Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Knut und Alice Wallenberg-Stiftung unterstützt. Das gesamte Personal der Human Protein Atlas-Zentren in Uppsala, Stockholm und Indien sind für ihre Bemühungen, das Human Protein Atlas erzeugen anerkannt. Die Autoren möchten besonders danken Frank Hammar und Sofie Gustafsson für die Unterstützung bei der Fotos und Elene Karlberg für die Unterstützung bei der TMA-Produktion beim Filmen.

1. Wie man Gewebe für Tissue Microarray Produktion vorzubereiten (Animation 1) <ol><li> Wählen Sie relevanten Formalin-fixierten Paraffin eingebetteten Material (Gewebe-oder Zellproben) einschließlich entsprechender Hämatoxylin gefärbter Gewebeschnitt. </li><li> Markieren Sie relevanten Bereich auf dem Gewebeschnitt. Es wird empfohlen, einen frisch geschnittenen Hämatoxylin Schnitt entsprechend der Paraffin-Block haben. </li><li> Gestalten Sie die Vorlage für die TMA-Produktion verwendet. Randomize die Proben in der Vorlage, um Artefakte durch technische Probleme wie zum Beispiel Abdeckung des Antikörpers über den gesamten Abschnitt TMA und Schneiden Probleme zu vermeiden. Fügen Sie zusätzliche Marker Orientierung an der Vorlage zur Orientierung. </li><li> Organisieren Sie die Gewebe nach der Vorlage. </li></ol> 2. Manuelle Gewebe-Mikroarray Produktion (wesentlich für Dreharbeiten) <ol><li> Um eine einheitliche Länge der Gewebe-Kerne zu erhalten, markieren Sie den Mandrin zB 4,5 mm (Abbildung 2). GuidelInes für Abstand zwischen Probe-Zentren: Kerngröße 0,6 mm - 0,8 bis 1,0 mm Kerngröße 1,0 mm - 1,8 bis 2,0 mm Kerngröße 1,5 mm - 2,0 bis 3,0 mm Kerngröße 2,0 mm - 2,5 bis 4,0 mm Es wird empfohlen, 2,5 bis 3,0 mm-Rändern auf jeder Seite des Paraffin-Blocks verlassen, um Rissbildung des Paraffins. </li><li><ol class="lalpha"><li> Montieren Sie die ausgewählten Schläge verwendet werden. Starten Sie durch Lösen der Innensechskant Schrauben, die den Stempel in Position hält. Der Stempel korrekt positioniert ist, wenn die Nut des Stempels Nabe fest gegen die Metallstange in der Kunststoff-V-Block angeordnet. Ziehen Sie die Schrauben und stellen Sie sicher, dass der Rand des Metall-Clip horizontal ist. </li><li> Der Empfänger Punsch (grün markiert und rot, die spezifisch für Händler) sollte auf der linken Seite platziert werden. Die Spenderstanze (markiert mit Grün und Blau, die spezifisch für Distributor), die einen geringfügig größeren Durchmesser hat, sollte auf der rechten Seite platziert werden (Abb. 3). </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> Verschieben Sie die Schläge entlang der x-und y-Achsen mit Hilfe der XY-Einstellknöpfe. Die richtige Ausrichtung Knopf bewegt die Stempel entlang der x-Achse und der linke Verstellknopf bewegt die Stempel entlang der y-Achse. Es gibt ein digitales Mikrometer Anzeige auf beiden Einstellknöpfe. Diese werden aktiviert, wenn die Knöpfe bewegen. </li><li> Zurücksetzen → drücken Sie die ZERO / ABS-Taste. Umschalttaste zwischen Zoll und mm → Drücken Sie die IN / mm drücken. Der Raum zwischen den Löchern sollte 2,0 mm (gemessen zwischen den Zentren der Löcher) bei Verwendung einer 1 mm Stempels für einen 9x8-Vorlage. </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> Um sicherzustellen, dass Sie nicht drücken Sie den Stempel zu weit nach unten in den Block, Schlagen Sie die Kassette und die Zerstörung der Punsch, lege eine Kassette ohne Paraffin in der Halterung und stellen