Diese Arbeit wurde finanziert, zum Teil durch Zuschüsse NIH HL087653 und HL105314. Einige der Methoden wurden im Labor von Dr. Robert Mecham an der Washington University School of Medicine entwickelt.

1. Ultraschall-und Drucksystem <ol><li> Entlang der Ultraschall-System nach den Anweisungen des Herstellers (Vevo 770 VisualSonics). Füllen Sie den geeigneten Sonde (Alter E18 - Modell P7 = 708, Alter&gt; = P7 Modell 707B) mit destilliertem Wasser und eine Verbindung mit dem Ultraschall-System. Legen Sie die Sonde in den einstellbaren Stand auf der ungefähren Orientierung notwendig, um eine lange LV-Achs-Ansicht für eine Maus auf dem Imaging-Plattform montiert, so dass der LV Spitze in Richtung der Injektion Arm gerichtet ist zu erhalten. </li><li> Das Drucksystem aus einem mit Flüssigkeit gefüllten Druckwandler, Brückenverstärker, Datenerfassung und Datenerfassungssoftware (LabChart). Die Anschlüsse bestehen aus Drei-Wege-Hähne, Schläuche, Luer-Locks und Schlauchtüllen. Ein 20 ml Spritze mit 10% heparinisierter Kochsalzlösung zum Spülen an einem Ende aufgefüllt. Das andere Ende wird mit einer Nadel und einer 3 ml Spritze Körper zur Verwendung als Gehäuse, um die Nadel in der Rohrleitung Injektionsarms (Abbildung 1) zu halten modifiziert. </li><li&gt; Kalibrieren Sie den Druckwandlersystem mit einem Manometer. </li><li> Montieren der Nadel Schlauch und dem Gehäuse in der Injektionsarms des Ultraschallsystems. Klemmen Sie den Druckaufnehmer in einem Ring-Stand auf der ungefähren Höhe des Imaging-Plattform. Befestigen Sie eine entsprechende Nadel für die Altersgruppe der Maus (Alter E18 - P3 = 30G, Alter&gt; P3 = 25G) an der Nadel Schlauch. Kleinere Nadeln erhalten verstopft zu erleichtern, sind schwieriger zu durch die Brustwand voranzubringen, und eine langsamere Reaktionszeit. Daher ist die größte Größe, die Nadel in der LV Lumen passt für jedes Alter. </li><li> Legen Sie einen Berg von Ultraschall-Gel auf dem Imaging-Plattform und vorsichtig eine Linie mit der Sonde mit dem verstellbaren Ständer, so dass die Nadel direkt in das Gel vorangetrieben werden unter dem Zentrum des Imaging-Sonde (Abbildung 2). Die Nadel muss weit genug unter die Sonde sein, um nicht durchlöchern die Sondenabdeckung, aber nahe genug, um innerhalb der Sonde Schärfentiefe sein. Falls erforderlich, kann die Nadel von Hand gebogen werden, so dass es in th bleibte richtige Flugzeug während seiner Reise. </li><li> Aufrechterhaltung der Ausrichtung, die Nadel zurückziehen und heben Sie die Imaging-Sonde, um eine Maus auf dem Imaging-Plattform platzieren. Spülen Sie die Nadel nicht mit einer Gel, das die Spitze eingegangen ist, zu beseitigen. </li></ol> 2. Maus-Vorbereitung <ol><li> Alle Methoden in diesem Protokoll haben gezeigt, von der Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt worden. Anesthetize eine zeitgesteuerte schwangere Mutter (E18) oder neugeborenen Mäusen (P1 - 20) durch kontinuierliches Einatmen von 1,5% Isofluran. Schläuche lassen sich in einem Standard-Nasenkonus eingefügt werden, um den kleinen Kopf eines frühen neonatalen Maus (P1 - 15) unterzubringen. </li><li> Sichern Sie die Maus an den Imaging-Plattform des Ultraschall-System in einer Rückenlage mit der Position LV Spitze in Richtung des Injektionsarm. Für Schwangere gelten Ultraschall-Gel auf die Herzfrequenz mit der beiliegenden EKG-Detektor überwacht und legen Sie die rektale Thermometer zur Regelung der Körpertemperatur. Neugeborene Mäuse sind zu klein foder diese Detektoren, so Herzfrequenz während der Druckmessungen überwacht und die