Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem NHLBI zu RW unterstützt.

1. Power Tower Einrichtung und Bedienung <ol><li> Der Power Tower wird auf einem rechteckigen Stück Sperrholz, die auf einem Tisch platziert wird eingespannt. Ein 4,5 min Getriebemotor von Grainger ruht auf vier 2 &quot;x6&quot;-Boards und ein ¾ Zoll Sperrholzplatte. Der Motor, ein AC / DC Regler, eine Sicherung, und ein Ein / Aus-Schalter werden zu einem Zeitpunkt verdrahtet. </li><li> Zur Kühlung des Motors wird ein Loch 3 Zoll im Durchmesser in einer vertikalen ½-Zoll-Stück Sperrholz geschnitten. Auf der einen Seite, wird ein 3-Zoll-Lüfter mit dem Sperrholz befestigt ist, und auf der anderen, ein 3-Zoll-Durchmesser Metallzylinder befestigt ist. </li><li> Ein maßgeschneidertes Dreharm mit einer Rolle an dem Ende angebracht ist, um dem Motor verbunden. Der Motor und die angeschlossenen Arm in einer Richtung im Uhrzeigersinn drehen, schieben sich entlang einer Seite eines gebogenen ¾ Zoll Vierkantrohr Lager, die das Sperrholz mit einem Türscharnier befestigt ist. Ein Rad wird auf der Oberseite des Rohrschaftteils unterhalb der Plattform befestigt, damit sie gegen die Plattform, dir ist rollenectly darüber. </li><li> Der Arm drückt nach unten auf ein Ende des Rohrmaterials und hebt das andere Ende, Anheben eines Zwei-Ebenen-Plattform (1D). Wenn die Rolle auf dem Arm des Rohrgutes löscht es kann der Arm in die Ausgangsposition zurückzukehren, fallen die Plattform zurück (1F). </li><li> Die Plattformen bestehen aus Regalen, die oben auf Sperrholz angebracht und gesichert durch Bungee-Seile, die auf Augen Schraube verhakt sind. Die Plattformen auf und ab gleiten entlang Schublade Schieberegler, die auf das Sperrholz mit Klammern befestigt werden. </li><li> Phiolen in den Gestellen angeordnet und durch einen quadratischen Raster Bildschirm, an Ort und Stelle mit Spannseile gehalten wird. </li><li> Ein Styropor-Polster wird unterhalb der Plattform, um den Schock des Tropfens dämpfen platziert. </li><li> Die Leistung des Motors eingestellt wird, dass eine vollständige Drehperiode 15 Sekunden lang ist. </li></ol> 2. Übung Protokoll <ol><li> Fliegen werden in einem 25 ° C-Inkubator mit 50% Luftfeuchtigkeit und einer 12-stündigen Licht / da untergebrachtrk-Zyklus. Sowohl körperliches Training und Beurteilung der körperlichen Leistungsfähigkeit sind in einem 25 ° C temperierten Raum durchgeführt. </li><li> Fliegen werden gesammelt und im Alter passende innerhalb von 1-2 Tagen voneinander. Ein Minimum von 240 Fliegen ist für Längs-Überwachung von Ausdauer und negativen Geotaxis (Klettern) Fähigkeit, zwei physiologische Indikatoren, die die Auswirkungen von Ausdauertraining reflektieren erforderlich. Longitudinal Monitoring ermöglicht Isolierung der induzierte Änderung in Bezug auf Startwerte für jede Kohorte, ohne verwirrende Effekte aus Schwankungen zwischen den Kohorten. Fliegen für weitere Experimente sollten gesammelt als benötigt werden. </li><li> Nach der Entnahme sind Fliegen in 120 experimentelle Fliegen, die zum Trainingsprogramm und 120 steuern Fliegen, die nicht ausgeübt wird unterworfen werden geteilt. Die Fliegen werden in Fläschchen von 20 gespeicherten fliegt jeder. Die Fläschchen von experimentellen Fliegen gesteckt sind mit festen Celluloseacetat Flugs und die Fläschchen der Kontrolle (nicht ausgeübte) Fliegen gesteckt sind mit weichen sponge Stoppern, die nach unten geschoben werden, um die Fliegen, während auf der Power Tower immobilisieren können. Schwamm wird zur Immobilisierung verwendet, da der adaptive, Platz sparende Bauform in der Nähe der Boden des Fläschchens. Je weicher Schwamm-Material reduziert auch Verletzungen durch die solidere Flugs verursacht. </li><li> Fliegen auf dem Power Tower werden gespeichert und übte in Fläschchen, die 5 ml von