R01HL082694 (JW);; American Heart Association, Founders affiliate (0855943D, GG); Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health 1R21HL092370-01 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG) finanziert Stony Wold - Herbert Fund, New York (SHP).

Ein. Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen und Rohre (Tabelle 1) wie folgt: <ol><li> Hanks-Lösung, kein Kalzium, Magnesium oder Indikators mit Penicillin (100 U / ml) / Streptomycin (100 mg / ml). </li><li> Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1x, kein Kalzium, kein Magnesium. </li><li> Ethanol, 70%, 500 ml machen. </li><li> Gepuffertem Formaldehyd, 7-10% mit PBS, 500 ml machen. </li><li> Anästhesie-Lösungen: <ol><li> Avertin. Vorsichtig mit 5 ml 2-Methyl-2-Butanol bis 5 g 2,2,2-Tribromethanol. Einmal gelöst, halten Stammlösung bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nehmen 0,25 ml der Stammlösung und verdünnen Sie es mit 10 ml 1xPBS in Glasboden Flasche. Wickeln Sie die Flasche mit Aluminiumfolie, bei 37 ° C, bis sie gelöst und dann Aliquot in 5 ml Polypropylen-Röhrchen und halten im Kühlschrank. Wärmen ein Aliquot am Morgen des Experiments. </li><li> Barbiturate. Verdünnen Stammlösung mit PBS zu geben 2,6% Barbiturat solution. Zeigen 3-4 ml Aliquots in Polypropylenröhrchen. </li></ol></li></ol></li><li> Organisieren drei Work-Bereiche (Abb. 1). </li><li><ol><li> Bereich A: Ordnen Sie die folgenden Punkte: Studie Formular Studie Identifikationsnummer, Datum, Körpergewicht, Gewicht der rechten Herzens, linke Herz und Septum aufzuzeichnen; Präzisionswaage (0-50 g auf 0,01 g genau), um das Körpergewicht zu bestimmen; Mikroebene zu Herzen Gewichte bei 0,001 g genau zu bestimmen; wiegen Boote; Anästhesie-Lösungen (eindeutig gekennzeichnet), kleine Dewar mit flüssigem Stickstoff; isolierten Behälter mit Eis, Rohre und 24-Well-Platte mit Blut und Gewebeproben (Tabelle 1) zu sammeln; chirurgische Instrumente ( Tabelle 2, Abbildung 2) und Lösungen für die Instrumente (Tabelle 1) zu reinigen. </li><li> Bereich B: Ordnen Sie die folgenden Punkte: Binokular, rechts Herzkatheter mit einem Druck Steuereinheit, die mit einem Verstärker und Laptop-Computer angeschlossen ist. Der Katheter wird in platziertein Becherglas mit Wasser. Vereinbaren chirurgische Instrumente (Tabelle 2), Teile der Naht abgeschnitten, um eine optimale Länge und in einen Wiegeschiffchen; Band (Autoklav Band ist optimal), um eine optimale Länge und Breite geschnitten und aufgereiht auf Mikroskop oder Labortisch für einfachen Zugang, Wattestäbchen und Haarentferner Lösung. Kalibrieren des Katheters zu Beginn der Studie. </li><li> Bereich C: Ordnen Sie die folgenden Punkte: Lupe Linse; Trachealkanüle; 1 ml Spritzen; Naht abgeschnitten, um eine optimale Länge und in eine Wiegeschiffchen, kleine Dewar mit flüssigem Stickstoff; isolierten Behälter mit Eis, Rohre und 24-Well-Platte zu sammeln BAL und Gewebeproben (Tabelle 1); chirurgische Instrumente (Tabelle 2); Lösungen durchzuführen BAL und die Trachealkanüle und die Instrumente (Tabelle 1) zu reinigen. </li></ol></li></ol> 2. Rechts Herzkatheter <ol><li> Wiegen mit der Maus über eine Präzisionswaage durch sanftes Auflegen Maus in eine Waage bHafer. Achten Sie darauf, das Tier sanft und leise zu behandeln. Notieren Gewicht. Die beschriebene Protokoll funktioniert am besten für Mäuse, die 20 g oder mehr sind, weil der Durchmesser der Jugularvene hat, um den Druck Katheters aufzunehmen, es ist möglich, kleinere Mäuse (17 g oder mehr), so lange wie die Vene katheterisieren groß genug ist. </li><li> Betäuben die Maus durch Injektion mit Avertin je nach Körpergewicht (10 ul / g), z. B. für 20 g geben 200 ul, für 25 g geben 250 ul, 30 g geben 300 ul. Die genaue Injektionsvolumen muss angepasst je nach Mausstamm werden. Stellen Sie sicher, um das Tier schonend und leise handhaben, weil die Reaktion auf Stress des Anästhetikums verändern kann. </li><li> Sobald die Maus sediert, am Doppel-plissierte Seidenpapier. Beachten Sie die ID-Nummer auf dem Papier. Reiben Haarentfernung Lotion in der ventralen Seite des Halses auf das Operationsfeld zu löschen. Platzieren Sie die Maus wieder auf dem Papier und warten 1-2 min. </li><li> Entfernen Sie Haare aus dem ventralendes Halses durch sanft streichelte das