<html> 1. Enzymatische Deglykosylierung <ol><li> Verwenden PCR-Röhrchen, um den Wasserverlust durch Verdunstung zu minimieren. Beschriften Sie ein Set von Röhren 1 bis 7. </li><li> Auftauen 10X G7-Puffer, der 10X-Glykoprotein denaturierenden Puffer, und die 10% NP-40 und klopfen Sie leicht die Rohre, um den Inhalt zu mischen. Halten Sie bei Raumtemperatur. </li><li> Legen Sie die enzymhaltigen Fläschchen auf dem Eis. Versuchen Sie zum Auftauen / Einfrieren-Zyklen zu minimieren. </li><li> Lösen Sie den Inhalt des hCGβ Fläschchen (150 ug) in 600 ul dH 2 O und halten auf dem Eis. </li><li> Bereiten Sie 1 ml 1X G7-Puffer durch Verdünnen des 10fach in dH 2 O. </li><li> Verdünnen 0,5 ul PNGase F in 25 ul 1X G7-Puffer und halten auf dem Eis. </li><li> Bereiten Sie die exoglycosidase Mix (EG-Mix) durch die Kombination von 2 ul jedem α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, β1-3 Galactosidase und α1-3, 6 Galactosidase. </li><li> Set up PCR-Röhrchen wie angegeben: </li></ol>ak &quot;&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> Tube / Probe # </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> hCGβ (0.25mg/ml) </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 10X Glycoprotein Denaturierungspuffer </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td></tr></tbody></table><ol start="9"><li> Verschließen Sie die Röhrchen, vorsichtig mischen und in dieThermocycler, schließen Sie den Deckel und Denaturierung der Proteine ​​durch Inkubation 10 Minuten bei 94 ° C, mit einem 4 ° C zu halten, gefolgt (mit PCR-Röhrchen in einem Thermocycler stark verhindert die Verdunstung in kleinen Proben). </li><li> Entfernen Sie die Schläuche aus Thermocycler und Zentrifuge zu keiner sichtbaren Kondensation zu entfernen. </li><li> Fügen Sie die folgenden Reagenzien wie angegeben: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Sample # </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> 10% NP-40 </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> 10X G7 Buffer </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5 &amp; mu; L </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> PNGase F 01.50 dil. </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Deglykosylierung Mix </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> EG-Mix </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 10 &amp;mgr; l </td><td> 8μl </td><td> 8μl </td><td> 6μl </td><td> 8μl </td><td> 8μl </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> Insgesamt Reaktion vol. </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l &lt;/ Td&gt; <td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td></tr></tbody></table><ol start="12"><li> Schließen Sie die PCR-Röhrchen mit neuen Kappen (verwerfen die benutzten, da sie nicht richtig passen nach einer Inkubationszeit Zyklus). </li><li> Mischen Sie die Röhrchen durch leichtes Antippen 4 mal und dann drehen Sie den Inhalt nach unten. </li><li> Die Röhrchen in den Thermocycler und bei 37 ° C für 4 Stunden, dann kühlen die Proben auf 4 ° C. </li></ol> 2. SDS-PAGE von Proben deglykosylierter <ol><li> Bereiten Sie 130 ul frisch 3X reduzierenden SDS-Ladepuffer durch Zugabe von 4 pl 1,25 M DTT. </li><li> Add 12,5 ul der vorbereiteten 3X reduzierenden SDS-Ladepuffer zu jeder Probe. </li><li> Schließen Sie die Rohre mit neuen Kappen und klopfen Sie leicht die Rohre zu mischen. </li><li> Die Röhrchen in einem Thermocycler bei 94 ° C für 5 Minuten und dann abkühlen auf 4 ° C. </li><li> Legen Sie 30 ul jeder Probe und 10 ul der Protein-Marker auf einem 10-20% Tris-Glycin-Gel. Save the Rest der Probe für einen Teil 3.1. Legen Sie 10 &amp;mgr; l der ColorPlus Markers. </li><li> Elektrophorese des Gels bei 130 Volt bei Raumtemperatur bis der Farbstoff Front ist nahe der Unterseite des Gels. </li><li> Wenn das Gel beendet ist, entfernen Sie das Gel von der Besetzung und legen Sie sie in eine kleine Plastikbox mit genug Coomasie Bläue, um das Gel zu decken. </li><li> Stain das Gel für 1 Stunde unter leichtem Schütteln. </li><li> Wash Gel dreimal für 30 Minuten in 50 ml entfärben Lösung. </li><li> Notieren Sie sich die Bilder mit einer Weißlicht-Transilluminator oder Scanner. Alternativ kann das Gel zwischen den Blättern der Zellophan in einem Rahmen getrocknet werden. </li></ol> 3. Pro-Q Smaragd 300 für Erkennung von glykosylierten Proteinen in SDS-PAGE-Gelen <ol><li> Parallel mit dem Gel in 2,1), laden den Rest der Proben auf einem 10-20% Tris-Glycin-Gel. Laden 10 &amp; mu; L ColorPlus Markers. </li><li> Während das Gel läuft lösen die Pro-Q Smaragd Reagenz mit DMF und bereiten die Lager Fix, Wash-und Oxidationsmittel-Lösungen für die Pro-Q Smaragd 300 nach dem Produkt-Handbuch mit