein neues Gerät für High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Layered Alginate Konstrukten: Eine Plattform für Co-Kultur von heterogenen Zellpopulationen

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

Eine Kulturmethode zur Erhaltung von quiescent Human Hematopoietic Stammzellen

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles has emerged as an effective method to transiently and locally increase the permeability of the BBB, facilitating para- and transcellular transport of drugs across the BBB. Imaging the vasculature during ultrasound-microbubble treatment will provide valuable and novel insights on the mechanisms and dynamics of ultrasound-microbubble treatments in the brain.
Here, we present an experimental procedure for intravital multiphoton microscopy using a cranial window aligned with a ring transducer and a 20x objective lens. This set-up enables high spatial and temporal resolution imaging of the brain during ultrasound-microbubble treatments. Optical access to the brain is obtained via an open-skull cranial window. Briefly, a 3-4 mm diameter piece of the skull is removed, and the exposed area of the brain is sealed with a glass coverslip. A 0.82 MHz ring transducer, which is attached to a second glass coverslip, is mounted on top. Agarose (1% w/v) is used between the coverslip of the transducer and the coverslip covering the cranial window to prevent air bubbles, which impede ultrasound propagation. When sterile surgery procedures and anti-inflammatory measures are taken, ultrasound-microbubble treatments and imaging sessions can be performed repeatedly over several weeks. Fluorescent dextran conjugates are injected intravenously to visualize the vasculature and quantify ultrasound-microbubble induced effects (e.g., leakage kinetics, vascular changes). This paper describes the cranial window placement, ring transducer placement, imaging procedure, common troubleshooting steps, as well as advantages and limitations of the method.

This protocol describes the surgical and technical procedures that enable real-time in vivo multiphoton fluorescence imaging of the rodent brain during focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability.

Intravitale Multiphotonenmikroskopie in Echtzeit zur Visualisierung fokussierter Ultraschall- und Mikroblasenbehandlungen zur Erhöhung der Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. These include the limited number of cadaveric pancreas donors and the long-term use of immunosuppressants. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been considered to be a potential candidate as an alternative source of islet-like cell generation. Our previous reports have successfully illustrated the establishment of induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) to insulin-producing cells (IPCs). However, the induction efficiency varied greatly. In this paper, we demonstrate the comparison of hDPSCs pancreatic induction efficiency via integrative (microenvironmental and genetic manipulation) and non-integrative (microenvironmental manipulation) induction protocols for delivering hDPSC-derived IPCs (hDPSC-IPCs). The results suggest distinct induction efficiency for both the induction approaches in terms of 3-dimensional colony structure, yield, pancreatic mRNA markers, and functional property upon multi-dosage glucose challenge. These findings will support the future establishment of a clinically applicable IPCs and pancreatic lineage production platform.

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

This protocol presents a comparison between two different induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) toward pancreatic lineages in vitro: the integrative protocol and the non-integrative protocol. The integrative protocol generates more insulin producing cells (IPCs).

In vitro Induktion von menschlichen Zellpulpa-Stammzellen in Pankreaslinien

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...