Sie die untere Position des Empfängers Punsch bis 1 mm über dem Boden der Kassette mit der Tiefe an der Anschlagschraubeoberen linken Ecke des Z-Führung (Abbildung 3). </li><li> Legen Sie die Empfänger-Block in der Halterung und verwenden Sie den kleinsten Schraubendreher, um die Schrauben zu befestigen. Sind die Schrauben nicht zu eng oder das Paraffin könnte ausbrechen aus der Kassette. </li><li> Schieben Sie den Empfänger Punsch nach unten ca. 5 mm in den Empfänger-Block und mit dem Handgriff in der Stanze, um den Stempel hin und her drehen, einmal (Abbildung 3). Das Loch wird 5 mm tief beim Schieben des Stempels so weit unten in den Block wie möglich. </li><li> Entlasten Sie den Druck langsam nach unten schieben, so dass die Federn kann der Stempel nach oben. Verwenden Sie den Führungsstab der Locherabfall und entsorgen Sie die Paraffin-Kern. </li></ol></li><li> Bewegen Sie den Revolver in der Spenderstanze (Abbildung 3) zu wechseln. </li><li> Platzieren Sie die Donorblock Brücke mit dem Donorblock über dem Empfängerblock (Abb. 3). </li><li><ol class="lalpha"><li> Schieben Sie den Spender punch in den ausgewählten Bereich des Donorblocks. Verwenden Sie einen entsprechenden Hämatoxylin und Eosin gefärbten Objektträger, wo die Region von Interesse markiert wurde, um das Gewebe, die zu beproben als es zu lokalisieren. Manuelles Halten Sie die Donorblock in Position mit der linken Hand und drücken Sie den Stempel mit der rechten Hand. Beachten Sie, dass Sie sollten nicht auf dem Stilett zu schieben. Der Tiefenanschlag blockiert nicht den Stempel Bewegung an der richtigen Position für den Spender-Block, so ist es wichtig, dass Sie aufhören zu drängen, wenn das zweite Zeichen ist sichtbar auf dem Stilett. </li><li> Drehen Sie den Griff auf dem Stempel einmal (Abbildung 3). Langsam den Druck nach unten während Sie die Halterung auf der Donorblock Donorblock Brücke. </li><li> Das Spendergewebe wird vorzugsweise 0,5 mm kürzer als der Empfänger Kern ausgestanzt. Dieser Prozess wird eine einstellbare Ausrichtung der Kerne auf dem Empfängerblock Oberfläche zu gewährleisten, zu vermeiden Verlust wertvoller repräsentativen Gewebe. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Brücke und die Donorblock. Machensicher, dass die Spenderstanze mit dem Loch, das früher gemacht wurde (Punkt 4) ausgerichtet ist. Sie müssen passen Sie die Lochposition mit den Stellschrauben, wenn der Spender Punsch und das Loch in der Empfänger-Block nicht ausgerichtet sind. </li><li> Schieben Sie den Stempel nach unten, bis seine Spitze erreicht die Spitze des Loches in dem Empfänger-Block. Halten Sie diese Position, verwenden Sie den Mandrin, um das Gewebe Kern in das Loch zu leeren. Die Kernoberfläche sollte in Ausrichtung mit dem Block Fläche sein. </li><li> Bewegen Sie den Revolver zurück an den Empfänger Punsch. </li><li> Bewegen Sie die nächste Position mit den XY-Einstellknöpfe. </li><li> Wiederholen von Punkt 4c oben, bis das Array abgeschlossen ist. </li><li> Wenn die ganze Rezipientenblock beendet ist, lösen Sie die Schrauben in den Empfänger-Halter. Backen Sie den Block in 42 ° C für 40 Minuten. Legen Sie den Block mit dem Schneiden Bereich nach unten auf einen Objektträger aus Glas. Legen Sie den Objektträger aus Glas mit dem Block auf der Spitze eines Probenröhrchenhalter (oder andere geeignete Konstruktion) und in ter Ofen. Nach dem Backen, entfernen Sie das Reagenzglas