Haar gegen die Richtung des Haarwuchses mit Wattestäbchen. </li><li> Sorgfältig bestimmen die ausreichende Tiefe der Anästhesie durch Prüfen auf die Abwesenheit der Zehe Reflex: die Maus nicht, um ein Quetschen der Zehen reagieren. </li><li> Arbeitet schnell und entspannt, sollte der Rest des rechten Herzkatheter nicht länger als 10 Minuten, 3-6 min optimal. Es ist wichtig, dass das Gewebe nicht austrocknet, da der Katheter muss in die Vene gleiten und bewegen sich in der Vene auf einer Schicht von Feuchtigkeit. Konsistenten Timing des Verfahrens ist zur Erzeugung von Daten, die zwischen den Gruppen vergleichbar sind wichtig. </li><li> Bewegen Sie die Maus wieder auf Seidenpapier und Transfer mit Seidenpapier auf Styropor Bord. Fix Pfoten und Kopf in Ort mit Autoklaven Band. </li><li> Machen Inzision der Haut von Mandibeln bis zum Brustbein (Brustbein). </li><li> Sorgfältig sezieren die Schilddrüse grand nach oben zu den Unterkiefer, um die rechte Jugularvene eine freizulegennd Luftröhre. </li><li> Ort Styropor Bord halten Sie die Maustaste unter dem Dissektionsmikroskop mit der Fokusebene bereits vor Ort und die Linse auf etwa 0,8 x Vergrößerung (totale Vergrößerung [Objektiv x Okular] ist ca. 8x. </li><li> Sorgfältig microdissect die rechte Jugularvene durch Entfernen umliegenden Bindegewebes mit chirurgische Pinzette. </li><li> Legen Sie zwei Stück der Naht auf der rechten Halsschlagader. Tie das Nahtmaterial am nächsten zu den Unterkiefer zum Verschließen des Blutflusses in der Vene zu einem winzigen rieseln, platzieren die Naht, die an dem Brustbein / Brustbein zu einem lockeren Knoten um die Vene am nächsten ist. Man kann die winzige Blutrinnsal verwenden, um später feststellen das Loch in der Vene, sollte dies notwendig werden. </li><li> Atmen und zu entspannen (lockern die Muskeln im Nacken-und Unterkiefer), die Augen auf die Vene durch das Okular zu halten. Dadurch wird sichergestellt, dass Ihre Hände und Finger werden sicher bewegen, sanft und entspannt. Halten Sie die Vene mit einer Pinzette an der Seite am nächstendie Mandibeln, schnitt ein Loch in die Vene zwischen den beiden Fäden mittels Mikro-Schere mit der anderen Hand bedient. Legen Sie die Mikro-Schere, und halten diese Hand entspannt, für den Katheter spüren. Vorsichtig holen den Katheter hält ihn zwischen Daumen und Zeigefinger (Abb. 3). Legen des Katheters in das Loch der Vene. </li><li> Gently voranzutreiben den Katheter in das rechte Herz (Abbildung 3). Beachten Sie die Kennzeichnungen in den Katheter, der einen ungefähren Index dafür, wie weit der Katheter muss eingesetzt werden geben und beobachten das Monitor. Sobald die Druckkurven angezeigt werden, vorsichtig den unteren Naht um den Katheter. Weil der Katheter eine Zugfestigkeit, die ihm eine Spule, und weil der Atmung und Herzschlag des Maus hinzuzufügen Bewegung zusätzlich Anbringung des Katheters mittels Klebeband. </li><li> Nimm Druckmessungen für 2 Minuten für die spätere Analyse (Abbildung 4). </li><li> Öffnen Sie die Fadenhaltemittel den Katheter, dann sanft Retrieve Katheters. Wischen Sie den Teil hinter dem Druckaufnehmer legen zurück in den Becher mit Wasser. Berühren Sie nicht die Druckaufnehmer. </li><li> Übertragen Sie die Maus auf das Tissue-Papier zur Fläche A für die Euthanasie, Gewinnung von Blut und Milz Gewebe. Reinigen chirurgische Instrumente. </li><li> Starten Sie den Vorgang mit dem nächsten Tier. Wenn das Timing erlaubt, injizieren die Narkose während des Wartens auf den Druckverlauf (2,15) aufzeichnen. </li></ol> 3. Gewinnung von Blut und Milz Proben <ol><li> Inject Barbiturat-Lösung, 400 ul pro Maus und warten 1-2 min. Diese wird routinemäßig in unserem Labor durchgeführt, um die Möglichkeit, dass die Mäuse versehentlich aus avertin-Anästhesie erholen, während ausgeblutet zu vermeiden. Entsprechende Normierung des Versuchs wird durch Einspritzen des gleichen Dosis Barbiturat Lösung pro Maus und durch Warten dieselbe Zeitdauer vor der Ernte von Blut erreicht. Wenn durch die Institutional Animal Care zulässig und Verwenden Ausschuss undSolange die Tiere sorgfältig für die Narkosetiefe vor Ausbluten überwacht, kann dieser Schritt weggelassen werden. </li><li> Machen Einschnitt in den Unterleib. Öffnen Sie die Schwanzvene (Vena cava) und sammeln Blut mit einer