dem Kit mitgeliefert Fleck. </li><li> Wenn die Elektrophorese beendet ist, entfernen Sie das Gel gegossen und legen Sie sie in einer Kunststoff-Box. </li><li> Fix das Gel durch Zugabe von 100 ml der Fix-Lösung und lassen es über Nacht bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li><li> Wash das Gel mit 100 ml der Waschlösung für 10 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur mit gentile Agitation. Wiederholen Sie die Wäsche mit frischer Waschlösung. </li><li> Oxidieren die Kohlenhydrate durch Inkubation des Gels mit leichtem Schütteln für 30 Minuten in 25 ml oxidierende Lösung. </li><li> Wash Gel wie in Schritt 3.5 beschrieben. </li><li> Während das Gel Waschen vorbereiten frischen Pro-Q Smaragd 300 Flecken durch Zugabe von 500 ul des Pro-Q Smaragd 300 Reagenzlösung in Schritt 3,2 bis 25 ml des gelöstenFärbepuffer im Kit enthalten. </li><li> Stain das Gel durch Zugabe von 25 ml des Flecks in Schritt 3,8 vorbereitet und Inkubation im Dunkeln unter leichtem Schütteln für 90 bis 120 Minuten. </li><li> Wiederholen Sie die beiden Waschschritte in Schritt 3.5 beschrieben. </li><li> Notieren Sie sich die Bilder mit einem UV-Transilluminator bei 300 nm. Verwenden Sie das 80 kDa-Marker, die mit Pro-Q Emerald Green gekennzeichnet ist, die UV-Bild auf ein weißes Licht Bild des Gels zeigt die prestained Leiter überlappen. </li><li> Vergleichen Sie die Bilder der Coomasie gefärbten Gel in Schritt 2.10 In der Pro-Q Smaragd gefärbtes Gel aus Schritt 3.11. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Die Änderungen im Protein Migration nach enzymatischer Deglykosylierung sind in Abbildung 2 dargestellt. Vergleichen Sie die Kontrollprobe (Panel A, Spur 1) mit dem PNGase F Behandlung (Entfernung der N-Glykane, Spur 2) und Deglycosylierung Mix (PNGase F; sowie Endo-und Exoglycosidasen zu O-Glykane zu entfernen, Spur 3). Keine weitere Reduktionin der Größe wird nach Verdauung mit zusätzlichen Glycosidasen (Bahn 4) zu sehen. Neben einer Veränderung in der Masse, werden Bänder schärfer als Glykane entfernt werden. Eine Band, die unter dem 17 kDa-Marker (Stern) steht für die vollständig deglykosylierter hCGβ Polypeptid (MW: 16 kDa). Andere Bands können von unvollständigen Deglykosylierung oder aus dem mehrere nicht identifizierte Proteine ​​in der hCGβ Probe (siehe Spur 1) ableiten. Lanes 5 bis 7 (Kontrollen) zeigen die Banden auf, die Glycosidasen. Das Glykoprotein-Färbung von Emerald Green ist in Feld B gezeigt Dieses Reagenz oxidiert und Flecken aller Glykane in ein Eiweißmolekül. Daher ist die Intensität des Signals nimmt mit hCGβ enzymatisch deglykosylierter ist (Spur 1 bis Spur 4). Das Restsignal in Bahnen 3 und 4 zeigen das Vorhandensein von Glykan Motive, die resistent gegen die eingesetzten Enzyme werden. Die zusätzlichen Glycosidasen in Spur 4 verwendet entfernen ein paar zusätzliche Zuckerreste: das Protein Migration ist die gleiche, abereinen leichten Rückgang in der Intensität der Färbung zu erkennen. Beständig Zuckereinheiten wurden nicht in allen Protein-Spezies: einige Bands wurden von Emerald Green (abwesend in die UV-Bild, in Klammern) nachgewiesen, was auf sie ausgiebig waren deglykosylierter. Zusätzliche Daten unterstützen die Schlussfolgerung, dass hCGβ heterogen glykosyliert ist. Die untere Bande auf Bahn 2 (Pfeil) ist schwach auf der Emerald Green Bild, während das obere Band auf Spur 2 ist hell, was darauf hinweist, dass viele Glykane Gruppen noch vorhanden sind. Diese Daten unterstützen die Schlussfolgerung, dass rekombinante hCGβ in Maus-Zellen exprimiert mehrere glycoforms enthält 9. Diese unterschiedlichen glycoforms sind aufgrund der inhärenten Heterogenität der Glykosylierung, wo einige Polypeptide nicht erhalten, ein Glykan in jedem Konsens vor Ort und / oder einige Glykane sind erweitert, während andere sogar auf das gleiche Protein nicht. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3749/3749fig1.jpg" /> Abbildung 1.Typische Glykosylierungsmustern für sezernierte oder Zelloberflächen-Glykoproteine. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3749/3749fig2.jpg" /> Abbildung 2. SDS-PAGE-Gele zeigen enzymatische Deglykosylierung hCGβ. Panel A zeigt ein Coomassie-Blau-Färbung, während Panel B zeigt die Ergebnisse der Pro-Q Smaragd 300 für Visualisierung von glykosylierten Proteinen. Beispiel: 1, hCGβ Kontrolle; 2, PNGase F Verdauung; 3, Deglycosylierung Mix Verdauung; 4, Deglycosylierung Mix plus Exoglycosidasen Verdauung, Proben 5 bis 7 sind die Reagenzien Kontrollen (O-Glyc, O-Glycosidase, GNA, β-N -Acetylglucosaminidase; Gal / Fuc, β1-3 Galactosidase, α1-3, 6 Galactosidase und α1-2 Fucosidase; GalNA, α-N-Acetylglalactosaminidase; Neu, Neuraminidase; PNGase; PNGase F)