Halter aus dem Ofen und glätten die Oberfläche des Blocks durch sanftes Streicheln der Objektträger aus Glas. </li><li> Den Block mit dem Glasträger auf einer Kühlplatte für 10 Minuten. Um repräsentative Gewebe während der TMA gewährleisten eine Qualitätskontrolle auf jeder 50-jährigen Abschnitt durchgeführt wird. </li></ol> 3. Wie in Abschnitt TMAs (Animation 2) <ol><li> Schneiden Sie 4 um dicke Schnitte mit Hilfe eines Mikrotoms mit Abschnitt Transfer System (HM 355S, Microm). Das System kann mit allen gängigen Rotationsmikrotome verwendet werden. Das System besteht aus einem Schlitten mit integrierter Überladebrücke, einem erwärmten Wasserbad und einer Steuereinheit. Von der Klinge gleiten die Abschnitte auf der nassen Oberfläche Übertragung über einen Transfer Brücke in das Wasserbad. </li><li> Die Abschnitte sollen aus dem Wasserbad genommen werden unmittelbar nach ihrer ausgestreckt, um das Schmelzen von empfindlichem Gewebe Flecken (zB fetthaltiges Gewebe wie Brust und Gehirn) zu vermeiden. Place der Abschnitt auf einem SuperFrost Objektträger aus Glas. Die Zeit, die Abschnitte im Wasser verbleiben kann, hängt von der Art des Paraffin gewachst verwendet und die Wassertemperatur. Unser Labor Verwendung von Paraffin Histolab Products AB, das einen Schmelzpunkt von 56-58 ° C und wir empfehlen eine Wasserbadtemperatur von 37-39 ° C haben </li><li> Legen Sie die Folien in einer Diahalter für die Trocknung bei Raumtemperatur (RT) über Nacht. </li><li> Die Objektträger werden bei 50 ° C für 12-24 Stunden gebacken. Mit einem Mikrotom ohne STS müssen Sie den Abschnitt von der Klinge in ein Wasserbad manuell mit zB einer Bürste zu transportieren. </li></ol> 4. Test-und Titrationsverfahren zur Immunhistochemie (Animation 3) Jeder Antikörper an einem standardisierten Testverfahren unter Verwendung speziell gestalteter TMA, die eine Mischung von Geweben und Zelltypen unterzogen. Das Ziel ist es, eine individuelle und optimierte Immunfärbung Protokoll für jeden Antikörper zu bewerten. Zunächst eine Verdünnung, auf Basis von Ameiseibody Stoffkonzentration der dem primären Antikörper getestet. Das Ergebnis dieses Tests Färbung wird verwendet, um weitere Verdünnungen und Optimierung des Protokolls zu führen. <ol><li> Entparaffinierung und Rehydrierung in Xylol und abgestuften Ethanol zu destilliertem Wasser vor der Immunfärbung durchgeführt. </li><li> Eine Sperrung Schritt, um endogene Peroxidase zu stillen wird in 0,3% H 2 O 2 in 95% Ethanol für 5 Minuten durchgeführt. </li><li> Hitze Induzierte Epitop Wiedergewinnung (HIER) ist in einem Retrieval-Puffer pH 6 durchgeführt, mit einem Druckkessel (enttarnen Kammer Biocare Medical) als Wärmequelle für 4 Minuten bei 125 ° C Nach Abschluss Kochen, bleiben Folien in der Druck-Kessel und dürfen bis 90 ° C abkühlen Die gesamte Bearbeitungszeit für das HIER ist ca. 45 Minuten. </li><li> Wenn kein schlüssiges Ergebnis im ersten Test erhalten wird, werden weitere Tests auf der Basis der beobachteten Färbemuster 5 6 getan. Eine Pilotstudie, in der HPA High-Throughput-Set-up, zeigte, die die nützlichsten Antigen-Retrieval, wo HIER pH 6, aber auch andere Suchverfahren wie Pre-Inkubation mit Proteinase, Mikrowelle und siedet in Puffer mit höheren oder niedrigeren pH natürlich verwendet werden. Durch die Änderung der IHC Bedingung zB Wechsel Antikörper Inkubationszeiten, Antikörperverdünnungen und Diaminobenzidin (DAB) Inkubationszeiten das Färbungsmuster geben kann mehr schlüssige Ergebnisse. </li></ol> 5. Färbung Programm, Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific) Alle Inkubationen werden bei RT durchgeführt und dieses Protokoll kann auch in ein manuelles Setup mit den gleichen Reagenzien verwendet werden. <ol><li> Spülen in Waschpuffer. </li><li> Die Inkubation mit Ultra-V-Block für 5 Minuten. </li><li> Spülen in Waschpuffer. </li><li> Inkubation mit dem primären Antikörper für 30 Minuten. </li><li> Spülen in Waschpuffer (x2). </li><li> Inkubation mit Meerrettich-Peroxidase markierten-Polymer für 30 Minuten. </li><li> Spülen in Waschpuffer (x2). </li><li> Die Entwicklung in DAB-Lösungfür 10 Minuten. </li><li> Spülen in Waschpuffer (x2). </li><li> Gegenfärbung in Mayers Hämatoxylin für 5 Minuten *. Bei Verwendung eines progressiven Färbemethode (zB Mayers Hämatoxylin) Die Intensität hängt von Zeit und keine Differenzierung erforderlich ist. Eine regressive Färbemethode z. B. Harris Hämatoxylin erfordert Differenzierung, um überschüssige Farbstoff aus dem Gewebe zu entfernen, um eine Struktur akzentuieren. </li><li> Spülen in Leitungswasser *. </li><li> Spülen Sie in Lithiumcarbonat Wasser 1:5 verdünnt aus gesättigten Lösung für 1 Minute *. </li><li> Spülen in Leitungswasser für 5 Minuten *. </li><li> Die Folien sind dehydriert in abgestuften Ethanol und Dias werden mit einem Deckglas (PERTEX, Histolab) </li></ol> Alle Reagenzien werden bei einem Volumen von 300 ul pro Objektträger aufgetragen. * Die Schritte 10-14 werden in einem histostaining Instrument (Autostainer XL, Leica) getan und Eindecken ist zusätzlich in einem Eindecker-System (Automated Glas-Eindecker CV5030, Leica) durchgeführt. 6. Vorgehensweise beim Scannena Schieben Das Verfahren Scannen von Dias ist abhängig von der digitalen Scanner ausgenutzt wurde dieses Protokoll nur definiert, wie eine Folie über das automatisierte Scannen System Aperio XT (Aperio Technologies) zu scannen. In der Human Protein Atlas Aufbau 20-facher Vergrößerung für das Gewebe und 40x für die Zellen verwendet werden. Automatisiertes Scannen könnte auftreten Fokus-Probleme aufgrund der Heterogenität des Gewebes und die Anzahl der verschiedenen Geweben in einem TMA enthalten. <ol><li> Reinigen Sie den Objektträger aus Glas von Schmutz, Kleber und prüfen Sie, ob Luftblasen zwischen dem Deckglas und dem Abschnitt. Im Falle von Luftblasen remount der Schieber. </li><li> Legen Sie die Folie in einem Rack und legen die Zahnstange in der digitalen Scanner. Die Zeit, um einen TMA bei 20-facher Vergrößerung zu scannen beträgt ca. 6 Minuten. Eine Software von Aperio wird verwendet, um Interessengebiet auszuwählen. Fokuspunkt Auswahl wird automatisch in der Software gemacht. Manuelles Auswahl des Scan-Bereichs und Schwerpunkte ist ebenfalls möglich. </li><li> Nachdem das Bild hso generiert wurde, kann für die Auswertung und Kommentierung der IHC-Färbung verwendet werden. Die Bilder bleiben als Ergebnis des Experiments Datei und kann den Kollegen für Gespräche verteilt werden und weitere für die Veröffentlichung der Daten verwendet wird. Die Bilder können in einem frei verfügbaren Software durch Aperio angesehen werden. </li></ol> 7. Wie Sie für Ihre Lieblings-Protein in der Human Protein Atlas Suche <ol><li> Navigieren Sie zu <a href="http://www.proteinatlas.org." target="_blank">www.proteinatlas.org.