Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, Stammzellkolonien auf Hydrogelen mit vollständiger Kontrolle über die Steifigkeit des Hydrogels und die Geometrie der Kolonien zu kultitoren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es Forschern ermöglicht, Stammzellkolonien unter Bedingungen zu kultiieren, die die physiologische Umgebung besser imitieren als Gewebekultur-Kunststoff. Achten Sie bei der ersten Durchführung dieses Protokolls darauf, ein paar zusätzliche Stellmittel für jedes Material zu generieren und einen fluoreszierenden Liganden zu verwenden, damit Sie bei jedem Schritt Fehler beheben und optimieren können.
Diese Technik umfasst mehrere Schritte, die die präzise Positionierung verschiedener Materialien beinhalten. Es ist viel einfacher, die schriftlichen Anweisungen für dieses Protokoll zu verstehen, sobald Sie gesehen haben, dass es ausgeführt wurde. Um dieses Verfahren zu beginnen, mischen Sie PDMS-Basis mit PDMS-Härtungsmittel in einem Verhältnis von 10 zu eins nach Gewicht und mischen Sie gründlich.
Entgasen Sie diese Mischung in einem Trockengrund für 30 bis 60 Minuten oder bis alle Luftblasen entfernt sind. Die PDMS-Mischung langsam und gleichmäßig über die Oberfläche des vorbereiteten Wafers gießen. Tippen Sie auf die Schale auf der Arbeitsfläche, um Luftblasen von der Oberfläche des Wafers zu lösen.
Backen Sie das PDMS bei 70 Grad Celsius für zwei Stunden und lassen Sie es auf Raumtemperatur abkühlen. Schneiden Sie dann das PDMS in etwa 10 mal 10 Millimeter Quadrate, die jeweils die Merkmale für einen einzigen versuchsweise Zustand enthalten. Diese werden als Stempel für den Rest des Protokolls bezeichnet.
Danach PDMS-Basis mit PDMS-Härtungsmittel im Verhältnis von acht zu eins nach Gewicht mischen und gründlich mischen. Entgasen Sie das Gemisch in einem Trockenturm für 30 bis 60 Minuten oder bis alle Luftblasen entfernt sind. Als nächstes gießen Sie das PDMS langsam und gleichmäßig in eine saubere 100-Millimeter-Schale.
Tippen Sie auf die Schale auf der Arbeitsfläche, um Luftblasen zu lösen. Backen Sie das PDMS bei 70 Grad Celsius für zwei Stunden und lassen Sie es auf Raumtemperatur abkühlen. Schneiden Sie für jeden zuvor erzeugten Stempel ein Quadrat von 15 mal 15 Millimetern PDMS.
Diese werden für den Rest des Protokolls als Flachplatten bezeichnet. Invertieren Sie jeden erzeugten Stempel auf eine flache Platte von PDMS, so dass die Features auf dem Ständer für in Kontakt mit einer flachen Platte von PDMS. Drücken Sie vorsichtig auf die Oberseite des Stempels mit Zangen, um einen gleichmäßigen Kontakt zu gewährleisten.
Als nächstes legen Sie einen kleinen Tropfen UV-härtendes Polymer an die obere Schnittstelle jedes Stempel- und Plattenpaares. Das Polymer wird zwischen den beiden durch Oberflächenspannung durch Schwerkraft unterstützt böse sein. Legen Sie einen kleinen Tropfen des UV-härtenden Polymers an die Ränder der Stempel- und Plattenschnittstelle.
Dadurch wird ein Rahmen erstellt, der die Ligandenlösung hält. Dann legen Sie den Stempel vorsichtig und schlagen Paare in eine UV-Sterilisationsbox. Verwenden Sie die sterile STR-Leistungseinstellung und legen Sie 10 Minuten frei.