Pipette. </li><li> Entfernen der Milz, oder ein Stück der Milz in das Eppendorf-Röhrchen und Schnellfrostmedium in flüssigem Stickstoff oder in die 24-Well-Platte in eine Vertiefung, die Hanks Puffer zur späteren Herstellung von Einzelzellen. </li><li> Übertragen der Maus auf dem Papiertuch Work-Bereich C zum Sammeln von BAL-, Lungen drainierenden Lymphknoten, Lunge und Herz Geweben. Reinigen chirurgische Instrumente. </li></ol> 4. Sammlung von Lunge und Herz Proben <ol><li> Sezieren die Luftröhre frei von Muskel-und Bindegewebe. Platzieren Pinzette unter der Luftröhre, ziehen Faden durch. Gently erzeugen genügend strecken, um ein Loch zu schneiden. Aufrechterhaltung der sanfte Dehnung, legen Sie die Trachealkanüle mit einem leicht Drehbewegung und Nahtmaterial Kanüle into Ort. Zum Einsetzen der Trachealkanüle, stellen Sie sicher, dass die Luftröhre feucht ist, wenn nötig einen Tropfen Hanks Lösung. Während des gesamten Verfahrens, atmen, entspannen Nacken und Kiefermuskeln zu halten Handbewegungen sicher und glatt. </li><li> Dissect öffnen den Brustkorb durch vorsichtiges Entfernen des Brustbein ab dem abdominalen Ende. Bitte nicht stören den Inhalt des Thorax, weil das macht es sehr schwer, den Lymphknoten zu finden. </li><li> Führen bronchoalveolären Lavage (BAL) durch vorsichtiges Einführen 1 ml Hanks-Puffer, sanft drehen Sie die Spritze und abrufen BAL. 3 Mal wiederholen, in der Nähe Rohr und auf Eis stellen. Während des gesamten Verfahrens beibehalten Augen auf dem Ende der Trachealkanüle, die mit der Spritze verbindet. Blick zum Brustkorb, um die Inflation und Deflation der Lunge zu beobachten. </li><li> Ernte Lunge Lymphknoten durch Halterippe Käfigwand mit einem Satz von Zangen, Auffinden und Abrufen des Lymphknotens mit weiteren Pinzette. Ort Lymphknoten in 24-Well-Platte. Es ist wichtig, kJetzt, wo zu suchen: ab dem Hals, der Eingang des Brustkorbs von der rechten Seite der Maus und siehe oben der Wirbelsäule (Abbildung 5). </li><li> Ernte Herzen und auf Seidenpapier. Isolieren Sie das rechte Herz durch vorsichtiges Sezieren neben dem Septum. Transfer zum Work-Bereich A wiegen, um das Gewicht protokollieren und Platz in Eppendorf-Röhrchen, um Einfrieren in flüssigem Stickstoff einrasten. </li><li> Zeigen Naht um den linken Lungenflügel, die Hauptbronchus zu schließen. Sezieren den linken Lungenflügel befreit, erfolgt in Eppendorf-Röhrchen und Schnellfrostmedium in flüssigem Stickstoff, oder Ort in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte mit Hanks-Lösung für eine spätere Isolierung einzelner Zellsuspensionen. </li><li> Legen Sie ca. 0,5 ml gepufferter Formaldehydlösung durch die Trachealkanüle in die verbleibenden Lungenlappen. Nach Inflation, sezieren die Lungenlappen aus dem Thorax und Ort in 50 ml Röhrchen mit Formaldehyd-Lösung. Für eine alternative Studiendesigns, kann die Lunge mit opti aufgeblasen werdenmal schneiden Medien (OCT, 1:4 verdünnt mit PBS) und eingefroren in einer Form, die das unverwässerte Oktober für die spätere Herstellung von Gefrierschnitten. Eine andere Studie Design könnte notwendig Erhalt Snap gefrorenen Lungengewebe und einzelne Zellsuspensionen aus den Lungen. In diesem Fall ist keine Inflation notwendig: sezieren die verbleibenden Lungenlappen; Abrufen über dem Thorax und ebenfalls in den 24-Well-Platte in eine Vertiefung, die Hanks Puffer. </li><li> Entfernen Trachealkanüle, sauber durch Spülen mit Hanks-Puffer, reinigen chirurgische Instrumente. </li></ol> 5. Analyse der Druckkurven aus dem rechten Herz-Katheter Generated Die aufgezeichneten rechtsventrikulären Druckdaten werden mit Hilfe LabChart 7-Software ohne Wissen der Gruppe Identität jeder Aufnahme. Mehr als 20 Kurven werden zufällig ausgewählt und die Differenz zwischen maximaler und minimaler ventrikulären Drucks für jede Kurve gemessen (AP). Die durchschnittliche AP berechnet wird, um das Recht geben, ventricular systolischen Druck.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die experimentelle Strömung hier skizzierten ermöglicht eine schnelle und gleichzeitige Messung der rechten ventrikulären systolischen Druck und Ernte von Proben für die Analyse der Antworten in der Lunge, des Herzens und des Immunsystems bei Mäusen. Das Verfahren kombiniert Herzen Physiologie Messungen Mikrodissektion und anschließende Gewebe Ernte für Studien an lebenden Zellen, histologische Analyse oder omics-Analyse der Gewebe. Der gesamte Vorgang dauert weniger als 20 Minuten pro Maus. Wegen der Arbeit-Bere...