Lebensmitteln, die sie bietet mit einer weicheren Landung als Fliegen, die in leeren Fläschchen ausgeübt werden, enthalten. Das Essen wird in der Regel von 10% Saccharose, 10% Hefe und 2% Agar in Wasser besteht, auch wenn wir nicht beachten Fliegen zu essen oft im Verlauf einer Trainingseinheit. Wenn leere Fläschchen während des Trainings verwendet werden, wird der Prozentsatz der Fliegen, die Verletzungen leiden dramatisch zugenommen. </li><li> Der Power Tower befindet sich in einem temperierten Raum, die bei 25 ° C gehalten wird betrieben Experimentelle Fliegen werden auf dem Power Tower gebracht und gemacht, um zu klettern. Control-Fliegen sind auch auf der Power Tower gelegt, aber der Schwamm Stopper ist pushed unten in das Fläschchen etwa 3 mm über die Fliegen, um eine Bewegung zu begrenzen. Diese Gruppe dient als Kontrolle für eventuelle Auswirkungen der Power Tower, die keinen Bezug zu trainieren sind. Obwohl einige Zimmer noch existiert für diese Fliegen zu manövrieren, haben wir wiederholt beobachtet, dass Fliegen unter diesen Bedingungen sehr wenig laufen und nicht demonstrieren eine physiologische Reaktion zu trainieren. Es kann auch wünschenswert sein, eine zusätzliche Kontrollgruppe, die nicht auf der Power Tower ist überhaupt angebracht sind. </li><li> Fliegen sind fünf aufeinander folgenden Tagen ausgeübt Jede Woche, unter Verwendung einer Rampe Zeitplan (Abbildung 2). Während der ersten Woche die Fliegen sind für 2 Stunden pro Sitzung, zwei Wochen für 2,5 Stunden pro Sitzung ausgeübt, und drei Wochen für 3 Stunden pro Sitzung an. Auch wenn andere Therapien getestet wurden, produziert dieses Protokoll konsistente Ergebnisse über Genotypen und unter unterschiedlichen Bedingungen. Dieses Protokoll ist, unterliegt jedoch einer Vielzahl von Variationsmöglichkeiten, die ein bestimmtes Experiment passen könnte. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Übung und Bewegungsapparates Fatigue <ol><li> Zeit bis zur Erschöpfung während des Ausdauertrainings ist ein nützlicher physiologischer Indikator, um zu bestätigen und / oder zu quantifizieren körperlichen Leistungsfähigkeit einer bestimmten Kohorte. Fatigue Tests können in Längsrichtung auf Kohorten, die in der Ausbildung Experimente verwendet werden soll durchgeführt werden. Assays können entweder vor dem Training durchgeführt werden, nach dem Abschluss der Ausbildung Protokoll, oder beides. Andere Zwischenzeit Punkte können hinzugefügt werden, wenn Charting inkrementellen Fortschritt während des Trainings gewünscht wird. Die Ermüdung Assay kann auch verwendet werden, um Trainingsausdauer als Reaktion auf andere Behandlungen als die Ausbildung Protokoll, wie Ernährung Veränderung (3B) zu messen. </li><li> Fatigue-Tests sollten an einem Tag durchgeführt werden, wenn Ausbildung nicht stattfindet. Sowohl die Versuchs-und Kontrollgruppen Fliegen werden auf dem Power Tower in Fläschchen mit je 20 platziert und machte zu klettern, bis ermüdet. Fatigue ist das Versäumnis, auf einen negativen Stimulus Geotaxis mit Klettern sein reagieren anerkanntVerhalten. Ermüdungsverhalten wird durch visuelle Beobachtung bewertet. </li><li> Ein Fläschchen von Fliegen gilt als &quot;ermüdet&quot;, wenn 5 oder weniger Fliegen in der Lage, mehr als 2 Zoll für vier aufeinanderfolgende Tropfen klettern sind. Ermüdete Fläschchen werden von der Power Tower entfernt, während es noch in Betrieb ist, und der Zeitpunkt der Entnahme wird aufgezeichnet. Times of Entfernung kann als verschachtelte Histogramm oder als ein &quot;Time-to-failure&quot; Plot aufgetragen werden. Ein Beispiel für Daten, dargestellt als ein &quot;Time-to-failure&quot; Plot in 3B gezeigt wird. </li><li> Röhrchen werden bei Intervallen von 10 Minuten für maximal 10 Stunden (3B) überwacht. </li></ol> 4. Übung, Alter, Fähigkeit und Bewegungsapparates <ol><li> Da diese Ausbildung Protokoll beruht auf induzierten Laufverhalten, ist eine primäre Assay zur Quantifizierung von Auswirkungen des Trainings in Längsrichtung messen Veränderung der durchschnittlichen Laufgeschwindigkeit während des Trainings. Im Laufe der Ausbildung werden 120-fly Kohorten ausgeübt und nicht ausgeübte fliegt täglich für ihre Reaktion auf eine negative Geotaxis s getestettimulus. Die RING-Technik in Gargano et al. (2005) wird verwendet, um die Fliegen &#39;Steigfähigkeit 12 zu messen. Kurz gesagt, misst diese Technik durchschnittliche Körpergröße stieg um ein Fläschchen von Fliegen während einer definierten Zeit nach der Induktion von negativen Geotaxis. Die Höhe geklettert während einer definierten Zeit ist gleichbedeutend mit Steiggeschwindigkeit. Die Messungen werden vor dem Setzen Fliegen an der Maschine für das tägliche Training, um Komplikationen zu vermeiden, von Müdigkeit nach des Tages Lauf durchgeführt. </li><li> In unserem Standard-Protokoll, werden Fliegen für insgesamt drei Wochen ausgeübt und Steigfähigkeit ist für insgesamt fünf Wochen untersucht: drei Wochen während des Trainings-Training und zwei Wochen nach Beendigung der Übung (Abbildung 2). Dies ermöglicht es dem Experimentator zur Grafik, ob Auswirkungen von Bewegung auf die Mobilität nach Beendigung des Programms anhalten. </li><li> Vier Fotografien der jeweiligen Kohorte täglichen RING Leistung sind für die Analyse von Steigfähigkeit verwendet. Sechs Flaschen sind in jedem Foto enthalten. Negativ geotaxis induziert wird, und mit einem zeitgesteuerten Kamera wird ein Bild nach einer bestimmten Anzahl von Sekunden aufgenommen. Wir verwenden typischerweise zwei Sekunden, obwohl dies in Abhängigkeit von den experimentellen Bedingungen variiert werden kann. Für jedes Foto, jedes Fläschchen wird in vier Quadranten gleicher Höhe geteilt, und Bildverarbeitungs-Software wird verwendet, um zuweisen Jede Fliege eine Partitur auf dem Quadranten es innerhalb des bewilligten Zeitraums erreicht basiert. Fliegen, die die oberste Quadranten erhalten eine Punktzahl von 4, klettern fliegt in die nächst höhere Quadranten erhalten eine 3, fliegt in der zweithöchsten Quadranten erhalten eine 2, und Fliegen in der untersten Quadranten erhalten eine 1. Fliegen, die nicht klettern aus der unteren überhaupt sind eine Punktzahl von 0 gegeben. </li><li> Für jedes Fläschchen in einem bestimmten Foto wird ein &quot;Kletter-Index&quot; durch Mittelung der Noten aller Fliegen in diesem Fläschchen generiert. Jedes Fläschchen die Indizes der vier Fotografien werden dann gemittelt, um eine endgültige Kletter-Index für diesen Tag geben. </li><li> Alle negativen Geotaxis Experimente werden durchgeführt Längsdinally. Die Ergebnisse werden auf der ersten &quot;Pre-Übung&quot; Score normiert, um den Effekt der Kohorte Variation in Steigfähigkeit zu reduzieren, und markieren Sie die relative Längenänderung in einer Kohorte die Steigfähigkeit als Ergebnis der Ausübung Ausbildung. Die ursprüngliche Partitur wird vom Durchschnitt der ersten drei Tage Klettern Indizes ermittelt und erhält ein Wert von 1. Nachfolgende Studien werden dann als Prozentsatz des ursprünglichen Index ausgedrückt. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Wildtyp-Fliegen an einem Langstrecken-Protokoll reagieren mit einer verminderten altersbedingte Abnahme der Steigfähigkeit, die nach dem Ende der Ausbildung bestehen, da es in Längs-RING-Assays auf fünf Wochen alt sind (Abbildung 3A) wider. Diese verzögerte Rückgang der negativen Geotaxis ist ein Standard phänotypischen Reaktion, die als positive Kontrolle zu dienen können, um sicherzustellen, dass Wildtyp-Bewegung wird normalerweise auftritt. Dieser Datensatz wird als ein Beispiel dargestellt, wie dieInduktion der Übung durch den Power Tower Programm