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Die Autoren sind von New England Biolabs, die viele der Reagenzien in diesem Artikel verwendeten produziert beschäftigt.

Die hier beschriebene Methode mit Hilfe enzymatischer Deglykosylierung und SDS-PAGE können wertvolle Informationen über die Glykosylierung eines Proteins von Interesse zu erbringen, während Glykan-spezifische Reagenzien die Interpretation der Daten erleichtern. Dieses Protokoll wird für die ersten Untersuchungen der Protein-Glykosylierung bestimmt, und es ist besonders für sekretorische und Membranglykoproteine ​​aus Säugerzellen geeignet: die Enzyme in diesem Fall gewählt wird speziell entfernen Sie alle N-Glykane und oder N-Glykane plus und die häufigste Zucker Erweiterung und bilden den Kern der O-Glykane. Glycosidasen haben den zusätzlichen Vorteil, dass sie mild, im Vergleich mit chemischen Deglykosylierung Methoden, die Wahrung der Integrität der beiden Zucker-und Protein-Rückgrat. Um die Rate der Belegung (die Aminosäuren glykosyliert sind), das Ausmaß der Glykosylierung oder die Feinstruktur der Glykane, anspruchsvollere Techniken wie m bestimmen Aufklärungass-Spektrometrie, Flüssigchromatographie oder NMR erforderlich sind. Wegen seiner Einfachheit kann in mehreren Schritten in diesem Protokoll angepasst, ersetzt werden, und / oder kombiniert werden, um verschiedene experimentelle Bedürfnisse anzupassen. Um jedoch die Ergebnisse, die eindeutig interpretiert werden können, erhalten, ist es wichtig, seine Stärken und Schwächen zu verstehen. Erstens sind die Spezifität und Reinheit der Glycosidasen entscheidend: nur gut charakterisierten Enzyme getestet, frei zu sein von Proteasen und anderen verunreinigenden Tätigkeit verwendet werden soll. Leider gibt es keine Standard-Enzym-Einheit Definition für Glycosidasen, sollte der Benutzer die entsprechende Substitution nach den Angaben des Herstellers zu bestimmen. Zweitens ist eine sorgfältige Auswahl der Nachweis erforderlich: a) Protein Färbereagenzien sind nur sinnvoll, wenn Deglykosylierung führt zu einer deutlichen Verschiebung in der molekularen Masse. Solch ein eindeutiges Ergebnis wie hier gezeigt, ist nicht immer erhalten. In anderen Fällen haben wir abnormal mi gesehengration nach Deglykosylierung (weit entfernt von dem vorhergesagten Molekulargewicht, oder sogar langsamer Migration). Dieses Phänomen ist nicht gut verstanden, aber es kann gesagt werden, dass jede Änderung in der Migration Beweise dafür, dass das Protein wurde deglykosylierter ist. B) Zucker-Detektion mit Antikörpern einzigartige Herausforderungen Begrenzung ihrer Anwendbarkeit präsentiert werden. Es war sehr schwierig, allgemeine Anti-Glycan Antikörper zu erzeugen, sie sind in der Regel gegen ein komplexes Glycan Ziel, was ihren Einsatz einschränkt angehoben. Darüber hinaus zeigen verschiedene monoklonale anti-Glycan Antikörper unerwünschte Kreuzreaktivität 10. C) Lektine (Proteine ​​mit intrinsischer Zucker Affinität) sind gut für Zucker-Erkennung geeignet, plus sie geben Einblick in Glykanstruktur. Allerdings haben nicht alle von ihnen eine enge Spezifität, und viele sind nur teilweise charakterisiert (das heißt, sie könnten nicht bekannt Affinitäten haben). Als Folge positive Lektin Färbung bietet Indikation, kein Beweis, der die Anwesenheit eines given Zucker. d) Chemische Labeling Kits (basierend auf Perjodat Oxidation von Zuckern) sind die Methode der Wahl für alle Glykoproteine ​​Fleck, und somit gut geeignet, um Deglykosylierung folgen. Bei der Verarbeitung von einer unbekannten Probe, ist es eine gute Übung, Glykoprotein Kontrollen beinhalten. Fetuin ist ein leicht verfügbares N - und O-Glykoprotein, Chorion-Gonadotropin (beide Untereinheiten) ist ebenfalls eine gute Wahl. Rinderserumalbumin (BSA) können als negative