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenzien </td></tr><tr><td> 2-Methyl-2-butanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 152463 </td><td></td></tr><tr><td> 2,2,2-Tribromethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T48402 </td><td></td></tr><tr><td> desinfizierende Seife (Coverage Spray TB sowie Steris) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1629-08 </td><td></td></tr><tr><td> Ethylalkohol, 200 Proof, Absolute, wasserfrei ACS / USP Grade </td><td> PHARMCO-Aaper </td><td> 111000200 </td><td> Verdünnt auf 70% mit destilliertem Wasser </td></tr><tr><td> Formaldehyd-Lösung </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F1635-500ML </td><td> Verdünnen, um eine 7-10% formaldehyde Konzentration bei einer PBS Konzentration von 1x mit PBS-Stammlösung und Wasser </td></tr><tr><td> Hanks-Lösung, kein Kalzium, Magnesium </td><td> Fisher Scientific </td><td> 21-022-CV </td><td></td></tr><tr><td> Oktober </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin (10000 U / ml) / Streptomycin (10.000 mg / ml)-Lösung </td><td> Thermo Scientific </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), kein Kalzium, kein Magnesium, 1x und 10x Lösungen </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Natrium-Pentobarbital 26% </td><td> Fort Dodge Animal Health </td><td> NDC 0856-0471-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Labware </td></tr><tr><td> Platten 12, 24, 96 gut </td><td> Falke </td><td></td><td></td></tr&gt; <tr><td> Transferpipette </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-9BM </td><td></td></tr><tr><td> Tube, EDTA beschichteten </td><td> Sarstedt </td><td> 2013-08 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes 0,65 ml und 1,7 ml Mikro-Zentrifuge </td><td> VWR </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rohre 12 x 75 mm Polypropylen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-956-1D </td><td></td></tr><tr><td> Tubes, verschiedene Größen, Polypropylen </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Instrumentarium </td></tr><tr><td> Pinzetten, Dumon # 5 Fine </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzette, gebogen extra fein graefe-0.5mm Tipps </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11152-10 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzetten, extra fine graefe-0.5mm Tipps direkt </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11150-10 </td><td></td></tr><tr><td> Kanüle 18ga, 19 ga </td><td> BD </td><td> Precision Glide Needles </td><td> Schneiden Sie die optimale Länge, abgestumpft und außerhalb krächzte eine grobe äußere Oberfläche erstellen </td></tr><tr><td> Schere, Dissector Scheren-slim Klingen 9cm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14081-09 </td><td></td></tr><tr><td> Naht für BAL, geflochtene Seidenfaden, 4-0 </td><td> Fine Science Tools </td><td> SP116 </td><td></td></tr><tr><td> Naht für Rechts-Herzkatheter, geflochtene Seidenfaden, 6-0 </td><td> Teleflex Medical </td><td> 18020-60 </td><td></td></tr><tr><td> Spritze, 1 ml </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Verstärker, PowerLab 4/30 </td&gt; <td> ADInstrument </td><td> Modell ML866 </td><td></td></tr><tr><td> Katheter, Druck F1.4 </td><td> Millar Instruments, Inc </td><td> 840-6719 </td><td></td></tr><tr><td> Seziermikroskop </td><td> Variscope </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pinzetten, Vannas Frühjahr Scheren-2mm Klingen </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15000-00 </td><td></td></tr><tr><td> Halogen beleuchtet Desk Lupe </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-990-56 </td><td></td></tr><tr><td> Laptop-Computer </td><td> Asus </td><td> Modellnummer A52F i5-Prozessor, 15 Zoll </td><td></td></tr><tr><td> Light Source </td><td> Amscope </td><td> HL-250-A </td><td></td></tr><tr><td> Pressure Control Unit </td><td> Millar Instruments, Inc </td><td> PCU-2000 </td><td></td></tr><tr><td> Software, LabChart-Pro V.7 </td><td> AD InInstrumente </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