</a> </li><li> Geben Sie den Namen Ihres Lieblings-Protein, Ensembl id, UniProt Zugangsnummer oder HGNC Namen zB Insulin. </li><li> Geben Sie die Übersichtsseite und scrollen Sie zum normalen Gewebe-und Organersatz Zusammenfassung. Die Übersicht zeigt die Proteinexpression in der Bauchspeicheldrüse. </li><li> Klicken Sie auf &quot;mehr Gewebe Daten&quot;. Sie betreten das normale Gewebe sehen, wo Sie sehen können alle Gewebe durch Orgel gehörten sortiert. </li><li> Klicken Sie auf Bauchspeicheldrüse, um die Ergebnisse für IHC 3-Antikörper auf das gleiche Protein gerichtet zu sehen. Um einen hallo ansehenGH-Auflösung von Pankreas Klick auf das Bild. </li><li> Zusätzliche Hinweise zur Proteinexpression in Krebsgewebe, Zellen und eine weitere Validierung von Daten innerhalb des Human Protein Atlas kann durch Durchsuchen des Human Protein Atlas Website gefunden werden. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse Animation 1. Wie man Gewebe für Gewebe-Mikroarray Produktion vorzubereiten. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_1_Web.mov" target="_blank">Klicken Sie hier um Animation 1 sehen</a> . Animation 2. Wie Abschnitt TMAs. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_2_Web.mov" target="_blank">Klicken Sie hier um Animation 2 anzuzeigen</a> . Animation 3. Die Immunhistochemie Technik beschrieben wird. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_3_Web.mov" target="_blank">Klicken Sie hier, um die Animation 3 sehen</a> .<img alt="1" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig1.jpg" /> Abbildung 1. Allgemeine Systematik des Prozesses innerhalb des Human Protein Atlas Uppsala. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig2.jpg" /> Abbildung 2. Donor Mandrin für standardisierte Länge von Gewebe Kerne markiert zB 4,5 mm. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig3.jpg" /> Abbildung 3. Manuelle Gewebe Microarrayer. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig4.jpg" /> Abbildung 4. Beispiele für unterschiedliche Qualität der produzierten TMAs. (A) eine gerade übereinander TMA mit ausreichend Platz zwischen den Zeilen und Spalten als auch an den Rand des Paraffins. (B) einer TMA mit einigen der Kerne zu nahe am Rand was wahrscheinlich Schwierigkeiten beim Schneiden zu schließen. (C) eine TMA, die seit t gebackenoo lange was zu einer eingestürzten TMA ohne die richtige Vorlage. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig5.jpg" /> Abbildung 5. Hämatoxylin und Eosin gefärbt TMAs. (A) Ein richtig geschnitten mit geradem Schnitt und ausgerichtet Spalten und Zeilen. Mit einem schlecht oder schmutzig Klinge konnte in Splitting (B) oder komprimierte Abschnitte (C) führen. <img alt="6" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig6.jpg" /> Abbildung 6. Titration von Antikörpern. (A) Reaktionszentrum Zellen in Lymphknoten zeigt eine optimal titriert Antikörper, was zu einer spezifischen zytoplasmatische (gezeigt in braun) ohne Hintergrund. (B) Der Gewebeschnitt zeigt schwache Färbung. Negative oder eine schwache Färbung gefunden wird, wenn die Konzentration des primären Antikörpers zu niedrig ist oder das Zielprotein nicht in den immunogefärbten Gewebe. (C) der Gewebeschnitt ist überfärbt aufgrund einer zu hohen Konzentration des primären Antikörpers zu verwenden. Das dArche Farbe führt zu Schwierigkeiten Bestimmung der subzellulären Ort durch überschwappen, Kreuzreaktivität und falsche Positivität.