Körpertemperatur wird mit einem externen Wärmelampe gehalten. </li><li> Entfernen Sie Haare aus dem Bauch der schwangeren Mutter oder der Brust des jungen Maus mit einer Enthaarungscreme. Neugeborenen Mäusen (P1 - 10) benötigen keine Haarentfernung. </li><li> Für schwangere Mütter, schnitt den Bauch mit Dissektion und einer gebogenen Pinzette. Externalisieren ein Uterushorn und auf Gaze angefeuchtet mit warmer Kochsalzlösung. Sorgfältig zu manipulieren, einen Embryo in die richtige Position, um eine parasternal langen Achse des LV mit der Ultraschallsonde zu erhalten. Messen Sie den Druck in allen Embryonen auf dieser Seite vor Externalisierung der anderen Uterushorn. Halten alle Embryonen und den Bauch der Mutter feucht periodische Zugabe von warmer Kochsalzlösung. </li></ol> 3. Druckmessung <ol><li> Ort vorgewärmt, entgastem Ultraschall-Gel auf die embryonalen oder neonatalen Maus. Neugeborenen Mäusen, die nicht gewesen sein depilierter sollte eine kleine Menge Ultraschallgel Verreiben auf der Brust, bevor das restliche Ultraschallgel angelegt wird, um Kopplung zu verbessern. Senken Sie die Imaging-Sonde und stellen Sie den Winkel des Imaging-Plattform, um eine optimale LV parasternal langen Achse zu erhalten. Verstellen Sie nicht die Winkel der Sonde, weil die Nadel Ausrichtung gehen verloren. </li><li> Unter Beobachtung der LV Bild auf dem Ultraschall-Bildschirm langsam vorwärts, bis es die Nadel in der Nähe der Unterseite der Sonde ist. Stellen Sie die Nadel und Sonde können, falls erforderlich, um eine Ausrichtung Verschiebungen zu korrigieren. Vorsichtig spülen Sie die Nadel mit Kochsalzlösung. Starten Sie die Aufnahme von Daten und Null Druck den Druckwandler mit dem LabChart Software. Der Wandler driftet mit der Temperatur und der Position, so ist es wichtig, um es genau auf Null vor jeder Messung in jeder Maus. </li><li> Langsam Die Nadel, bis sie am Rand des Ultraschall-Bild zu sehen ist, aber noch nicht im LV. Stellen Sie die Nadel können, falls erforderlich, um die LV an der gewünschtenApex. Stellen Sie die Sonde Position, falls nötig, um ein klares Bild der Nadel aufrecht zu erhalten. Schieben Sie die Nadel in den LV-Lumen (Abbildung 3), während die Aufzeichnung von Druckdaten und die Überwachung der Nadel Lage auf dem Ultraschallbild. Der Beginn der pulsatilen Aufnahmen aus dem Druckwandler bestätigt die Position innerhalb der LV Lumen (4). </li><li> Wenn die Nadel scheint in der LV-Lumen sein, aber Druck-Aufnahmen sind nicht pulsatilen, bündig mit einem leichten Schlag auf den Kolben der Spritze, bis nur ein Druckanstieg detektiert wird (ca. 5 - 10 l Volumen). Diese sollten jedoch keine Clogs, die verhindert werden kann eine genaue Ablesung. Wenn Druckablesungen noch nicht pulsierend, kann die Nadel über oder unter dem korrekten Ebene liegen und nicht in den LV Lumen eingeführt werden. Ziehen Sie die Nadel, spülen mit Kochsalzlösung, und vorher noch einmal. Wenn pulsatile Lesungen immer noch nicht erhalten werden, gehen Sie zum nächsten Maus. Verwenden Sie eine neue Nadel für jede Maus. </li><li> Erfolgreiche Druckwerte können von 75% erzielt werdendie embryonalen und neugeborenen Mäusen versucht. Lesungen sollten 5 - 10 Minuten je und die Druckdaten für eine Maus sollte nicht im Lieferumfang enthalten, wenn die Herzfrequenz signifikant verschieden sind als erwartet werden (Abbildung 5A). Die Herzfrequenz hat einen signifikanten Effekt auf Herz-Kreislauf-Maßnahmen und veränderte Herzfrequenz sind bezeichnend für Herzbeschwerden. Embryonale Not tritt in der Regel 1 bis 1,5 Stunden nach der ersten Externalisierung der Gebärmutter, ist so wichtig, Geschwindigkeit zur Messung von Drücken in einem ganzen Wurf. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Alle Ergebnisse gelten für C57BL6J Mäusen. Ein Bild von der Nadel in der LV Lumen für einen P1 Maus in 3 gezeigt. Die Nadel ist notwendig zum Durchstechen der Brustwand und Zugang zu dem kleinen LV Lumen, aber es erhöht die Reaktionszeit des Drucksystems. Wenn eine ungefähre Schritt Druckanstieg manuell auf das System angewendet, ist die Zeit bis 67% der maximalen Druck erreicht 0,067 sichc mit dem Schlauch nur (wahrscheinlich Hinweis auf die tatsächliche Zeit, den Druck Schritt gelten), 0,105 Sekunden mit einer 25 G-Nadel und 0,529 Sekunden mit einer 30 G-Nadel. Die Verzögerung bei Erreichen der maximalen Druck in den Kurven vollständig in 4A und 4C ersichtlich ist. Obwohl die Reaktionszeit ist langsamer mit der 30G Nadel wird die Wellenform besser auf den embryonalen und frühen neonatalen Stadien gefangen genommen, weil die Herzfrequenz steigt mit dem Alter bei Mäusen 5. Trotz dieser Einschränkung kann der systolische Druck unter der Annahme berechnet, dass die wahre LV diastolischen (Mindest-) Druck Null ist, und der systolische (maximale) LV Druck ist zwei mal die mittlere LV Druck von den Lesungen im Steady State (4B und 4D bestimmt ) 6. Es wird allgemein angenommen, dass der systolische LV und arteriellen Drücke gleich sind. Die gemessenen Herzfrequenzen und berechnet LV Drücke für verschiedene Altersstufen zwischen E18 und P14 sind in Abbildung 5 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/3756/3756fig1.jpg" /> Abbildung 1. Das Bild des Druckaufnehmers mit angeschlossenem Drei-Wege-Hähne, männlich (M) und weiblichen (F) Luer-Lock-Anschlüsse, Schlauchtüllen, Schläuche, Spritzen und Nadeln. <img src="/files/ftp_upload/3756/3756fig2.jpg" /> Abbildung 2. Das Bild des bis die Nadel mit der Imaging-Sonde (A) ausrichten gesetzt. Abbildungssystem Plattform ist so gedreht, dass der LV Spitze des Maus vor der Injektion Arm. Die Sonde wird in dem verstellbaren Ständer in der ungefähren Orientierung notwendig angebracht, um eine LV langen Achse Bild zu erhalten. Die Nadel Schlauch Gehäuse in der Einspritzleitung Arm montiert. Die Nadel wird in einem Haufen Ultraschallgel auf der Imaging-Plattform, um den richtigen Winkel und vertikale und horizontale Position in Bezug auf die Abbildungssonde (B) zu bestimmen vorgeschoben. <img src="/files/ftp_upload/3756/3756fig3.jpg" /> Abbildung 3. Das Bild der Nadel (N) vorangetrieben durch die Brustwand (CW) undin den LV Lumen in einem P1-Maus. Maßstabsbalken = 0,1 mm. <img src="/files/ftp_upload/3756/3756fig4.jpg" /> 4. Beispiel pulsierenden Druckablesungen, wenn die Nadel die LV eines E18 (A) und P14 (C) Mauscursor. Es gibt eine Verzögerung im Erreichen eines stationären Zustand durch die Reaktionszeit des Systems mit der Nadel befestigt ist. Zoom Blick auf die Messwerte in einem stabilen Zustand in B und D. Beachten Sie, dass die Mindest-E18 LV Druck nahe Null sind dargestellt, aber die volle Wellenform von Null bis zum maximalen Druck kann nicht bei den höheren Herzfrequenzen von P14 Mäusen aufgenommen werden. Die mittlere Drücke werden aus den stationären Messungen gemessen und es wird angenommen, dass systolischer Druck = 2 x gemessenen mittleren Druck. <img src="/files/ftp_upload/3756/3756fig5.jpg" /> Bild 5 gemessen Herzfrequenz (A) und berechnet systolischen Druck LV (B) für E18 -. P14 Mäusen. N = 7 für E18, 5 für P1, P3 für 22, 23 für P7 und P14 für 16 <sup&gt; 7.5.

