Dieses Protokoll rationalisiert die Identifizierung von bakteriellen Glykop%eptiden, so dass Forscher neue Glykosylierungsereignisse sowie die Unterschiede in den Glykanen, die für die Glykosylierung zwischen Stämmen verwendet werden, identifizieren können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es Nicht-Glykosylierungsexperten ermöglicht, potenzielle Glykosylierungsereignisse in bakteriellen Proteomproben zu identifizieren. Die offene Suche ist ein allgemein anwendbarer Ansatz, der zur Identifizierung einer Reihe von Modifikationen, nicht nur der Glykosylierung, verwendet werden kann und auf jede Proteomprobe angewendet werden kann.
Um STB-RPS-Stop-and-Go-Extraktionsspitzen vorzubereiten, verwenden Sie eine stumpfe 14-Gauge-Nadel, um drei STB-RPS-Scheiben aus einer 47-Quadratmillimeter-STB-RPS-Membran zu entfernen, um 50 Mikrogramm Peptid zu binden. Für größere Peptidmengen erhöhen Sie die Anzahl der Bandscheiben entsprechend. Bevor Sie die SDB-RPS-Tischspitzen verwenden, waschen Sie die Spitzen, indem Sie 150 Mikroliter 100% Acetonitril zugeben und den Puffer durch Zentrifugation oder sanften Druck mit einer Spritze drehen.
Als nächstes waschen Sie die Spitzen mit 150 Mikrolitern 30% Methanol mit 1% TFA und gleichen dann die Spitzen mit 150 Mikrolitern 90% Isopropanol mit 1% TFA aus. Nach dem Äquilibrieren laden Sie die Proteomproben durch Zentrifugation oder mit einer Spritze auf die STB-RPS-Tischspitzen. Dann waschen Sie die Spitzen mit 150 Mikrolitern 90% Isopropanol, das 1% TFA enthält, gefolgt von 150 Mikrolitern 1% TFA.
Um die Peptide aus den STB-RPS-Stufenspitzen zu eluieren, verwenden Sie 150 Mikroliter 5% Ammoniumhydroxid und 80% Acetonitril, die zu einer einzigen Spitze hinzugefügt werden, und sammeln Sie die eluierten Proben in einzelnen Röhrchen durch sanften Druck mit einer Spritze. Alternativ, wenn Sie durch Zentrifugation eluieren, verwenden Sie 150 Mikroliter bei 5% Ammoniumhydroxid in 80% Acetonitril, das zu allen Stufenspitzen hinzugefügt wird, und sammeln Sie es in einer sauberen Platte. Trocknen Sie die eluierten Peptide durch Vakuumzentrifugation bei 25 Grad Celsius.
Als nächstes, um die Glykopeptidproben anzureichern, bereiten Sie eine zwitterionische hydrophile Wechselwirkungsflüssigkeitschromatographie oder ZIC-HILIC, Stufenspitzen vor. Entfernen Sie eine C8-Disc aus einer 470-Quadratmillimeter-C8-Membran mit einer stumpfen 14-Gauge-Nadel und packen Sie die Disc in eine P-200-Spitze, um eine Fritte zu erzeugen. Fügen Sie dann etwa fünf Millimeter ZIC-HILIC-Material, das in 50% Acetonitril resuspendiert ist, auf die Fritte auf, indem Sie mit einer Spritze vorsichtig Druck ausüben.
Bevor Sie die Spitzen verwenden, gleichen Sie das Harz mit 20 Bettvolumen ZIC-HILIC-Elutionspuffer aus, wobei 10 Mikroliter Volumen über dem Harz verbleiben, um sicherzustellen, dass das Harz nicht austrocknet. Waschen Sie dann das Harz nacheinander mit 20 Bettvolumen ZIC-HILIC-Vorbereitungspuffer, gefolgt von 20 Bettvolumen ZIC-HILIC-Lade- oder Waschpuffer. Als nächstes resuspendieren Sie die verdauten und getrockneten Peptide im ZIC-HILIC-Ladepuffer auf eine Endkonzentration von vier Mikrogramm pro Mikroliter.
Wirbeln Sie kurz für eine Minute, um sicherzustellen, dass die Proben wieder suspendiert sind, und drehen Sie sie dann für eine Minute bei 2000 mal G und 25 Grad Celsius. Nach dem Spinnen die resuspendierte Peptidprobe auf die konditionierte ZIC-HILIC-Säule laden und dann die Säule dreimal mit 20 Bettvolumina des ZIC-HILIC-Ladepuffers waschen, indem Sie vorsichtig Druck mit einer Spritze ausüben. Zum Schluss die Glykopeptide mit 20 Bettvolumina des ZIC-HILIC-Elutionspuffers in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen elutieren, indem man vorsichtig Druck mit einer Spritze ausübt, und dann das Elutionsmittel durch Vakuumzentrifugation bei 25 Grad Celsius trocknen.