kann als Verhaltens-Eingang verwendet werden. Die Fähigkeit verschiedener genetischer oder umweltbedingter Faktoren zu modulieren diesen Effekt kann dann beurteilt werden. Umgekehrt kann der Power Tower auch als Ausgang in verschiedenen experimentellen Designs verwendet werden. Zum Beispiel kann Genotyp, Ernährung oder anderen variiert werden. Dann kann die Wirkung dieser Variationen auf Sportphysiologie getestet mit dem Power Tower werden. Hier zeigen wir ein Beispiel für diesen Ansatz. Wann fliegt mit einem unterschiedlichen Anteil an Saccharose in ihren Diäten wurden für Zeit, um Müdigkeit, erhöhter Gehalt an Saccharose mit einer erhöhten Ausdauerleistungsfähigkeit (3B) korreliert getestet. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3786/3786fig1.jpg" /> Abbildung 1. Der Betrieb des Power Tower. (AC) Der motorisierte gebeugten Arm mit angehängten Walze dreht sich im Uhrzeigersinn, bis er in Kontakt mit dem gebogenen Vierkantrohr kommt. (D, E) DasArm nach unten drückt auf dem Vierkantrohr gebogen, wodurch die Plattform, die beladen mit Flaschen von Fliegen zu heben ist. (F) Wenn sich der Arm macht den Schlauch der Plattform erlaubt, wieder nach unten fallen wird, zwingt die Fliegen auf den Grund der Rücksendung Fläschchen. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3786/3786fig2.jpg" /> Abbildung 2. Empfohlene Übung Protokoll. Fliegen unterzogen, um die Ausbildung Protokoll werden gebildet, um für fünf Tage üben jede Woche unter einem dreiwöchigen Kur hochgefahren, die schrittweise erhöht die Dauer der Belastung aus den ersten 2 Stunden mit 30 Minuten pro Woche. Standard-Analysen sind Müdigkeit Tests vor und nach dem Trainingsprogramm und RING-Assays von Woche 1 bis Woche 5. Alle Tests werden in zweifacher Ausfertigung auf eine gleiche Anzahl von nicht ausgeübten Fliegen als Negativkontrolle durchgeführt. Andere verschiedene physiologische oder biochemische Tests können durchgeführt als vom Forscher bestimmt werden. <img alt = &quot;Abbildung 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3786/3786fig3.jpg&quot; /&gt; Abbildung 3. Ausdauertraining ändert mehrere Aspekte der Mobilität. (A) Ring-Assays durchgeführt längs über Jahrhunderte in einem einzigen Paar von männlichen Y 1 W 67C23 Kohorten. Alter zusammenpassende, genetisch identische ausgeübt und nicht ausgeübten Kontrolle Fliegen wurden täglich durchschnittlich Steiggeschwindigkeit gemessen. Die Ergebnisse sind in Form eines Index klettern, das der mittleren Steighöhe in der ersten drei Tage der Messung normiert ausgedrückt. Übung ausgebildete Fliegen zeigten eine verminderte altersbedingte Rückgang der negativen Geotaxis Fähigkeit im Vergleich zu gleichaltrigen Geschwistern nicht ausgeübte über Alter (2-Wege ANOVA, p &lt;0,005). (B) Fatigue-Tests für 8 Stunden am durchgeführt gleichaltrigen weiblichen Kanton S Fliegen zeigen einen signifikanten Effekt der diätetischen Saccharosegehalt auf Zeit zur Ermüdung (log-rank, p &lt;0,0001). Vor dem Experiment wurden Fliegen eine Hefe / Saccharose / Agar-Diät gefüttert, mit 10% Gewicht / Volumen yeaSt-Konzentration, und einen unterschiedlichen Anteil der diätetischen Saccharose. Fünf Fläschchen von 20 Fliegen je wurden für jede Diät getestet. Grafik zeigt, wie viele Flaschen noch fünf oder mehr Fliegen läuft zu einem bestimmten Zeitpunkt. Diese Ergebnisse können statistisch und graphisch dargestellt Überlebensrate (oder Zeit bis zum Versagen) erreicht, wobei die &quot;Fehler&quot; für ein Fläschchen, als einem Zeitpunkt, wenn weniger als fünf Fliegen auf negative Geotaxis Stimulus zu reagieren weiterhin definiert behandelt werden. Beachten Sie, dass viele andere mögliche Studiendesigns und der statistischen Aufbereitung möglich sind, und Daten, Behandlung und Messung sollte auf die individuellen Zwecke angepasst werden.