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	<li>Ji, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+cardiac+function+during+early+mouse+embryogenesis+coincides+with+entry+of+primitive+erythroblasts+into+the+embryo+proper.">Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper.</a> Circ. Res. 92 (2), 133-135 (2003).</li><li>Ishiwata, T., Nakazawa, M., Pu, W. T., Tevosian, S. G., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+ventricular+diastolic+function+correlate+with+changes+in+ventricular+myoarchitecture+in+normal+mouse+embryos.">Developmental changes in ventricular diastolic function correlate with changes in ventricular myoarchitecture in normal mouse embryos.</a> Circ. Res. 93 (9), 857-865 (2003).</li><li>Huang, Y., Guo, X., Kassab, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axial+nonuniformity+of+geometric+and+mechanical+properties+of+mouse+aorta+is+increased+during+postnatal+growth.">Axial nonuniformity of geometric and mechanical properties of mouse aorta is increased during postnatal growth.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 290 (2), H657-H664 (2006).</li><li>Ishii, T., Kuwaki, T., Masuda, Y., Fukuda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+blood+pressure+and+baroreflex+in+mice.">Postnatal development of blood pressure and baroreflex in mice.</a> Auton. Neurosci. 94 (1-2), 34-41 (2001).</li><li>Le, V. P., Knutsen, R. H., Mecham, R. P., Wagenseil, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+aortic+diameter+and+compliance+precedes+blood+pressure+increases+in+postnatal+development+of+elastin-insufficient+mice.">Decreased aortic diameter and compliance precedes blood pressure increases in postnatal development of elastin-insufficient mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2011).</li><li>Wagenseil, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vessel+elasticity+alters+cardiovascular+structure+and+function+in+newborn+mice.">Reduced vessel elasticity alters cardiovascular structure and function in newborn mice.</a> Circ. Res. 104 (10), 1217-1224 (2009).</li><li>Wagenseil, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+elastin+to+aortic+development+in+mice.">The importance of elastin to aortic development in mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (2), H257-H264 (2010).</li><li>Ramirez, F., Sakai, L. Y., Rifkin, D. B., Dietz, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+microfibrils+in+development+and+disease.">Extracellular microfibrils in development and disease.</a> Cell. Mol. Life Sci. 64 (18), 2437-2446 (2007).</li><li>Li, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+point+mutations+cause+an+obstructive+vascular+disease,+supravalvular+aortic+stenosis.">Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis.</a> Hum. Mol. Genet. 6 (7), 1021-1028 (1997).</li><li>Roth, D. M., Swaney, J. S., Dalton, N. D., Gilpin, E. A., Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+anesthesia+on+cardiac+function+during+echocardiography+in+mice.">Impact of anesthesia on cardiac function during echocardiography in mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 282 (6), H2134-H2140 (2002).</li><li>Phoon, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tools+for+the+developmental+biologist:+ultrasound+biomicroscopy+of+mouse+embryonic+development.">Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development.</a> Pediatr. Res. 60 (1), 14-21 (2006).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das Protokoll hier vorgestellten stellt ein Verfahren zum Messen LV Druck in späten und frühen embryonalen neugeborenen Mäusen. Die wichtigste Einschränkung dieses Protokolls ist die zeitliche Auflösung des Drucksystems. Das Drucksignal wird gedämpft, da es von der LV bewegt sich durch die Nadel an den Wandler, und nur der mittlere Druck-Werte aufgezeichnet werden können. Die Dämpfung kann mit der größten Nadel möglich minimiert werden, sondern muss die Nadel innerhalb des LV Lumen für verschiedene alte Mäu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Hochauflösende Ultraschall-System </td><td> VisualSonics </td><td> Vevo 770 </td><td> Oder anderen geeigneten Ultraschall-System </td></tr><tr><td> Hochfrequenz-Ultraschall-Sonden </td><td> VisualSonics </td><td> 708 und 707B </td><td></td></tr><tr><td> Imaging-Plattform und Injektionsarm </td><td> VisualSonics </td><td> Imaging Station 2 </td><td> Mit EKG und Temperatur Regelung der Plattform </td></tr><tr><td> Druckaufnehmer </td><td> AD Instruments </td><td> MLT 844 </td><td></td></tr><tr><td> Brückenverstärker </td><td> AD Instruments </td><td> ML221 </td><td></td></tr><tr><td> Datenerfassungssystem </td&gt; <td> AD Instruments </td><td> ML866 </td><td></td></tr><tr><td> Daten-Recording-Software </td><td> AD Instruments </td><td> LabChart </td><td></td></tr><tr><td> Ring stehen und klemmen </td><td> Verschiedene Anbieter </td><td></td><td> Um Druckaufnehmer während der Messungen halten </td></tr><tr><td> 3-Wege-Hähne mit Luer-Anschlüsse, Steckerverriegelungselement </td><td> Cole Parmer </td><td> 30600-02 </td><td></td></tr><tr><td> 1/16 &quot;ID Tygon-Schlauch </td><td> Cole Parmer </td><td> 06408 </td><td></td></tr><tr><td> Männliche und weibliche Luer w / 1/16 &quot;Schlauchtülle </td><td> Cole Parmer </td><td> 45510-50 45510-00 </td><td></td></tr><tr><td> 24 &quot;-Schlauch mit männlichen und weiblichen Luer an jedem Ende </td><td> Cole Parmer </td><td> 30600-60 </td><td></td></tr><tr><td> 3 und 10-ml-Spritzen </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 30 und 25G Nadeln </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td> 1,5 Zoll in der Länge </td></tr><tr><td> Big Ben Manometer </td><td> Riester </td><td> 1456-100 </td><td></td></tr><tr><td> Saline </td><td> Verschiedene Anbieter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Verschiedene Anbieter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ultraschallgel </td><td> Parker </td><td> Aquasonic 100 </td><td></td></tr><tr><td> Haar-Entferner Lotion </td><td> Nair </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring left ventricular pressure in late embryonic and neonatal mice