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Immunhistochemie ist bei weitem am häufigsten verwendeten Anwendung für TMA. Die Kombination von IHC und TMA kann auf verschiedene Einstellungen verwendet werden, zB das Hochdurchsatz-Screening von Protein-Expressionsmuster in den Geweben und Zellen 7 8 9 10, die Entdeckung neuer Biomarker-Studien an Gewebeproben von vielen Patienten 11 12 und mehr grundlegende Tumorbiologie Studien, darunter verschiedene Phänotypen / Genotypen, Differenzierungsstadien, Progression und Metastasierung 13. Ein Vorteil der Verwendung TMAs ist, dass Material aus großen Kohorten auf einmal analysiert werden, beide spart wertvolle biologische Material und die Sicherstellung reproduzierbarer Experimente. Darüber hinaus spart der Einsatz von TMA-Technologie auf Kosten für Reagenzien und Laborgeräte Verarbeitungszeit. Als TMA enthält nur eine begrenzte Menge an Gewebe ist Gewebe Heterogenität ein Problem. Je nach der Art des Gewebes und Fragen beantwortet werden, können mehrere Proben aus der gleichen specime erforderlichn. Für Tumorgewebe ist die Verwendung von zwei bis vier Kerne aus jeder Probe zu empfehlen, da gezeigt wurde, dass in einem hohen Maß an Genauigkeit in der Darstellung der gesamten Gewebeschnitte 13 14 führen. Je nach Zusammensetzung des Gewebes der Durchmesser der Stempel (im Bereich von 0,6 mm bis 2 mm) einstellbar ist. Die Gewebe sind komplex und besteht aus den beiden verschiedenen Zelltypen, Strukturen und extrazelluläre Matrix. Zusammensetzung nach jedem unterschiedlichen Gewebetyp, die variable Menge an Fett, wird Blutgefäße, Bindegewebe, Knorpel, etc., auf die Druck zum Stanzen und zur getrennten Kernen benötigt. Es ist daher wichtig, alle Schritte in dem Verfahren auf Material, das nicht von Wert zu praktizieren, vor der Erstellung eines TMA mit definierten Gewebe für die Experimente bestimmt. Beim Schneiden einer Vielzahl von verschiedenen Geweben innerhalb eines TMA-Block die Zusammensetzung des Blocks beeinflussen könnte die Fähigkeit, qualitativ hochwertige Abschnitte zu erwerben. Certain Gewebe, zB Haut, Knochenmark-, Fett-, Hirn und Brust, machen der TMA-Block schwierig aufgrund der Auswirkungen von Unterschieden in der Textur zu bewirken, wie Abschnitte ausstrecken im Wasserbad Schneiden und wie unterschiedliche Härte wird durch die Klinge geschnitten usw. Es wird daher zur Gruppe Geweben mit ähnlichen Eigenschaften empfohlen zB Lipid-reiche Gewebe in ein TMA, wenn anwendbar. Die Mehrheit der Krebsgewebe sind in diesem Sinne homogen, erleichtert das Schneiden von Krebs TMAs. Eine alternative Schneiden Verfahren zur Stabilisierung der Mikroarray Kerne bei der Handhabung eines TMA mit heterogenen Arten von Geweben werden. Die Verwendung eines Klebebandes kann hilfreich sein, um den Verlust von Kernen und Fall-out in der Schnittdarstellung TMA zu vermeiden. Die Verwendung von Klebeband mit Vorsicht verwendet werden, da das Band der Dicke geschnittene Kerne beeinflussen können und anschließend auch das Ergebnis der immunhistochemischen Färbung 15. In der Human Protein Atlas Set-up eine TMA-Vorlage von 9x8 (ohne Markierungen) Kerne are verwendet. Es ist wichtig, um eine maximale Anzahl von Abschnitten zu erhalten und behalten alle Gewebe im gesamten Block dargestellt. Zum Scannen von Reagenzien und Zeit zu sparen, sind 2 Abschnitte auf einer Glasplatte mit einer maximalen Vorlage von 9x8 platziert. Der große Protein-Repository für Informationen, beinhaltet Universal-Protein-Ressourcen-16 etwa 20,300 bewertet menschlichen Protein-Einträge, von denen nur etwa 66% haben Hinweise auf Protein-Ebene. Auch für einen Großteil der Gene, für die es Beweise des Daseins auf der Protein-Ebene gibt es kaum oder keine Informationen über die Funktion des Proteins und die Verteilung des Ausdrucks. Eine wichtige Herausforderung für die Zukunft ist es, das Verteilungsmuster und die relative Häufigkeit dieser unbekannte Proteine ​​in verschiedenen Arten von menschlichem Gewebe zu analysieren. Die Informationen aus Datenbanken wie Uniprot, ENSEMBL veröffentlichte Daten von PubMed kann als Richtlinie verwendet werden, um festzustellen, ob immunhistochemische Färbung Muster mit Hilfe von Antikörpern zuStationen unbekannte Proteine ​​repräsentieren tatsächliche Protein-Profile der beabsichtigten Zielprotein. Darüber hinaus werden verschiedene andere Validierung Strategien benötigt, um Antikörper-Funktionalität zu gewährleisten, zum Beispiel Antikörper-Funktionalität in Protein-Arrays, Western Blot, Immunfluoreszenz, Immunpräzipitation und Pull-down Experimenten. Vielleicht das wichtigste Werkzeug zur Validierung von Antikörper-Funktionalität gepaart ist, um Antikörper zu verwenden, dh zwei verschiedene Antikörper gegen separate, nicht überlappende Epitope auf