right ventricular systolic pressure measurements in combination with harvest of lung and immune tissue samples in mice

Die Funktion der rechten Herz ist, um Blut durch die Lunge zu pumpen, was eine Verknüpfung rechte Herz Physiologie und pulmonalvaskulären Physiologie. Die Entzündung ist eine gemeinsame Modifizierer von Herz-und Lungenfunktion, durch Ausarbeitung Zellinfiltration, Produktion von Zytokinen und Wachstumsfaktoren, und durch Initiieren Umbauprozesse ein. Im Vergleich zu dem linken Ventrikel, der rechte Ventrikel eine Niederdruck-Pumpe, die in einem relativ schmalen Bereich von Druckänderungen arbeitet. Erhöhte Lungenarteriendrucks sind mit erhöhten Druck in der Lunge Gefäßbett und pulmonaler Hypertonie 2 zugeordnet. Pulmonaler Hypertonie ist oft mit entzündlichen Lungenerkrankungen, z. B. chronische obstruktive Lungenerkrankung oder Autoimmunerkrankungen 3 zugeordnet. Da pulmonale Hypertonie verleiht eine schlechte Prognose für die Lebensqualität und die Lebenserwartung ist viel Forschung zum Verständnis der Mechanismen, die mig gerichtetht Ziele für pharmazeutische Interventionen 4 sein. Die größte Herausforderung für die Entwicklung von wirksamen Management-Tools für die pulmonale Hypertonie bleibt die Komplexität der gleichzeitigen Verständnis der molekularen und zellulären Veränderungen im rechten Herzen, der Lunge und des Immunsystems. Hier präsentieren wir eine prozedurale Workflow für die schnelle und präzise Messung von Druckänderungen im rechten Herzen von Mäusen und die gleichzeitige Ernte von Proben aus Herz, Lunge und Immunsystem Gewebe. Die Methode beruht auf der direkten Katheterisierung des rechten Ventrikels über die Jugularvene in enger Oberkörper Mäuse, erstmals in den späten 1990er Jahren als Surrogat Maß für Druck in den Lungenarterien 5-13 entwickelt wurde. Die organisierte Team-Ansatz ermöglicht eine sehr schnelle rechten Herzkatheter-Technik. Dies macht es möglich, die Messungen bei Mäusen, die spontan atmen Raumluft durchzuführen. Die Organisation des Work-Flow in verschiedenen Work-Bereichereduziert Zeitverzögerung und eröffnet die Möglichkeit, gleichzeitig Physiologie Experimente und Ernte Immunsystems, Herz-und Lungengewebe. Die prozedurale Workflow hier skizzierten kann für eine Vielzahl von Labor und Studiendesigns angepasst werden, von kleinen, gezielten Experimenten bis hin zu großen Drogen-Screening-Assays. Die gleichzeitige Erfassung von Herzphysiologie Daten erweitert, um Echokardiographie 5,14-17 und Ernte von Herz, Lunge und Immunsystem Gewebe umfassen kann reduziert die Anzahl von Tieren benötigt, um Daten, die die wissenschaftliche Wissensbasis vorwärts bewegen zu erhalten. Die prozedurale Workflow präsentiert auch hier eine ideale Basis zur Erkenntnisgewinnung der Netzwerke, die Immun-, Lungen-und Herzfunktion zu verknüpfen. Die gleichen Prinzipien hier skizzierten lässt sich an andere oder zusätzliche Organe zu studieren, wie benötigt werden.