Der Blutdruck steigt deutlich während der embryonalen und postnatalen Entwicklung bei Wirbeltieren. Bei der Maus ist der Blutfluss erste nachweisbare rund embryonalen Tag (E) 8.5 1. Systolischer linksventrikulärer (LV) Druck ist bei 2 mmHg und 11 mmHg E9.5 an E14.5 2. An diesen mittleren Embryonalstadien ist der LV deutlich sichtbar durch die Brustwand für invasive Druckmessungen, da die Rippen und die Haut noch nicht voll entwickelt sind. Zwischen E14.5 und Geburt (etwa E21) bildgebende Verfahren zu verwenden, um die LV ansehen zu können. Nach der Geburt, des mittleren arteriellen Druck steigt von 30 bis 70 mmHg aus postnatalen Tag (P) 2 - 35 3. Jenseits von P20, kann arteriellen Druck mit Solid-State-Katheter (dh Millar oder Scisense) gemessen werden. Bevor P20, sind diese Katheter zu groß für die Entwicklung der Maus Arterien und arteriellen Druck zu messen mit benutzerdefinierten gezogen Kunststoff-Katheter an Flüssigkeit gefüllte Druckaufnehmern 3 oder Glasmikropipetten att werdenschmerzte zu Servo null Druckaufnehmer 4. Unsere jüngsten Arbeiten hat gezeigt, dass der größte Anstieg des Blutdrucks während der späten embryonalen zu frühen postnatalen Phase bei Mäusen 5-7 auftritt. Dieser große Anstieg des Blutdrucks kann glatter Muskelzellen (SMC) Phänotyp bei der Entwicklung von Arterien beeinflussen und steuern wichtige Mechanotransduktion Veranstaltungen. In der menschlichen Krankheit, wo die mechanischen Eigenschaften zu entwickeln Arterien, die durch Defekte in Proteinen der extrazellulären Matrix (dh Marfan-Syndrom 8 und supravalvuläre Aortenstenose 9) gefährdet sind die rasanten Veränderungen im Blutdruck kann während dieser Frist zu Krankheits-Phänotyp und Schwere durch Veränderungen in der Mechanotransduktion beitragen Signale. Daher ist es wichtig, dass die Veränderungen des Blutdrucks während der späten embryonalen und neonatalen Zeiträume in Mausmodellen menschlicher Erkrankungen zu messen. Wir beschreiben eine Methode zur Messung LV Druck im spätenembryonalen (E18) und der frühen postnatalen (P1 - 20) Mäusen. Eine Nadel, die an einem mit Flüssigkeit gefüllten Druckwandler in der LV unter Ultraschallführung eingefügt. Es wird darauf geachtet, um normale Herzfunktion während der experimentellen Protokoll halten, besonders für die embryonale Mäuse. Repräsentative Daten präsentiert und Einschränkungen des Protokolls diskutiert.