Kontrolle verwendet werden. Es sollte jedoch angemerkt, dass einige nicht-glykosylierte Proteine ​​leicht reagieren mit dem Pro-Q Smaragd 300, besonders wenn sie in hohen Konzentrationen eingesetzt werden. Nicht-glykosylierte Molekulargewicht-Standards, wie z. B. die Markers in diesem Protokoll verwendet werden, haben den Vorteil, dass die Anzeige scharfe Banden. Nur durch Zufall ist eines dieser Proteine ​​(80 kDa) reaktiv auf Pro-Q Smaragd 300. Daher könnte der Benutzer wollen ein Glykoprotein Standard Leiter laufen, anstatt wie Candy-Cane aus Invitrogen. Schließlich ist einfach in-Gel-Detektion von nucleocytosolic Glykoproteine ​​(die mit einem einzigen O-GlcNAc modifiziert) mit der Verwendung eines monoklonalen Antikörpers möglich, entlang β-N-Acetylglucosaminidase Spezifität Steuerung 11. Die Beschreibung dieser Technik ist, über die Rahmen dieses Artikels sprengen, aber es sollte erwähnt werden, wie Glycosidasen nützliche Werkzeuge für das Studium der vielen anderen Glykoproteinen und Glycokonjugate in Zellen sind. 12:;: online frei verfügbar auf der NCBI Bookshelf (NBK1908 PMID 20301239 Bookshelf ID;) Eine umfassende Behandlung aller bekannten Formen der Glykosylierung in der zweiten Auflage der &quot;Essentials of Glycobiology&quot; gefunden werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Humanes Choriongonadotropin β </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C6572 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Tubes </td><td> VWR </td><td> 20170-004 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Thermocycler </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4359659 </td><td></td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> New England Biolabs </td><td> P0704 </td><td> Ausgestattet mit Puffer </td></tr><tr><td> Protein Deglycosylierung Mix </td><td> New England Biolabs </td><td> P6039 </td><td> Ausgestattet mit Puffer </td></tr><tr><td> α-N-Acetylglalactosaminidase </td><td> New England Biolabs </td><td> P0734 </td><td> Ausgestattet mit Puffer </td></tr><tr><td> α1-2 Fucosidase </td><td> New England Biolabs </td><td> P0724 </td><td> Ausgestattet mit Puffer </td></tr><tr><td> α1-3, 6 Galactosidase </td><td> New England Biolabs </td><td> P0731 </td><td> Ausgestattet mit Puffer </td></tr><tr><td> β1-3 Galactosidase </td><td> New England Biolabs </td><td> P0726 </td><td> Ausgestattet mit Puffer </td></tr><tr><td> 10X Buffer G7 (500 mM Natriumphosphat) </td><td> New England Biolabs </td><td> --- </td><td> Ausgestattet mit PNGaseF oder Degl Mix </td></tr><tr><td> 10X Glycoprotein Denaturierungspuffer (5% SDS, 400 mM DTT) </td><td> New England Biolabs </td><td> --- </td><td> Ausgestattet mit PNGaseF oder Degl Mix </td></tr><tr><td> 10% NP-40 </td><td> New England Biolabs </td><td> --- </td><td> Ausgestattet mit PNGaseF oder Degl Mix </td></tr><tr><td> 3X SDS-Ladepuffer (187,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 6% SDS, 30% Glycerin, 0,03% bromophenol blau) </td><td> New England Biolabs </td><td> B7703 </td><td> Geliefert mit 1,25 M DTT </td></tr><tr><td> ColorPlus Markers </td><td> New England Biolabs </td><td> P7709 </td><td></td></tr><tr><td> 10-20% Tris-Glycin-Multigel </td><td> Cosmo Bio Co. </td><td> DCB-414893 </td><td></td></tr><tr><td> Cassette Elektrophoresekammer </td><td> Cosmo Bio Co. </td><td> DCB-303111 </td><td></td></tr><tr><td> Elektrophorese Power Supply EPS 301 </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr><tr><td> Pro-Q Smaragd 300 Glykoprotein Stain Kit </td><td> Invitrogen </td><td> P-21857 </td><td></td></tr><tr><td> Brilliant Blue R </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B0149 </td><td></td></tr><tr><td> AlphaImager HP System </td><td> Zell Biosciences </td><td> 92-13823-00 </td><td></td></tr></tbody></table>