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W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li></ol>

Ich habe nichts zu offenbaren.

Das allgemeine Protokoll hier vorgestellte wurde bei der Dokumentation von physiologischen Wirkungen nach dem Training erfolgreich. Allerdings gibt mehrere Bereiche, in diesem Protokoll unterliegen Änderungen an bestimmten experimentellen Anforderungen anpassen. Zum Beispiel könnte die Länge der Ausbildung und der Anzahl der Anfälle variiert möglicherweise, damit das Programm mehr oder weniger anspruchsvoll, wie gewünscht. Die Höhe des Behälters, in dem negativen Geotaxis Fähigkeit gemessen könnte geändert werden, um den verfügbaren Raum für Verbesserungen zu dokumentieren zu erhöhen. Verschiedene Methoden der Automatisierung der Quantifizierung der Steiggeschwindigkeit kann ebenfalls anwendbar sein. Im Prinzip kann jede Software-Programm geeignet sind, eine Fliege aus dem Hintergrund benutzt, um die Datenerfassung zu beschleunigen werden. Einige Aspekte des Protokolls sollten nur mit größter Vorsicht geändert werden, jedoch. Zum Beispiel, Vorversuche deuten stark darauf hin, dass mindestens ein Ruhetag pro Woche zu mehr impr erleichtern neigtEs werden Bewegungen als unerbittliche tägliche Übung. Darüber hinaus werden zirkadianen Rhythmen und Temperatur bekannt ist, die Bewegung des kaltblütigen Tieren beeinflussen. Die Tageszeit, zu der Ausbildung stattfindet, kann variiert werden, sondern sollte immer in bestimmten Gruppen konsistent unter Vergleich, um die Möglichkeit der Verwechslung Wirkungen der zirkadianen Rhythmen zu vermeiden. Die Temperaturregelung ist auch wichtig, und wir empfehlen einen dedizierten Raum bei konstanter Temperatur zu Haus Sportgeräte. Schließlich müssen Männchen und Weibchen aufgezogen und getrennt gemessen werden, um das Potenzial der verwirrenden Effekte der Fruchtbarkeit und geschlechtsspezifische Unterschiede in der körperlichen Leistungsfähigkeit zu vermeiden. Potentielle Anwendungen dieser Methodik werden nur durch die Phantasie des Forschers begrenzt. In Vorarbeiten haben wir diese Methode in drei große Anwendungen eingesetzt: <ol><li> Um die Wirkung von Ausdauertraining auf verschiedene Aspekte der Wildtyp Biologie über Alters zu messen. </li><li> To Messung der Wirkung von Ausdauertraining auf bestimmte Phänotypen. </li><li> Um genetischen Faktoren, die erforderlich sind zu screenen, um den Nutzen der Übung auszuführen </li></ol> Jede dieser Anwendungen umfasst eine Vielzahl von spezifischen Möglichkeiten. Auf der Basis unserer vorläufigen Erfahrung, neigen Mutantenphänotypen mit Übung Ebene so viel variieren, da sie mit einer Diät variieren. Die Verwendung von wirbellosen Modelle zum besseren Verständnis der Beziehung zwischen Ernährung, Bewegung, Alterung und Physiologie ist vielleicht die wichtigste allgemeine Anwendung dieses Protokolls.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Dayton Getriebemotor </td><td> Grainger </td><td> 1LRA6A </td><td></td></tr><tr><td> Raco Elektrische Box </td><td> Grainger </td><td> 5A052 </td><td></td></tr><tr><td> Raco Abdeckung </td><td> Grainger </td><td> 5A053 </td><td></td></tr><tr><td> Cooper Bussmann Sicherungen </td><td> Grainger </td><td> 6F043 </td><td></td></tr><tr><td> Cooper Bussmann Sicherungshalter </td><td> Grainger </td><td> 1DD33 </td><td></td></tr><tr><td> Carling Technologies Schalter </td><td> Grainger </td><td> 2X464 </td><td></td></tr><tr><td> Dayton Control, AC / DC-Geschwindigkeit </td><td> Grainger </td><td> 4X796 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Flugs für Narrow Plastikröhrchen </td><td> Genesee Scientific </td><td> 49-102 </td><td></td></tr></tbody></table>

endurance training protocol and longitudinal performance assays for drosophila melanogaster