Der primäre Endpunkt zum Erhalten rechte Herz Druckkurven wird durch die korrekte Position des rechten Herzens Katheters erreicht. Die Form der Druck-Zeit-Kurven ist kritisch, da die richtige Plazierung des Katheters im Inneren des rechten Ventrikels in Druckplateaus führen wird (Abbildung 4). Spiky Kurven stattdessen zeigen einen Katheter, der durch die Atmung oder Herzschlag Bewegung gegen die Wand des rechten Ventrikels bewegt wird. Um mögliche Schwierigkeiten bei der Stufe der Überleben der Tier...

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Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice | Immunology and Infection | Video

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Eine spezifische und schnelle Protokoll gleichzeitig zu untersuchen Funktion der rechten Herzkammer, Lungenentzündung, und die Immunantwort als Lernwerkzeug beschrieben. Video und Figuren beschreiben Physiologie und Mikrodissektion Techniken in einer organisierten Team-Ansatz, anpassungsfähig an für kleine bis große Studien verwendet werden soll.

Rechtsventrikulären systolischen Druck Messungen in Kombination mit Harvest of Lung and Immune Gewebeproben in Mäuse

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

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25.0K Aufrufe.  New York University School of Medicine, Tuxedo. Eine spezifische und schnelle Protokoll gleichzeitig zu untersuchen Funktion der rechten Herzkammer, Lungenentzündung, und die Immunantwort als Lernwerkzeug beschrieben. Video und Figuren beschreiben Physiologie und Mikrodissektion Techniken in einer organisierten Team-Ansatz, anpassungsfähig an für kleine bis große Studien verwendet werden soll.