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Measuring Left Ventricular Pressure in Late Embryonic and Neonatal Mice

Messen Drucks der linken Herzkammer (LV) in der embryonalen und neugeborenen Mäusen beschrieben. Der Druck wird durch Einführen einer Nadel mit einem Fluid gefüllten Wandler in der LV unter Ultraschallführung gemessen. Es ist darauf zu normaler Herzfunktion während des experimentellen Protokolls zu halten.

Die Messung linksventrikulärer Druck in der späten embryonalen und neugeborenen Mäusen

Blood pressure increases significantly during embryonic and postnatal development in vertebrate animals. In the mouse, blood flow is first detectable ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.8K Aufrufe.  Saint Louis University. Messen Drucks der linken Herzkammer (LV) in der embryonalen und neugeborenen Mäusen beschrieben. Der Druck wird durch Einführen einer Nadel mit einem Fluid gefüllten Wandler in der LV unter Ultraschallführung gemessen. Es ist darauf zu normaler Herzfunktion während des experimentellen Protokolls zu halten.

Serie: Measuring Left Ventricular Pressure in Late Embryonic and Neonatal Mice

Measuring and Modeling Contractile Drying in Human Stratum Corneum

Stratum corneum (SC) is the most superficial skin layer. Its contact with the external environment means that this tissue layer is subjected to both cleansing agents and daily variations in ambient moisture; both of which can alter the water content of the tissue. Reductions in water content from severe barrier dysfunction or low humidity environments can alter SC stiffness and cause a build-up of drying stresses. In extreme conditions, these factors can cause mechanical rupture of the tissue. We have established a high throughput method of quantifying dynamic changes in the mechanical properties of SC upon drying. This technique can be employed to quantify changes in the drying behavior and mechanical properties of SC with cosmetic cleanser and moisturizer treatments. This is achieved by measuring dynamic variations in spatially resolved in-plane drying displacements of circular tissue samples adhered to an elastomer substrate. In-plane radial displacements acquired during drying are azimuthally averaged and fitted with a profile based on a linear elastic contractility model. Dynamic changes in drying stress and SC elastic modulus can then be extracted from the fitted model profiles.

This article describes a method of quantifying the dynamic drying behavior and mechanical properties of stratum corneum by measuring spatially resolved in-plane drying displacements of circular tissue samples adhered to an elastomer substrate. This technique can be used to measure how different chemical treatments alter drying and tissue mechanical properties.

Messung und Modellierung Kontraktile Trocknung im Bereich Human Stratum corneum

Stratum corneum (SC) is the most superficial skin layer. Its contact with the external environment means that this tissue layer is subjected to both ...

Forschung

Biotechnik

Ammonia Synthesis at Low Pressure

Ammonia can be synthesized at low pressure by the use of an ammonia selective absorbent. The process can be driven with wind energy, available locally in areas requiring ammonia for synthetic fertilizer. Such wind energy is often called &#34;stranded,&#34; because it is only available far from population centers where it can be directly used.
In the proposed low pressure process, nitrogen is made from air using pressure swing absorption, and hydrogen is produced by electrolysis of water. While these gases can react at approximately 400 &#176;C in the presence of a promoted conventional catalyst, the conversion is often limited by the reverse reaction, which makes this reaction only feasible at high pressures. This limitation can be removed by absorption on an ammine-like calcium or magnesium chloride. Such alkaline metal halides can effectively remove ammonia, thus suppressing the equilibrium constraints of the reaction. In the proposed absorption-enhanced ammonia synthesis process, the rate of reaction may then be controlled not by the chemical kinetics nor the absorption rates, but by the rate of the recycle of unreacted gases. The results compare favorably with ammonia made from a conventional small scale Haber-Bosch process.