Eines der dringendsten Probleme der modernen medizinischen Forschern ist die wogenden Ebenen der Adipositas, mit der der damit verbundenen Erkrankungen wie Diabetes und Herz-Kreislauferkrankungen 1-3. Ein wichtiges Thema der Forschung in diesen assoziierten gesundheitlichen Problemen betrifft die Rolle der Ausdauersport als vorteilhaft Intervention. Körperliches Training ist eine preiswerte, nicht-invasive Intervention mit mehreren positiven Ergebnisse, einschließlich der Reduzierung der überschüssigen Körperfetts 4, erhöhten Insulinsensitivität der Skelettmuskulatur 5, erhöht entzündungshemmende und antioxidative Reaktionen 6, und eine verbesserte kontraktile Kapazität in Kardiomyozyten 7. Niedrige Intensität Übung ist bekannt, dass die mitochondriale Aktivität und Biogenese beim Menschen 8 und Mäuse zu erhöhen, mit der transkriptionellen Coaktivator PGC1-α als wichtiges Zwischenprodukt 9,10. Despite die Bedeutung von Bewegung als Instrument zur Bekämpfung von mehreren wichtigen altersbedingte Krankheiten, haben umfangreiche longitudinale genetische Untersuchungen durch das Fehlen eines Ausdauertrainings Protokoll für eine kurzlebige Arten genetisches Modell behindert. Die Vielfalt der genetischen Werkzeuge zur Verfügung für den Einsatz mit Drosophila, zusammen mit seiner kurzen Lebensdauer und kostengünstige Wartung, machen ihn zu einem attraktiven Modell für die weitere Erforschung dieser genetischen Mechanismen. In diesem Sinne haben wir eine neue Vorrichtung, wie der Power Tower bekannt, für groß angelegte Übung-Ausbildung in Drosophila melanogaster 11 entwickelt. Der Power Tower nutzt den Fliegen instinktive Verhalten negativ Geotaxis um wiederholt induzieren schnelle Klettern. Jedes Mal, wenn die Maschine hebt, dann fällt er die Plattform von Fliegen, die Fliegen werden induziert, um zu klettern. Fliegen weiterhin so lange wie die Maschine in Betrieb ist oder bis sie zu ermüdet, um zu reagieren zu reagieren. So kann der Forscher mit dieser Maschine zu liefern simultaneous Ausbildung einer großen Anzahl von alters-und genetisch identisch Fliegen. Zusätzlich beschreiben wir damit verbundenen Tests nützlich, um Längs Fortschritt der Fliege Kohorten während des Trainings verfolgen.

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Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster

Wir beschreiben die erste Ausdauertraining Protokoll für ein wichtiges genetisches Modell Spezies,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;, Und skizzieren verschiedene Assays zur Verbesserung der Mobilität nach dem Training zu verfolgen.

Ausdauertraining Protokoll und Längs-Performance-Assays für Drosophila melanogaster

One of the most pressing problems facing modern medical researchers is the surging levels of obesity, with the consequent increase in associated disorders ...

endurance-training-protocol-longitudinal-performance-assays-for

Research

JoVE Journal

Biology

Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster

15.5K Aufrufe.  University of Michigan Medical School. Wir beschreiben die erste Ausdauertraining Protokoll für ein wichtiges genetisches Modell Spezies, Drosophila melanogaster, Und skizzieren verschiedene Assays zur Verbesserung der Mobilität nach dem Training zu verfolgen.

Serie: Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Hochauflösendes Video Tracking von Locomotion in Adult Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Forschung

Biologie

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Neurocircuit Assays für Anfällen bei Epilepsie Mutanten Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Mikroinjektion Techniken zur Untersuchung Mitose in der Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

Überwachung Herzfunktion Larven Drosophila melanogaster Für physiologische Untersuchungen

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Präparation Oenocytes von Adult Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolierung von Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Quantitativen Vergleich der Cis-Regulatory Element (CRE) Aktivitäten in transgenen Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Messung der Lebensdauer in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Aufrechterhaltung eines<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Bevölkerung Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...