dem gleichen Zielprotein angehoben, um Assay-spezifische Ergebnis 17 zu vergleichen. Basierend auf den gesammelten Informationen werden Antikörper getestet und nach IHC-Standards und der Erfahrung aus der Testung und Validierung über 35.000 Antikörpern im Projekt Human Protein Atlas titriert. Seit mehr als 20% aller Gene mit Protein-Profile wurden die Daten aus Doppelbestimmungen Antikörper (2 oder mehr Antikörper gegen nicht-überlappende Epitope auf dem gleichen Protein) wurde verwendet, um eine bestmögliche Schätzung zu bestimmenKumpel des entsprechenden Proteins Expressionsmuster. Gepaart Antikörper bieten eine ultimative Strategie für die Validierung von spezifischen Immunhistochemie-basierten Protein-Expressionsmuster. Diese Strategie ist wertvoll, weil die Vielzahl unterschiedlicher Gewebe in der Basis-Screening enthalten erhöht das Risiko für Kreuzreaktivität. Es ist auch anzumerken, dass bestimmte Gewebe im Allgemeinen anfälliger sind, um die Hintergrundfärbung zB Makrophagen, glatte Muskelzellen, distalen Tubuli in der Niere und Leber in Hepatozyten zeigen werden. Zusätzliche Probleme zu berücksichtigen sind Schwankungen in Gewebe Verarbeitungstechniken im Laufe der Zeit für die Gewebe von Archivgut übernommen, die zu falsch negativen oder unangemessen positive IHC-Färbungsmuster führen kann. Dieses Phänomen wird auch in großen Abschnitt Analyse gestoßen. Sowohl negative als auch positive Kontrollen sind unerlässlich und sollte verwendet werden, wann immer möglich sein. Für tiefere Studien mit funktionellen Analysen, Zelllinien mit forcierter Expression und spezifische Knock-down von entsprechenden transcripts (siRNA-Technologie) können verwendet werden, um Kontrollen zu schaffen. Für optimale Ergebnisse in IHC, ist es wichtig zu testen und zu nutzen Antigen-Retrieval-Systeme, da die Formalinfixierung induziert verschiedene chemische Modifikationen wie zB die Vernetzung, die Hydrolyse von Schiff-Basen Maskierung des Antigens 18. Zusammenfassend ist Antikörper-basierten Proteomik beschäftigt TMA-Technologie und IHC eine leistungsfähige Strategie zur Erzeugung von Protein-Expression Daten im großen Maßstab. Das Projekt Human Protein Atlas wurde eingerichtet, um eine Landkarte des menschlichen Protein-Expression in normalen menschlichen Geweben und Krebs erzeugen gesetzt. Das Ziel dieses Projektes ist es, einen ersten Entwurf eines umfassenden Human Protein Atlas bis zum Jahr 2015 zu präsentieren. Neben der Bereitstellung von Protein-Profilen in normalen Organen und Geweben, diese Anstrengung auch einen Ausgangspunkt für die biomedizinische Forschung Projekte, einschließlich der klinischen Biomarker-Entdeckung Bemühungen. Das ultimative Ziel ist es, eine Information nächsten Schicht über die menschliche Genomsequenz hinzufügen, dass wiwerde entscheidend sein für ein tieferes Verständnis der zugrunde liegenden Biologie verschiedenen Krankheitszuständen, und eine Grundlage für die Entwicklung neuer diagnostischer und therapeutischer Werkzeuge.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Waschpuffer </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-999-TT </td></tr><tr><td> Citratpuffer pH 6 </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-250-Pm1X </td></tr><tr><td> Antikörperverdünnung </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UD </td></tr><tr><td> UltraVision LP HRP Polymer </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-HL </td></tr><tr><td> DAB Plus-Substrat-System </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-HDX </td></tr><tr><td> Ultra-V-Block </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UB </td></tr><tr><td> Primary Antibody Enhancer </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-PB </td></tr><tr><td> Mayers Hämatoxylin </td><td> HistolAB </td><td> 01820 </td></tr><tr><td> PERTEX </td><td> Histolab </td><td> 00871.0500 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Bezeichnung des Geräts </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Manuelle Tissue Micro Arrayer </td><td> Estigen, Beecher Instruments </td><td> MTA-1 </td></tr><tr><td> Wasserfall Mikrotom </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> Microm HM 355S </td></tr><tr><td> Automatisierte Bildscanner </td><td> Aperio Technologies </td><td> XT </td></tr><tr><td> Automatisierte Objektträgerfärbung System </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> Autostainer 480S-2D </td></tr><tr><td> Automatisiertes System für Objektträgerfärbung deparafinization und Dehydration </td><td> Leica Biosystems </td><td> Autostainer XL </td></tr><tr><td> Automatisierte Glas-Eindecker </td><td> Leica Biosysteme </td><td> CV5030 </td></tr><tr><td> Enttarnen Kammer </td><td> Biocare Medical </td><td> DC2008INTEL </td></tr></tbody></table>