Danach entfernen Sie die Paare aus der UV-Sterilisationsbox und verwenden Sie zwei Zangenpaare, um den Stempel vorsichtig zu entfernen, während Sie die flache Platte und Schablone, die sich aus dem UV-härtenden Polymer gebildet haben, gedrückt halten. Entfernen Sie die Schablone mit Zangen vorsichtig und invertieren Sie sie so, dass die Oberfläche, die mit der flachen Platte von PDMS in Berührung kommt, nach oben gerichtet ist. Legen Sie die invertierten Schablonen wieder in die UV-Sterilisationsbox.
Verwenden Sie die sterile STR-Leistungseinstellung und legen Sie sie drei Minuten lang frei. Mit Zangen, legen Sie sorgfältig jede Schablone flache Seite nach unten auf eine Säure gewaschen Abdeckungschlupf, um sicherzustellen, dass die Funktionen auf dem Deckel-Slip zentriert sind. Legen Sie ein kleines Stück Laborfolie auf jede Schablone.
Drücken Sie fest und gleichmäßig auf die Schablone, um einen starken Kontakt zwischen der Schablone und dem Coverslip herzustellen. Legen Sie die Deckelschlüpfer mit Schablonen in eine Schüssel. Legen Sie diese Schale in einen Plasmareiniger und wenden Sie Hochleistungsplasma für 30 Sekunden auf.
Dann pipette die Ligandenlösung auf die Oberfläche jeder Schablone. Für Schablonen aus 10 mal 10 Millimeter quadratischen Stempeln 100 Mikroliter pro Schablone auftragen. Danach die Schale mit den Deckelschlüpfern in Laborfolie wickeln und über Nacht bei vier Grad Celsius brüten.
Waschen Sie zunächst den Deckelmitschablon mit Schablone, indem Sie Zangen verwenden, um ihn kurz in eine Schüssel mit sterilem PBS zu tauchen. Untertauchen Sie den Deckelmitschablon enden mit Schablone in eine zweite Stufe von PBS, um ihn wieder zu waschen. Entfernen Sie die Schablone von der Oberfläche des Deckels, wobei Sie darauf achten, den Abdeckzettel nicht zu brechen.
Als nächstes tauchen Sie den Deckelrutsch kurz in eine Schüssel mit reinem Wasser, um Salze aus den PBS-Wäschen zu entfernen. Berühren Sie die Kante des Deckelslipzufahrt zu einem empfindlichen Aufgabenwisch, um überschüssiges Wasser abzuleiten. Trocknen Sie den Deckel schlupf unter einem inerten Gas wie Stickstoff.
Bereiten Sie dann eine Polyacrylamidlösung vor, um die gewünschte Hydrogelelastizität zu erhalten. Für jeden gemusterten Coverslip, bereiten Sie eine Glutaraldehyd aktiviert Boden bedeckt Lippe mit einem Abstandsraum auf der Oberseite platziert. Pipette zwischen 75 und 150 Mikroliter Polyacrylamidlösung in der Mitte jedes Glutaraldehyd aktivierten Deckelrutsches.
Mit Zangen legen Sie einen gemusterten Schlupf auf jede Glutaraldehyd aktiviert Abdeckungen rutschen mit Polyacrylamid und Abstandsgeber, so dass der gemusterte Liganden zeigt sich der Polyacrylamid-Lösung. Legen Sie jedes Polyacrylamid-Sandwich vorsichtig in einen Kappenhalter mit Gewinden, die mit 15 Milliliter konischen Bodenrohren kompatibel sind. Schrauben Sie ein 15 Milliliter konisches Unterrohr in jeden Kappenhalter, um die Polyacrylamid-Sandwiches an Ort und Stelle zu halten.
Zentrifuge zu Polyacrylamid-Sandwiches in den Rohren in Schwenkeimern bei 200-fachem G für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Rohre aus der Zentrifuge und legen Sie sie in Rohrregale, um die Orientierung für weitere 50 Minuten zu halten, um eine vollständige Polymerisation zu gewährleisten. Entfernen Sie dann die Sandwiches aus den Rohren und tauchen Sie sie in PBS ein.