identification and characterization of protein glycosylation using specific endo- and exoglycosidases

Glykosylierung, die Zugabe von kovalent gebundene Zucker, ist ein wichtiger post-translationale Modifikation von Proteinen, die wesentlich beeinflussen können Prozesse wie Zelladhäsion, molekulare Handels-, Abstands-und Signaltransduktion 1-4. In Eukaryoten sind die häufigsten Glykosylierung Änderungen in den sekretorischen Weg Ergänzungen um einen Konsens Asparaginresten (N-linked), oder an Serin oder Threonin-Reste (O-linked) (Abbildung 1). Initiation von N-Glycan Synthese ist sehr in Eukaryoten konserviert, während die Endprodukte stark variieren kann zwischen verschiedenen Spezies, Geweben oder Proteine. Einige Glykane unverändert bleiben (&quot;high Mannose N-Glykane&quot;) oder werden in den Golgi (&quot;komplexen N-Glykane&quot;) verarbeitet. Größere Vielfalt ist für O-Glykane, die mit einem gemeinsamen N-Acetylgalactosamin (GalNAc)-Rest in tierischen Zellen beginnen, unterscheiden sich aber in niederen Organismen 1 gefunden. ENT &quot;&gt; Die detaillierte Analyse der Glykosylierung von Proteinen ist ein Feld, in sich selbst und erfordert umfangreiche Ressourcen und Expertise, um korrekt ausgeführt. Doch eine Vielzahl der verfügbaren Enzyme, die Zucker zu entfernen (Glycosidasen) möglich macht, eine allgemeine Vorstellung von der Glykosylierung Status haben . ein Protein in einem Standard-Laborbedingungen Hier zeigen die Verwendung von Glycosidasen für die Analyse eines Modells Glykoprotein:. rekombinantes humanes Chorion-Gonadotropin Beta (hCGβ), die zwei N-Glykane und vier O-Glykane 5 trägt die Technik erfordert nur einfache Instrumentierung und typische Verschleißteile, und es kann ohne weiteres auf die Analyse von mehreren Proben Glykoprotein angepasst werden. Mehrere Enzyme können parallel verwendet werden, um ein Glykoprotein, zu studieren. PNGase F ist in der Lage nahezu alle Arten von N-Glycane 6,7 zu entfernen. Für O-Glykane, gibt es keine verfügbaren Enzym, das spalten kann eine intakte Oligosaccharid von the-Protein-Rückgrat. Stattdessen werden O-Glykane von Exoglycosidasen eine kurze Kern, die dann leicht durch O-Glycosidase entfernt getrimmt. Das Protein Deglycosylierung Mix enthält PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (Sialidase), β1-4 Galactosidase und β-N-Acetylglucosaminidase. Es wird verwendet, um gleichzeitig zu entfernen N-Glykane und einige O-Glykane 8. Schließlich wurde die Deglycosylierung Mix mit einer Mischung aus anderen Exoglycosidasen (α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, α1-3, 6 Galactosidase und β1-3 Galactosidase), die zu entfernen sonst resistenten Monosaccharide, die vorhanden sein in könnte dazu beitragen, ergänzt bestimmte O-Glykane. SDS-PAGE/Coomasie blau wird verwendet, um Unterschiede in der Protein-Migration vor und nach Glycosidase Behandlung visualisieren. Darüber hinaus zeigt eine Zucker-spezifischen Färbemethode, Proq Smaragd-300, verminderte Signal als Glykane succe sindssively entfernt. Dieses Protokoll wird für die Analyse von kleinen Mengen an Glykoprotein (0,5 bis 2 ug) entwickelt, obwohl enzymatische Deglykosylierung hochskaliert werden kann, um größere Mengen an Protein bei Bedarf anzupassen.

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Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Mit Hilfe spezifischer Glycosidasen um Zucker aus Glykoproteinen, die durch SDS-PAGE gefolgt zu entfernen, ist eine wertvolle Methode, um glycan Modifikationen am Protein-Proben erkannt und ist eine gute Wahl für die erste Glykobiologie Studien. Veränderungen nach Deglykosylierung kann als Verschiebungen in Gel-Mobilität oder durch Färbung mit glycan empfindliche Reagenzien nachgewiesen werden.

Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Glykosylierung mit speziellen Endo-und Exoglycosidasen

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

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36.5K Aufrufe.  New England Biolabs. Mit Hilfe spezifischer Glycosidasen um Zucker aus Glykoproteinen, die durch SDS-PAGE gefolgt zu entfernen, ist eine wertvolle Methode, um glycan Modifikationen am Protein-Proben erkannt und ist eine gute Wahl für die erste Glykobiologie Studien. Veränderungen nach Deglykosylierung kann als Verschiebungen in Gel-Mobilität oder durch Färbung mit glycan empfindliche Reagenzien nachgewiesen werden.

Serie: Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive &#946;-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.

In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive &#946;-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.

Verbesserte In-Gel-reduktive β-Elimination für umfassende O-gebundene und Sulfo-Glykomik durch Massenspektrometrie

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

Forschung

Chemie

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). Using proteomics, we have previously identified more than 150 ECM and ECM-associated proteins in cardiovascular tissues. Notably, many ECM proteins are glycosylated. This post-translational modification affects protein folding, solubility, binding, and degradation. We have developed a sequential extraction and enrichment method for ECM proteins that is compatible with the subsequent liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis of intact glycopeptides. The strategy is based on sequential incubations with NaCl, SDS for tissue decellularization, and guanidine hydrochloride for the solubilization of ECM proteins. Recent advances in LC-MS/MS include fragmentation methods, such as combinations of higher-energy collision dissociation (HCD) and electron transfer dissociation (ETD), which allow for the direct compositional analysis of glycopeptides of ECM proteins. In the present paper, we describe a method to prepare the ECM from tissue samples. The method not only allows for protein profiling but also the assessment and characterization of glycosylation by MS analysis.

This paper describes a methodology to prepare cardiovascular tissue samples for MS analysis that allows for (1) the analysis of ECM protein composition, (2) the identification of glycosylation sites, and (3) the compositional characterization of glycan forms. This methodology can be applied, with minor modifications, to the study of the ECM in other tissues.

Glycoproteomics der extrazellulären Matrix: eine Methode zur Intact Glycopeptidthioestern Analyse unter Verwendung von Massenspektrometrie

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Biochemie

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define pathways, improve treatment, understand disease, and aid biomarker discovery. N-linked glycosylation is one of the most important and robust post-translational modifications on proteins and regulates critical cell functions such as signaling, adhesion, and enzymatic function. Analytical techniques to purify and analyze N-glycans have remained relatively static over the last decade. While accurate and effective, they commonly require significant expertise and resources. Though some high-throughput purification schemes have been developed, they have yet to find widespread adoption and often rely on the enrichment of glycopeptides. One promising method, developed by Thomas-Oates et al., filter aided N-glycan separation (FANGS), was qualitatively demonstrated on tissues. Herein, we adapted FANGS to plasma and coupled it to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy in order to achieve accurate relative quantification by liquid chromatography mass spectrometry and enhanced electrospray ionization. Furthermore, we designed new functionality to the protocol by achieving tandem, shotgun proteomics and glycosylation site analysis on hen plasma. We showed that N-glycans purified on filter and derivatized by hydrophobic hydrazide tags were comparable in terms of abundance and class to those by solid phase extraction (SPE); the latter is considered a gold standard in the field. Importantly, the variability in the two protocols was not statistically different. Proteomic data that was collected in-line with glycomic data had the same depth compared to a standard trypsin digest. Peptide deamidation is minimized in the protocol, limiting non-specific deamidation detected at glycosylation motifs. This allowed for direct glycosylation site analysis, though the protocol can accommodate 18O site labeling as well. Overall, we demonstrated a new in-line high-throughput, unbiased, filter based protocol for quantitative glycomics and proteomics analysis.

A high-throughput protocol was developed for combined proteomics and glycomics purification and LC-MS/MS quantification in plasma. Deamidation analysis of N-linked glycosylation motifs was specific to deglycosylated sites. Accurate quantitation of N-glycans was achieved by coupling filter aided N-glycan separation to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy.

Eine quantitative Glycomics und Proteomics Kombinierte Reinigungsstrategie

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Gal&alpha;4Gal&beta;4Glc&beta;1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Gal&alpha;3Gal&beta;4Glc&beta;1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.

A specific and sensitive method to gain insight into the expression profile of glycosphingolipid antigens in immune organs and cells is described. The method takes advantage of the ion trap mass spectrometry allowing step-wise fragmentation of glycosphingolipid molecules for structural analysis in comparison to chemically synthesized standards.