Serie: Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Seven Steps to Cells Stellate

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Mess-bakterielle Belastung und Immunreaktionen in Mäuse Infizierte mit Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric disorders. Numerous studies have demonstrated that MIA model is able to show face, construct, and predictive validity that are relevant to autism and schizophrenia. To model MIA, investigators often use viral mimic polyinosinic:polycytidylic acid (poly(I:C)) to activate the immune system in pregnant rodents. Generally, the offspring from immune activated dam exhibit behavioral abnormalities and physiological alterations that are associated with autism and schizophrenia. However, poly(I:C) injection with different dosages and at different time points could lead to different outcomes by perturbing brain development at different stages. Here we provide a detailed method of inducing MIA by intraperitoneal (i.p.) injection of 20 mg/kg poly(I:C) at mid-gestational embryonic 12.5 days (E12.5). This method has been shown to induce acute inflammatory response in the maternal-placental-fetal axis, which ultimately results in the brain perturbations and behavioral phenotypes that are associated with autism and schizophrenia.

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic PolyI:C

Maternal immune activation (MIA) is a model for an environmental risk factor of autism and schizophrenia. The goal of this article is to provide a step-by-step procedure of how to induce MIA in the pregnant mice in order to enhance the reproducibility of this model.

Die Induktion der mütterliche Immunaktivierung bei Mäusen in der Mitte der Schwangerschaft Bühne mit Viral Mimic Poly (I: C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Bewertung der zytotoxischen und immunmodulatorische Wirkung von Substanzen im menschlichen Precision-Cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

Anwendung konsistenter massageähnlicher Störungen an Mauskälbern und Überwachung der daraus resultierenden intramuskulären Druckänderungen

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of UTI in male and female mice have illustrated the procedures for bacterial inoculation and enumeration in urine and tissues. During an initial bladder infection in C57BL/6 mice, UPEC establish latent reservoirs inside bladder epithelial cells that persist following clearance of UPEC bacteriuria. This model builds on these studies to examine rUTI caused by the emergence of UPEC from within latent bladder reservoirs. The urogenital bacterium Gardnerella vaginalis is used as the trigger of rUTI in this model because it is frequently present in the urogenital tracts of women, especially in the context of vaginal dysbiosis that has been associated with UTI. In addition, a method for in situ bladder fixation followed by scanning electron microscopy (SEM) analysis of bladder tissue is also described, with potential application to other studies involving the bladder.

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

A mouse model of uropathogenic E. coli (UPEC) transurethral inoculation to establish latent intracellular bladder reservoirs and subsequent bladder exposure to G. vaginalis to induce recurrent UPEC UTI is demonstrated. Also demonstrated are the enumeration of bacteria, urine cytology, and in situ bladder fixation and processing for scanning electron microscopy.

Rezidivierende Escherichia coli Harnwegsinfektion, ausgelöst durch Gardnerella vaginalis Blasenexposition bei Mäusen

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical challenge. Among the ~600 proteases encoded by the human genome, neutrophil serine proteases (NSPs) are thoroughly investigated for their involvement in the onset and progression of inflammatory conditions including respiratory diseases. Uniquely, secreted NSPs not only diffuse within extracellular fluids but also localize to plasma membranes. During neutrophil extracellular trap (NETs) formation, NSPs become an integral part of the secreted chromatin. Such complex behavior renders the understanding of NSPs pathophysiology a challenging task. Here, detailed protocols are shown to visualize, quantify and discriminate free and membrane-bound neutrophil elastase (NE) and cathepsin G (CG) activities in sputum samples. NE and CG are NSPs whose activities have pleiotropic roles in the pathogenesis of cystic fibrosis (CF) and chronic obstructive pulmonary disease (COPD): they promote tissue remodeling, regulate downstream immune responses and correlate with lung disease severity. The protocols show how to separate fluid and cellular fraction, as well as the isolation of neutrophils from human sputum for enzymatic activity quantification via small-molecule F&#246;rster resonance energy transfer-based (FRET) reporters. To gather specific insights into the relative role of NE and CG activities, a FRET readout can be measured by different technologies: i) in vitro plate reader measurements allow for high-throughput and bulk detection of protease activity; ii) confocal microscopy spatiotemporally resolves membrane-bound activity at the cell surface; iii) small-molecule FRET flow cytometry enables for the rapid evaluation of anti-inflammatory treatments via single-cell protease activity quantification and phenotyping. The implementation of such methods opens the doors to explore NSPs pathobiology and their potential as biomarkers of disease severity for CF and COPD. Given their standardization potential, their robust readout and simplicity of transfer, the described techniques are immediately shareable for implementation across research and diagnostic laboratories.