Ammonia can be synthesized at low pressure by using a conventional catalyst and an ammonia selective absorbent.

Ammoniaksynthese bei niedrigem Druck

Ammonia can be synthesized at low pressure by the use of an ammonia selective absorbent. The process can be driven with wind energy, available locally in ...

Anatomically Realistic Neonatal Heart Model for Use in Neonatal Patient Simulators

Neonatal patient simulators (NPS) are artificial patient surrogates used in the context of medical simulation training. Neonatologists and nursing staff practice clinical interventions such as chest compressions to ensure patient survival in the case of bradycardia or cardiac arrest. The simulators used currently are of low physical fidelity and therefore cannot provide qualitative insight into the procedure of chest compressions. The embedding of an anatomically realistic heart model in future simulators enables the detection of cardiac output generated during chest compressions; this can provide clinicians with an output parameter, which can deepen the understanding of the effect of the compressions in relation to the amount of blood flow generated. Before this monitoring can be achieved, an anatomically realistic heart model must be created containing: two atria, two ventricles, four heart valves, pulmonary veins and arteries, and systemic veins and arteries. This protocol describes the procedure for creating such a functional artificial neonatal heart model by utilizing a combination of magnetic resonance imaging (MRI), 3D printing, and casting in the form of cold injection molding. Using this method with flexible 3D printed inner molds in the injection molding process, an anatomically realistic heart model can be obtained.

This protocol describes a procedure for creating functional artificial neonatal heart models by utilizing a combination of magnetic resonance imaging, 3D printing, and injection molding. The purpose of these models is for integration into the next generation of neonatal patient simulators and as a tool for physiological and anatomical studies.

Anatomisch realistischen neonatale Herzmodell für den Einsatz bei Neugeborenen Patienten Simulatoren

Neonatal patient simulators (NPS) are artificial patient surrogates used in the context of medical simulation training. Neonatologists and nursing staff ...

Mouse Model of Pressure Ulcers After Spinal Cord Injury

Pressure ulcers (PUs) are common debilitating complications of traumatic spinal cord injury (SCI) and tend to occur in soft tissues around bony prominences. There is, however, little known about the impact of SCI on skin wound healing in the context of animal models in controlled experimental settings. In this study, a simple, non-invasive, reproducible and clinically relevant mouse model of PUs in the context of complete SCI is presented. Adult male mice (Balb/c, 10 weeks old) were shaved and depilated. Post-depilation (24 h), mice were subjected to laminectomy followed by complete spinal cord transection (T9-T10 vertebrae). Immediately after, a skin fold on the back of the mice was lifted and sandwiched between two magnetic discs held in place for next 12 h, thus creating an ischemic area that developed into a PU over the following days. The wounded areas demonstrated tissue edema and epidermal disappearance by day 3 post-magnet application. PUs spontaneously developed and healed. Healing was, however, slower in the SCI mice compared to control non-SCI mice when the wound was created below the level of SCI. Conversely, no difference in healing was seen between SCI and control non-SCI mice when the wound was created above the level of SCI. This model is a potentially useful tool to study the dynamics of skin PU development and healing after SCI, as well as to test therapeutic approaches that may help heal such wounds.

Here, we describe a simple method to induce clinically relevant skin pressure ulcers (PUs) in a mouse model of spinal cord injury (SCI). This model can be used in pre-clinical studies to screen for different therapeutics for healing PUs in SCI patients.

Maus-Modell von Dekubitus nach Verletzungen des Rückenmarks

Pressure ulcers (PUs) are common debilitating complications of traumatic spinal cord injury (SCI) and tend to occur in soft tissues around bony ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Messung der globalen zellulären Matrix Metalloproteinase und metabolische Aktivität in 3D Hydrogele

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Methods for In Vivo Biomechanical Testing on Brachial Plexus in Neonatal Piglets

Neonatal brachial plexus palsy (NBPP) is a stretch injury that occurs during the birthing process in nerve complexes located in the neck and shoulder regions, collectively referred to as the brachial plexus (BP). Despite recent advances in obstetrical care, the problem of NBPP continues to be a global health burden with an incidence of 1.5 cases per 1,000 live births. More severe types of this injury can cause permanent paralysis of the arm from the shoulder down. Prevention and treatment of NBPP warrants an understanding of the biomechanical and physiological responses of newborn BP nerves when subjected to stretch. Current knowledge of the newborn BP is extrapolated from adult animal or cadaveric BP tissue instead of in vivo neonatal BP tissue. This study describes an in vivo mechanical testing device and procedure to conduct in vivo biomechanical testing in neonatal piglets. The device consists of a clamp, actuator, load cell, and camera system that apply and monitor in vivo strains and loads until failure. The camera system also allows monitoring of the failure location during rupture. Overall, the presented method allows for a detailed biomechanical characterization of neonatal BP when subjected to stretch.