Massenspektrometrische Analyse Glycosphingolipid Antigene

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Immunologie und Infektion

N-glycan Profiling of Glycoproteins by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Fluorescence and Mass Spectrometric Detection

Glycosylation is a vital modification found in proteins. N-glycan profiling of glycoproteins is required to detect novel biomarker candidates and determine glycan alterations in diseases. Most commercially available biopharmaceutical proteins are glycoproteins. The efficacy of these drugs is affected by glycosylation patterns. Therefore, an in-depth characterization method for the N-glycans is necessary. Here, we present a comprehensive approach for qualitative and quantitative analysis of N-glycans using hydrophilic interaction liquid chromatography equipped with fluorescence detection and tandem mass spectrometry (HILIC-FLD-MS/MS). N-glycans were released from glycoproteins with a facile method and labeled by a procainamide fluorophore tag in the strategy. Subsequently, the procainamide labeled N-glycans were analyzed by a HILIC-FLD-MS/MS technique. In this approach, N-glycan structures were confirmed by the tandem mass spectrometric analysis, whereas fluorescence detection was used for the quantitative analysis. An application for data analysis of the detected N-glycan peaks is described in the study. This protocol can be applied to any glycoprotein extracted from various species.

N-glycan Profiling of Glycoproteins by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Fluorescence and Mass Spectrometric Detection

N-glycan profiling of glycoproteins is essential for discovering novel biomarkers and understanding glycan functions in cellular events. Additionally, N-glycan analysis of protein biopharmaceuticals is very important for human use. In this current article, a high-throughput strategy for identifying and quantifying N-glycan structures was presented using the HILIC-FLD-MS/MS technique.

Glycosylation is a vital modification found in proteins. N-glycan profiling of glycoproteins is required to detect novel biomarker candidates and ...

Recombinant Production of Bifidobacterial Endoglycosidases for N-glycan Release

Protein glycosylation is a diverse and common post-translational modification that has been associated with many important roles such as protein function, including protein folding, stability, enzymatic protection, and biological recognition. N-glycans attached to glycoproteins (such as lactoferrin, lactadherin, and immunoglobulins) cannot be digested by the host and reach the large intestine, where they are consumed by certain beneficial microbes. Therefore, they are considered next-generation prebiotic compounds that can selectively stimulate the gut microbiome's beneficial microorganisms. However, the isolation of these new classes of prebiotics requires novel enzymes. Here, we describe the recombinant production of novel glycosidases from different Bifidobacteria strains (isolated from infants, rabbits, chicken, and bumblebee) for improved N-glycan isolation from glycoproteins. The method presented in this study includes the following steps: molecular cloning of Bifidobacterial genes by an in vivo recombinational cloning strategy, control of transformation success, protein induction, and protein purification.

Recombinant Production of Bifidobacterial Endoglycosidases for N-glycan Release

Bifidobacteria possess a unique genomic capability for N-glycan cleavage. Recombinantly producing these enzymes would be a promising novel tool to release bioactive N-glycans from glycoprotein-rich substrates such as colostrum.

Protein glycosylation is a diverse and common post-translational modification that has been associated with many important roles such as protein function, ...

The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides

Protein glycosylation is increasingly recognized as a common modification within bacterial organisms, contributing to prokaryotic physiology and optimal infectivity of pathogenic species. Due to this, there is increasing interest in characterizing bacterial glycosylation and a need for high-throughput analytical tools to identify these events. Although bottom-up proteomics readily enables the generation of rich glycopeptide data, the breadth and diversity of glycans observed in prokaryotic species make the identification of bacterial glycosylation events extremely challenging.
Traditionally, the manual determination of glycan compositions within bacterial proteomic datasets made this a largely bespoke analysis restricted to field-specific experts. Recently, open searching-based approaches have emerged as a powerful alternative for the identification of unknown modifications. By analyzing the frequency of unique modifications observed on peptide sequences, open searching techniques allow the identification of common glycans attached to peptides within complex samples. This article presents a streamlined workflow for the interpretation and analysis of glycoproteomic data, demonstrating how open searching techniques can be used to identify bacterial glycopeptides without prior knowledge of the glycan compositions.
Using this approach, glycopeptides within samples can rapidly be identified to understand glycosylation differences. Using Acinetobacter baumannii as a model, these approaches enable the comparison of glycan compositions between strains and the identification of novel glycoproteins. Taken together, this work demonstrates the versatility of open database-searching techniques for the identification of bacterial glycosylation, making the characterization of these highly diverse glycoproteomes easier than ever before.

The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides

Open searching enables the identification of glycopeptides decorated with previously unknown glycan compositions. Within this article, a streamlined approach for undertaking open searching and subsequent glycan-focused glycopeptide searches are presented for bacterial samples using Acinetobacter baumannii as a model.

Die Anwendung offener suchbasierter Ansätze zur Identifizierung von Acinetobacter baumannii O-verknüpften Glykopeptiden

Protein glycosylation is increasingly recognized as a common modification within bacterial organisms, contributing to prokaryotic physiology and optimal ...