The protocols herein described provide a guide to visualize and quantify the activity of neutrophil proteases in human sputum. The applications of such analysis span from the evaluation of anti-inflammatory treatments, to biomarker validation, drug screening and large cohort clinical studies.

Überwachung der NeutrophilenElastase- und Cathepsin-G-Aktivität in menschlichen Sputumproben

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms include irregular fever, lymphadenopathy, and significantly increased lymphocytes in peripheral blood. The pathogenic mechanism of IM is still unclear; there is no effective treatment method for it, with mainly symptomatic therapies being available. The main question in EBV immunobiology is why only a small subset of infected individuals shows severe clinical symptoms and even develop EBV-associated malignancies, whilemost individuals are asymptomatic for life with the virus.
B cells are first involved in IM because EBV receptors are presented on their surface. Natural killer (NK) cells are cytotoxic innate lymphocytes that are important for killing EBV-infected cells. The proportion of CD4+ T cells decreases while that of CD8+ T cells expands dramatically during acute EBV infection, and the persistence of CD8+ T cells is important for lifelong control of IM. Those immune cells play important roles in IM, and their functions need to be identified separately. For this purpose, monocytes are separated first from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of IM individuals using CD14 microbeads, a column, and a magnetic separator.
The remaining PBMCs are stained with peridinin-chlorophyll-protein (PerCP)/Cyanine 5.5 anti-CD3, allophycocyanin (APC)/Cyanine 7 anti-CD4, phycoerythrin (PE) anti-CD8, fluorescein isothiocyanate (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56, and APC anti-CD16 antibodies to sort CD4+ T cells, CD8+ T cells, B cells, and NK cells using a flow cytometer. Furthermore, transcriptome sequencing of five subpopulations was performed to explore their functions and pathogenic mechanisms in IM.

We describe a method combining immunomagnetic beads and fluorescence-activated cell sorting to isolate and analyze defined immune cell subpopulations of peripheral blood mononuclear cells (monocytes, CD4+ T cells, CD8+ T cells, B cells, and natural killer cells). Using this method, magnetic and fluorescently labeled cells can be purified and analyzed.

Trennung von Immunzellsubpopulationen in peripheren Blutproben von Kindern mit infektiöser Mononukleose

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

Periodontitis (PD) is a highly prevalent, chronic immune-inflammatory disease of the periodontium, that results in a loss of gingival soft tissue, periodontal ligament, cementum, and alveolar bone. In this study, a simple method of PD induction in rats is described. We provide detailed instructions for placement of the ligature model around the first maxillary molars (M1) and a combination of injections of lipopolysaccharide (LPS), derived from Porphyromonas gingivalis at the mesio-palatal side of the M1. The induction of periodontitis was maintained for 14 days, promoting the accumulation of bacteria biofilm and inflammation. To validate the animal model, IL-1&#946;, a key inflammatory mediator, was determined by an immunoassay in the gingival crevicular fluid (GCF), and alveolar bone loss was calculated using cone beam computed tomography (CBCT). This technique was effective in promoting gingiva recession, alveolar bone loss, and an increase in IL-1&#946; levels in the GCF at the end of the experimental procedure after 14 days. This method was effective in inducing PD, thus being able to be used in studies on disease progression mechanisms and future possible treatments.

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

In this study, a rat model of induction of periodontitis is presented via a combination of retentive ligature and repetitive injections of lipopolysaccharide derived from Porphyromonas gingivalis, over 14 days around the first maxillary molars. The ligation and LPS injection techniques were effective in inducing peridontitis, resulting in alveolar bone loss and inflammation.