RNAi-vermittelten Gen-Silencing in Mücken, bedarf der vorherigen Herstellung und Reinigung von spezifischen dsRNAs, dass das Gen von Interesse Ziel. Für dsRNA-Synthese, empfehlen wir die Ambion Megascript Kit, Verwendung eines T7-RNA-Polymerase-vermittelte in vitro Transkriptions-Reaktion macht. Für dsRNA Reinigung empfehlen wir die Qiagen RNeasy-Kit. Proben von dsRNA zu quantifizieren und angepasst werden, um 3 ug / ul in Wasser. Andere Materialien, die Sie benötigen sind: spitzen Pinzette, Objektträger aus Glas, Glas Mikrokapillare Nadeln, Mikroinjektor (wir verwenden Drummond Nanoject II), einem Lichtmikroskop vor einem kalten Block, eine überdachte Glas-Petrischale, Papierhandtücher und einen Eimer mit Eis montiert . Sie müssen auch einen Weg, um Mücken und geeignete Behälter für sie zusammen mit einer Nahrungsquelle wie Watte in 10% Saccharose getränkt sammeln. <ol><li> Sammeln Sie Ihre Mücken. Mit einem batteriebetriebenen Aspirator, sammeln die Mücken Sie zu injizieren. Stecken Sie die Düse mit einem Papiertuch oder Baumwolle, so dass keine Moskitos entweichen kann, und entfernen Sie das Reservoir. Da kalte Temperaturen Mücken betäuben, zu begraben das Reservoir in einen Eimer mit Eis und warten 5-10 Minuten für die Moskitos nicht mehr bewegt. Betäubung kann auch, indem das Reservoir in einem kalten Raum oder im Kühlschrank oder über CO 2 erreicht werden. Während dieser 5-10 Minuten, mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li><li> Bereiten Sie Ihren Arbeitsbereich. Set eine ebene Fläche kalten Block 2 ° C und Ort ein Glasplättchen auf sie. Dies ist, wo die Mücken Rest, wie Sie sie zu injizieren. Bringen Sie ein Glas Nadel auf die Mikroinjektor und nutzen Sie Ihre Zange an der Spitze der Nadel auf die gewünschte Breite zu brechen. Es ist wichtig, dass die Breite groß genug, um genug Platz für Flüssigkeit durchströmt zu einem vernünftigen Preis ist aber schmal genug, um eine minimale Wunde während der Injektion zuzufügen. Eine gute Nadelspitze wird schmal genug, um leicht verbiegen, aber nicht brechen. Legen Sie Ihre Spritzen an die gewünschte Lautstärke (für RNAi, verwenden wir 69 nL). Tauchen Sie die Spitze des Nadel in Ihrer Probe und ziehen Sie Ihre flüssigen Probe in die Nadel mit den Anweisungen des Herstellers. Die flüssige Probe kann eine dsRNA-Lösung Bakteriensuspension oder andere sein, die Injektion Prozess ist für alle gleich. Embed einer Glas-Petrischale in den Eiskübel so dass der Boden der Schale vollständig Kontaktaufnahme ist das Eis. Hier finden Sie Moskitos setzen, bis Sie bereit sind, sie zu injizieren sind. </li><li> Bereiten Sie Ihre Moskitos. Transfer 50-100 Mücken aus dem Reservoir der Glas-Petrischale. Verwenden Sie Ihre Pinzette, um sie zu einer einzigen Schicht dünner, so dass sicher die meisten haben mit dem kalten Boden der Schale kontaktieren, um sie betäubt. Decken diese Mücken mit der Schale bedecken, wenn nicht in Gebrauch ist. Zurück Reservoir zur Eiskübel zu halten den Rest der Moskitos betäubt. </li><li> Berg Mücken an kalten Block. Verwenden Sie Ihre spitzen Pinzette Moskitos ein zu einer Zeit übertragen aus der Schüssel auf den Objektträger auf dem kalten Block unter dem Lichtmikroskop montiert. Behandeln Sie die Mücken sanft, vorzugsweise an den Beinen. Line up so viele wie 30 Mücken side-by-side auf der Folie, so dass Sie sicher, kann jeder mit der Mikroinjektor bekommen und dafür sorgen, jeder Kontakt mit der kalten Folie. Stellen Sie sicher, Mücken bis sich ordentlich gefüttert, so dass während Sie entlang gehen Sie wissen, welche haben und die nicht injiziert. Lassen Sie andere Mücken in den gekühlten Petrischale abgedeckt. </li><li> Inject Ihre erste Gruppe von Mücken. Halten Sie Ihre spitzen Pinzette kippte in einer Hand und halten Sie die Mikroinjektor in der anderen Hand wie einen Bleistift. Verwenden Sie die Zange, um die Moskitos zu bewegen, wie Sie benötigen (handle ihnen durch die Beine, um Verletzungen zu vermeiden) und zu halten, die Mücke stabil wie Sie spritzen. Dies funktioniert am besten, wenn Sie die Zange zu verwenden, um eine Seite des Moskito-Unterstützung, wie Sie injizieren von der anderen Seite. Schieben Sie einfach die Nadelspitze in Mücke Thorax. Es ist am besten in eine straff noch dünnen Teil der Kutikula, um Verletzungen zu minimieren, zu injizieren. Vermeiden Sie auch Injektion zu tief, Sie wollen nur die Spitze, um im Inneren des Thorax werden; tiefere Injektionen verursachen größere Wunden, die das Überleben gefährden wird. Sobald die Nadelspitze in der Position, drücken und loslassen des Pedals der Mikroinjektor Geräte, die Ihren vorgegebenen Volumen von dsRNA liefern wird. Warten Sie eine Sekunde oder zwei, und entfernen Sie die Nadel aus der Mücke. Wenn ein Tropfen Flüssigkeit wird außerhalb der Wunde, ein paar Sekunden warten, um es in die Wunde aufgenommen werden. Wenn es nicht innerhalb von wenigen Sekunden zu absorbieren ist, zu verwerfen, dass Mücken und versuchen Sie es erneut. Fahren Sie mit der Einspritzung für alle Mücken auf dem Glasträger. </li><li> Speichern Sie Ihre Mücken. Wenn Sie fertig sind, legen Sie Ihre injiziert Mücken in gekennzeichneten Behältern (wir bevorzugen 1 Pint Wachs ausgekleideten Karton Tassen gedeckt durchNetzgewebe und sicherte mit Gummibändern und einem Pappdeckel). </li><li> Weiter Injektionen bis zur fertigen. Continue, um Stechmücken auf der Folie platzieren, injizieren und Transfer zum Bechern, bis Sie die Stichprobengröße Sie Lust haben. Konto für einige Todesfälle-Anfänger haben viele Mücken aus dem Trauma der Injektion sterben. Dies wird mit der Praxis zu verbessern, bis fast 100% der Mücken überleben Injektion. </li><li> Wenn Sie fertig sind, legen Sie ein gefaltetes, nasses Papier Handtuch über den Kelch zusammen mit einer Nahrungsquelle und decken die Tassen mit etwas Feuchtigkeit wie Kunststoff-Folie oder ein Kunststoff-Petri Deckel zu behalten. Injected Mücken sind anfällig für Austrocknung, so dass die Feuchtigkeit, die durch das nasse Handtuch zur Verfügung gestellt und erhalten durch den Kunststoff wird dazu beitragen, dies zu verhindern. </li><li> Zeigen Sie mit der Mücken in einer kontrollierten Umweltbedingungen Kammer für die Inkubation. </li></ol> Hinweis: Effizienz der Gen-Silencing ist sehr variabel und hängt von einer Reihe von Faktoren, einschließlich Transkript und Protein turn-over-Raten und dsRNA Aufnahme Effizienz von Zellen und Organen. Wir haben festgestellt, dass Schweigen so früh wie 1 Tag nach der Injektion beginnt, und kann bis zu 6 Tage nach der Injektion andauern. Verwenden Sie Transkript und Protein Nachweismethoden wie quantitative PCR und Western-Blot zu Schweigen zu validieren. Hinweis: Es gibt mehrere Variationen über mehrere Schritte der Mücke Einspritz-und RNAi-vermittelten Gen-Silencing-Technik. Einige Varianten sind beschrieben durch: Boisson, et al (2006) und Blandin, et al (2002)...