Nonspecific Proteolysis-Based Glycomics Strategy for Bacterial Glycoproteins

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the specific roles of glycans, the relationship between their structures and their impact on the functions of proteins. A common method for glycan analysis is to employ exoglycosidase cleavage to release N-linked glycans from glycoproteins or glycopeptides using Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F). However, the glycan-protein linkages in bacteria are different and there is no enzyme available to release glycans from bacterial glycoproteins. In addition, free glycans have also been described in mammalian cells, bacteria, yeast, plants, and fish. In this article, we present a method that can characterize the N-linked glycosylation system in Campylobacter jejuni by detecting asparagine (Asn)-linked and free glycans that are not attached to their target proteins. In this method, total proteins from C. jejuni were digested by Pronase E with a higher enzyme to protein ratio (2:1&#8722;3:1) and a longer incubation time (48&#8722;72 h). The resulted Asn-glycans and free glycans were then purified using porous graphitic carbon cartridges, permethylated, and analyzed by mass spectrometry.

This study presents a method for glycomics analysis of glycoproteins by a combination of pronase E digestion, permethylation, and mass spectrometry analysis. This method is capable of analyzing all types of N-linked glycans, including bacterial N-glycans.

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Profilierung von kolorektalem Krebsgewebe mittels Glykomics-gesteuerter Glykoproteomik

Glycomics-Guided Glycoproteomics Facilitates Comprehensive Profiling of the Glycoproteome in Complex Tumor Microenvironments

Glycosylation is a common and structurally diverse protein modification that impacts a wide range of tumorigenic processes. Mass spectrometry-driven glycomics and glycoproteomics have emerged as powerful approaches to analyze liberated glycans and intact glycopeptides, respectively, offering a deeper understanding of the heterogeneous glycoproteome in the tumor microenvironment (TME). This protocol details the glycomics-guided glycoproteomics method, an integrated omics technology, which firstly employs porous graphitized carbon-LC-MS/MS-based glycomics to elucidate the glycan structures and their quantitative distribution in the glycome of tumor tissues, cell populations, or bodily fluids being investigated. This allows for a comparative glycomics analysis to identify altered glycosylation across patient groups, disease stages, or conditions, and, importantly, serves to enhance the downstream glycoproteomics analysis of the same sample(s) by creating a library of known glycan structures, thus reducing the data search time and the glycoprotein misidentification rate. Focusing on N-glycoproteome profiling, the sample preparation steps for the glycomics-guided glycoproteomics method are detailed in this protocol, and key aspects of the data collection and analysis are discussed. The glycomics-guided glycoproteomics method provides quantitative information on the glycoproteins present in the TME and their glycosylation sites, site occupancy, and site-specific glycan structures. Representative results are presented from formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissues from colorectal cancer patients, demonstrating that the method is sensitive and compatible with tissue sections commonly found in biobanks. Glycomics-guided glycoproteomics, therefore, offers a comprehensive view into the heterogeneity and dynamics of the glycoproteome in complex TMEs, generating robust biochemical data required to better understand the glycobiology of cancers.

<meta charset="utf8"></head><body>Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik ermöglicht eine umfassende Profilierung des Glykoproteoms in komplexen Tumormikroumgebungen

This protocol details the glycomics-guided glycoproteomics method, an integrated omics technology that offers comprehensive insights into the heterogeneous glycoproteome in complex tumor microenvironments required to better understand the glycobiology of cancers.

Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik ermöglicht eine umfassende Profilierung des Glykoproteoms in komplexen Tumormikroumgebungen 

Glycosylation is a common and structurally diverse protein modification that impacts a wide range of tumorigenic processes. Mass spectrometry-driven ...

Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Glykosylierung mit speziellen Endo-und Exoglycosidasen

Zusammenfassung

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Verbesserte In-Gel-reduktive β-Elimination für umfassende O-gebundene und Sulfo-Glykomik durch Massenspektrometrie

Glycoproteomics der extrazellulären Matrix: eine Methode zur Intact Glycopeptidthioestern Analyse unter Verwendung von Massenspektrometrie

Eine quantitative Glycomics und Proteomics Kombinierte Reinigungsstrategie

Massenspektrometrische Analyse Glycosphingolipid Antigene

N-glycan Profiling of Glycoproteins by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Fluorescence and Mass Spectrometric Detection

Recombinant Production of Bifidobacterial Endoglycosidases for N-glycan Release

Die Anwendung offener suchbasierter Ansätze zur Identifizierung von Acinetobacter baumannii O-verknüpften Glykopeptiden

Nonspecific Proteolysis-Based Glycomics Strategy for Bacterial Glycoproteins

Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik ermöglicht eine umfassende Profilierung des Glykoproteoms in komplexen Tumormikroumgebungen

Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik ermöglicht eine umfassende Profilierung des Glykoproteoms in komplexen Tumormikroumgebungen