Methods for In Vivo Biomechanical Testing on Brachial Plexus in Neonatal Piglets

Presented here are methods to perform in vivo biomechanical testing on brachial plexus in a neonatal piglet model.

Methoden zur biomechanischen Prüfung von BrachialPlexus in In Vivo bei neonatalen Ferkeln

Neonatal brachial plexus palsy (NBPP) is a stretch injury that occurs during the birthing process in nerve complexes located in the neck and shoulder ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

Optische Bildgebung von isolierten ventrikulären Myozyten

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

Musterung der Geometrie menschlicher embryonaler Stammzellkolonien auf konformen Substraten zur Kontrolle der Gewebe-Level-Mechanik

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Evaluation of Left Ventricular Structure and Function using 3D Echocardiography

Three-dimensional (3D) quantification of the left ventricle (LV) provides significant added value in terms of diagnostic accuracy and precise risk stratification in various cardiac disorders. Recently, 3D echocardiography became available in routine cardiology practice; however, high-quality image acquisition and subsequent analysis have a steep learning curve. The present article aims to guide the reader through a detailed 3D protocol by presenting tips and tricks and also by highlighting the potential pitfalls to facilitate the widespread but technically sound use of this important technique concerning the LV. First and foremost, we show the acquisition of a high-quality 3D dataset with optimal spatial and temporal resolution. Then, we present the analytical steps toward a detailed quantification of the LV by using one of the most widely applied built-in software. We will quantify LV volumes, sphericity, mass and also systolic function by measuring ejection fraction and myocardial deformation (longitudinal and circumferential strain). We will discuss and provide clinical examples about the essential scenarios where the transition from a conventional echocardiographic approach to a 3D-based quantification is highly recommended.

In this article, we provide a step-by-step acquisition and analysis protocol for the volumetric assessment and speckle-tracking analysis of the left ventricle by 3D echocardiography, particularly focusing on practical aspects that maximize the feasibility of this technique.

Bewertung der linksventrikulären Struktur und Funktion mittels 3D-Echokardiographie

Three-dimensional (3D) quantification of the left ventricle (LV) provides significant added value in terms of diagnostic accuracy and precise risk ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, multiple ligaments, and approximately 20 muscles. Unfortunately, shoulder pathologies (e.g., rotator cuff tears, joint dislocations, arthritis) are common, resulting in substantial pain, disability, and decreased quality of life. The specific etiology for many of these pathologic conditions is not fully understood, but it is generally accepted that shoulder pathology is often associated with altered joint motion. Unfortunately, measuring shoulder motion with the necessary level of accuracy to investigate motion-based hypotheses is not trivial. However, radiographic-based motion measurement techniques have provided the advancement necessary to investigate motion-based hypotheses and provide a mechanistic understanding of shoulder function. Thus, the purpose of this article is to describe the approaches for measuring shoulder motion using a custom biplanar videoradiography system. The specific objectives of this article are to describe the protocols to acquire biplanar videoradiographic images of the shoulder complex, acquire CT scans, develop 3D bone models, locate anatomical landmarks, track the position and orientation of the humerus, scapula, and torso from the biplanar radiographic images, and calculate the kinematic outcome measures. In addition, the article will describe special considerations unique to the shoulder when measuring joint kinematics using this approach.

Biplane videoradiography can quantify shoulder kinematics with a high degree of accuracy. The protocol described herein was specifically designed to track the scapula, humerus, and the ribs during planar humeral elevation, and outlines the procedures for data collection, processing, and analysis. Unique considerations for data collection are also described.

Messung der 3D-In-vivo-Schulterkinematik mittels biplanarer Videoradiographie

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...