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	<li>Boisson, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2006).</li><li>Blandin, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2002).</li></ol>

Effizienz der Gen-Silencing ist sehr variabel und hängt von einer Reihe von Faktoren, einschließlich Transkript und Protein turn-over-Raten und dsRNA Aufnahme Effizienz von Zellen und Organen. Wir haben festgestellt, dass Schweigen so früh wie 1 Tag nach der Injektion beginnt und kann bis zu 6 Tage nach der Injektion andauern. Verwenden Sie Transkript und Protein Nachweismethoden wie quantitative PCR und Western-Blot zu Schweigen zu validieren.

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		<tbody>
		
<tr>
<td>Megascript</td>
<td>kit</td>
<td>Ambion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction</td>
</tr>
<tr>
<td>RNeasy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For dsRNA purification</td>
</tr>
<tr>
<td>dsRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>should be quantified and adjusted to 3 &#x03BC;g/ &#x03BC;L in water</td>
</tr>
<tr>
<td>fine-tipped forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>glass slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>glass microcapillary needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microinjector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond</td>
<td>Nanoject II</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>light microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>mounted above a cold block</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>covered, glass</td>
</tr>
<tr>
<td>paper towels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% sucrose</td>
<td>food</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>A. gambiae</td>
<td>Animal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>mosquitos</td>
</tr>		</tbody>
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		</div>

protocol for rnai assays in adult mosquitoes (a. gambiae)

Reverse-genetische Ansätze haben sich als äußerst nützlich für die Bestimmung, welche Gene zugrunde liegenden Widerstand gegen Vektor Krankheitserreger in Mücken. Dieses Video-Protokoll stellt ein Verfahren durch die Dimopoulos Labor verwendet werden, um dsRNA in Anopheles gambiae Mücken, die den Malaria-Parasiten Hafen zu injizieren. Die Technik die Manipulation der Injektion Setup und Injizieren dsRNA in den Brustkorb dargestellt.

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Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Protokoll für die RNAi-Assays in Adult Moskitos (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

protocol-for-rnai-assays-in-adult-mosquitoes-a-gambiae

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

12.5K Aufrufe.  Johns Hopkins University. Reverse-genetische Ansätze haben sich als äußerst nützlich für die Bestimmung, welche Gene zugrunde liegenden Widerstand gegen Vektor Krankheitserreger in Mücken. Dieses Video-Protokoll stellt ein Verfahren durch die Dimopoulos Labor verwendet werden, um dsRNA in Anopheles gambiae Mücken, die den Malaria-Parasiten Hafen zu injizieren. Die Technik die Manipulation der Injektion Setup und Injizieren dsRNA in den Brustkorb dargestellt.