Die Schale in Laborfolie wickeln und bei Raumtemperatur drei Stunden oder über Nacht bei vier Grad Celsius brüten. Danach verwenden Sie ein Skalpell und Zange, um vorsichtig das Muster zu entfernen, um Slips und den Abstandsraum aus dem Polyacrylamid-Sandwich zu bedecken, während er in PBS versunken bleibt. Platzieren Sie jeden Deckelrutsch mit gemusterten Polyacrylamid in einen Kappenhalter.
Dichtungsort auf der Oberseite des Deckels und um das Polyacrylamid, wo sich der Abstandser befand. Schrauben Sie ein abgesästes 15 Millimeter konisches Unterrohr in den Kappenhalter und bilden einen Brunnen mit dem gemusterten Polyacrylamid an der Unterseite. Diese Baugruppen passen für eine einfache Handhabung in die Bohrungen einer Standard 12 Wellplatte.
Verwenden Sie bei dieser Technik einen fluoreszierenden Liganden, um sicherzustellen, dass das gewünschte Muster auf der Oberfläche des Glasdeckelschlupfes entsteht und während der Polymerisation erfolgreich auf die Oberfläche des Polyacrylamidhydrogels übertragen wird. Das ultimative Erfolgsmaß für diese Methode ist die Fähigkeit, hESCs in gewünschten Geometrien auf den gemusterten Hydrogelen zu kultitonischen. Wenn die hESCs wie im Textprotokoll beschrieben kultiviert werden, vermehren sie sich in der Regel, um die gemusterten Geometrien um 48 bis 72 Stunden abzuschließen, sobald der Y27632 vollständig aus dem Medium entfernt wurde.
Die Kultivierung von hESC-Kolonien in begrenzten Geometrien auf Polyacrylamid-Hydrogelen ermöglicht die Messung zellgenerierter Traktionskräfte mittels Traktionskraftmikroskopie. Diese Messungen werden durch Einbettung von Fluoreszenzmikrosphären in das Hydrogel und Bildgebung der Positionen dieser Perlen vor und nach der Aussaat von hESCs durchgeführt. Die Bilder der Perlenpositionen können verwendet werden, um Karten von Perlenverschiebungen zu erzeugen, die anschließend zur Berechnung der zugrunde liegenden Traktionsspannungen verwendet werden können.
In kreisförmigen Kolonien von hESCs finden sich die größten Traktionsspannungen in der Nähe des randnahen Rands der Kolonien, während das Zentrum der Kolonien gleichmäßig niedrige Zugspannungen aufweisen. Trotz der beobachteten ungleichmäßigen Verteilungen von Traktionsspannungen zeigen hESCs, die als gemusterte Kreise unter Wartungsbedingungen kultiviert werden, eine einheitliche Expression des Pluripotenzmarkers Okt 3/4 und des Zelladhäsionsmoleküls E-Cadherin. Diese Technik wird es Forschern ermöglichen, menschliche Embryonen mithilfe menschlicher embryonaler Stammzellen besser zu modellieren, was letztlich zu wichtigen Erkenntnissen über die Entwicklung des Menschen führt.
Dieses Verfahren kann für jede Anwendung angepasst werden, bei der ein Forscher darauf abzielt, Zellen in definierten Geometrien auf weichen Hydrogelen zu kultiieren. Dieses Verfahren ist mit den meisten biochemischen Säuren kompatibel und ermöglicht es Forschern, Fragen darüber zu beantworten, wie Dinge wie Gewebegeometrie und zellgenerierte Kräfte die Proteinexpression und Zellsignalisierung beeinflussen. Viele Forscher verwenden heute menschliche embryonale Stammzellen, um die frühe menschliche Entwicklung zu modellieren.
Diese Technik wird es Forschern ermöglichen, diese wichtigen Fragen unter Bedingungen zu beantworten, die eine physiologische Umgebung besser nachahmen.