production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas

Die Gewebe-Mikroarray (TMA)-Technologie stellt die Mittel für das Hochdurchsatz-Analyse von mehreren Geweben und Zellen. Die Technik wird im Projekt Human Protein Atlas für die globale Analyse von Protein-Expressionsmuster in normalen menschlichen Geweben, Krebs und Zelllinien verwendet. Hier präsentieren wir die Montage von 1 mm-Kerne, aus mikroskopisch ausgewählten repräsentativen Gewebe abgerufen, in einer einzigen Empfänger TMA-Block. Die Anzahl und Größe von Kernen in einer TMA Block von etwa vierzig 2 mm-Kerne zu Hunderten von 0,6 mm-Kerne variiert werden. Der Vorteil der Verwendung von TMA-Technologie ist, dass große Menge von Daten schnell kann mit Hilfe eines einzigen Immunfärbung Protokoll zu experimentellen Variabilität zu vermeiden. Wichtig ist, dass nur eine begrenzte Menge von knappen Gewebeproben erforderlich, die ermöglicht die Analyse von vielen Patienten 1 2. Ungefähr 250 aufeinanderfolgende Abschnitte (4 um dick) kann von einem TMA-Block geschnitten werden und für immunhistochemische staining zu spezifischen Protein-Expressionsmuster für 250 verschiedene Antikörper zu bestimmen. Im Projekt Human Protein Atlas werden Antikörper gegen alle menschlichen Proteinen erzeugt und verwendet werden, um entsprechende Protein-Profile in beiden normalen menschlichen Geweben zu erwerben von 144 Einzelpersonen und Krebsgewebe aus 216 verschiedenen Patienten, die die 20 häufigsten Formen von Krebs beim Menschen. Immunhistochemisch gefärbten Abschnitte TMA auf Glasobjektträgern werden abgetastet, um Bilder mit hoher Auflösung von dem Pathologen interpretieren und können Anmerkungen zu dem Ergebnis der Immunhistochemie erstellen. Bilder zusammen mit entsprechenden Pathologie-basierte Annotation Daten sind öffentlich zugänglich gemacht für die Forschungsgemeinschaft durch die Human Protein Atlas-Portal ( <a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a> ) (Abbildung 1) 3 4. Das humane Protein Atlas stellt eine Straßenkarte, die die Verteilung und die relative Häufigkeit von Proteinen im menschlichen Körper. Die aktuelle Versionsion enthält über 11 Millionen Bilder mit Proteinexpression Daten für einzigartige 12,238 Proteine, das entspricht mehr als 61% aller Proteine ​​vom menschlichen Genom kodiert.

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Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Tissue Microarrays ermöglicht eine effiziente Methode zur gleichzeitigen Informationen aus einer Vielzahl von Geweben zu gewinnen. Repräsentative Teile von Geweben in einem einzigen Paraffinblock montiert. Abschnitte aus dem Block für die Immunhistochemie und Analyse der Proteinexpression Muster verwendet. Digitale Abtastung erzeugt entsprechende Bilder für die Verteilung der Daten.

Herstellung von Tissue Microarrays, Immunhistochemie Färbung und Digitalisierung Innerhalb des Human Protein Atlas

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

55.8K Aufrufe.  Uppsala University. Tissue Microarrays ermöglicht eine effiziente Methode zur gleichzeitigen Informationen aus einer Vielzahl von Geweben zu gewinnen. Repräsentative Teile von Geweben in einem einzigen Paraffinblock montiert. Abschnitte aus dem Block für die Immunhistochemie und Analyse der Proteinexpression Muster verwendet. Digitale Abtastung erzeugt entsprechende Bilder für die Verteilung der Daten.

Serie: Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Forschung

Biologie

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Gewebeproben

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

Herstellung und Verwendung von Mikroumgebung Microarrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

Die MultiBac Protein Complex Produktion Platform am EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Probing hoher Dichte Funktionale Protein-Microarrays, um Protein-Protein Wechselwirkungen erkennen

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

Visualisierung von 3D weißen Fettgewebe Schachts ganz-Mount Färbung

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

Die CryoAPEX-Methode zur Elektronenmikroskopie-Analyse der Membranproteinlokalisierung in ultrastrukturell konservierten Zellen

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...