Für die LC-MS-Analyse resuspendieren Sie die Proben in Puffer A* auf eine Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Mikroliter und laden Sie die Proben dann auf einen HPLC-UPLC, der mit einem MS gekoppelt ist, um die Trennung und Identifizierung von Glykopeptiden zu ermöglichen. Überwachen Sie die resultierende MS-Datensammlung und stellen Sie sicher, dass die Daten mit den gewünschten Parametern gesammelt werden. Um die Proteom- und Glykopeptid-angereicherten Proben zu analysieren, öffnen Sie FragPipe und klicken Sie auf die Registerkarte Workflow.
Wählen Sie im Pulldown-Menü Workflow die Option Suche öffnen aus, und klicken Sie auf Dateien hinzufügen, um die zu durchsuchenden Datendateien in FragPipe zu importieren. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Datenbank und anschließend auf Download, um den Download-Manager zum Herunterladen von Proteomdatenbanken von UniProt mit einer UniProt-Zugangsnummer zu starten. Klicken Sie im Download-Manager auf die Option Lockvögel und Verunreinigungen hinzufügen, um Lockvögel und kontaminierende Proteine in diese Datenbank zu integrieren.
Klicken Sie anschließend auf die Registerkarte MSFragger, und erhöhen Sie dann im Feld Spitzenabgleich die Massentoleranz des Vorläufers von 500 Dalton auf 2.000 Dalton, um große Änderungen zu identifizieren. Klicken Sie auf die Registerkarte Ausführen, um den Speicherort der Ausgaben von FragPipe zu definieren, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Ausführen, um die Suche zu starten. Identifizieren Sie mit hochsicheren Glykopeptiden die häufig beobachteten Glykan-assoziierten Ionen, um die Identifizierung von Glykopeptiden zu verbessern.
Klicken Sie anschließend auf die Registerkarte MSFragger, und fügen Sie die ermittelten Deltamassen der beobachteten Glykane den Abschnitten Variable modifications und Mass Offsets hinzu, wobei einzelne Massen durch einen Schrägstrich getrennt sind. Dann fügen Sie die Glykan-assoziierten Fragmentmassen dieser Glykane in den Glyco / Labile Mods-Abschnitt von MSFragger hinzu. Laden Sie schließlich alle MS-Daten, die mit proteomischen Studien verknüpft sind, in zentralisierte proteomische Repositories hoch, z. B. die PRIDE- oder MassIVE-Repositories.
Die offene Suche nach dem Acinetobacter baumannii-Stamm AB307-0294 ergab zwei dominante Deltamassen, die 648,25 und 692,28 Dalton entsprechen. Es ist bekannt, dass die ACICU-Kapsel aus einer Tetrasaccharid-K-Einheit besteht, die einer vorhergesagten Masse von 843,31 Dalton entspricht. Diese Kapselstruktur stimmt mit der am häufigsten beobachteten Deltamasse innerhalb der ACICU überein.
Die offene Suchanalyse des Stammes D1279779 ergab das Vorhandensein mehrerer Deltamassen, die mit 203,08, 794,31 und 1588,62 Dalton übereinstimmen. Mit dem interaktiven Peptid-Spektralannotator wurden Glykopeptide, die in drei A.baumannii-Stämmen identifiziert wurden, bewertet, wobei potenzielle Glykan-assoziierte Ionen aufgedeckt wurden. Glykan-fokussierte Suchen führten zu einem bemerkenswerten Anstieg der Gesamtzahl der Glykopeptid/Peptid-Spektralübereinstimmungen, die über alle drei A.baumannii-Stämme identifiziert wurden, was einem Anstieg von 37% bei ACICU, einem Anstieg von 117% bei AB307-0294 und einem Anstieg von 363% bei D1279779 entspricht.
Bei einzelnen MS-Ereignissen erhöht die Einbeziehung von glykanspezifischen Informationen typischerweise den beobachteten Hyperscore, obwohl dieser Anstieg stark glykanabhängig ist. Stellen Sie bei der ZIC-HILIC-Anreicherung sicher, dass das Harz immer nass bleibt, da der Verlust von Lösungsmitteln die Isolierung von Glykopeptiden beeinträchtigen kann. Daten über Unterschiede in der Glykosylierung können verwendet werden, um Mutagenesestudien zu informieren oder Genklassen zu identifizieren, die für die Glykanbiosynthese verantwortlich sind.
Mit der offenen Datenbanksuche haben wir begonnen, die Glykanvielfalt über Bakteriengattungen hinweg zu charakterisieren. Dies hat gezeigt, dass die bakterielle Glykosylierung sowohl häufiger als auch weitaus vielfältiger ist, als wir einst dachten.
