Wir bedanken uns bei folgenden sind für ihre Unterstützung: Commonwealth Scholarship Kommission UK Finanzierung (HP), EPSRC (HP), BBSRC (MFN) und die Europäische Union Marie-Curie-Maßnahmen (MFN).

1. Parasagittale Slice-Vorbereitung 1,1 herauspräparieren Gehirnhälften Alle Tierversuche folgen sollten lokale Ethikprüfung und nationalen Vorschriften. Im Fall von den hier beschriebenen Experimenten, entspricht das Werk an die britischen Animals (Scientific Procedures) Act 1986. Wir verwenden routinemäßig Genickbruch ohne Betäubung, um die Maus vor dem Entfernen des Gehirns einschläfern. Alternativ kann die Maus sein terminal anästhesiert, aber in diesem Fall kann es erforderlich sein, um zu bestimmen, wenn die Wahl der Anästhesie neuronalen Eigenschaften beeinflusst. Entfernen Sie das Gehirn von der Maus und sofort in kaltem (4-8 ° C) Schneiden künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) (siehe Tabelle 1 für Lösung Kompositionen) sprudelte bis zur Sättigung mit Carbogen (95% O 2, 5% CO 2). Nach maximal drei Minuten, entfernen Sie vorsichtig das Gehirn aus dem cUtting ACSF mit einem Spatel und legen Sie sie vorsichtig in eine aufrechte Position (dorsal Seite nach oben) auf ein Filterpapier, das mit dem Schneiden ACSF (Abbildung 1A) angefeuchtet wurde. Zur Erleichterung der Montage genau der Hemisphären, verwenden Sie eine Rasierklinge oder Skalpell, um so viel des Kleinhirns wie möglich, ohne dass der MEC (befindet sich am kaudalen extreme des Großhirns) entfernen und entfernen Sie den rostralen Drittel des Großhirns durch Schnitt in der Frontalebene (Abbildung 1B). Hemisect das Gehirn, wobei darauf geachtet, dass der Abschnitt genau entlang der vertikalen Ebene der Mittellinie (1C) ist. Senden Sie die Halbkugeln zum Schneiden sprudelte ACSF für eineinhalb Minuten. 1,2 Montieren Sie die Halbkugeln auf einem Vibratom Vor der Montage sicherstellen, dass die Schneidkante der Klinge Vibratom bei 20 Grad von der Horizontalen abgewinkelt ist ( <sTrong&gt; 1D). Auf der Montagefläche einen flachen Streifen Sekundenkleber parallel zur Vibratom Klinge, etwa die Breite einer Halbkugel und lang genug, um die beiden Halbkugeln End-to-End-Aufnahme. Die Pflege der körperlichen Auswirkungen zu minimieren, nehmen Sie jede Hemisphäre aus dem Schnittbereich ACSF mit einem Spatel und Position, so dass seine mediale Fläche ruht auf dem Spatel und seiner dorsalen Umfang zugewandt dem Mikrotomklinge. Schieben Sie jeder Hemisphäre auf den Streifen von Sekundenkleber, wobei darauf zu achten, dass die mediale Oberfläche jeder Hemisphäre parallel zur Mikrotomgrundplatte ist. Wir haben festgestellt, dass für die besten Ergebnisse der dorsale Oberfläche jeder Hemisphäre sollten parallel zu und stehen vor der Vibratom Klinge (1D). 1.3 Wartung der Zubereitung während des Schneidens Nach Montage sofort eintauchen in die Hemisphären Kaltschnitt ACSF (4 - 8 ° C). Pflegen Sie die Temperature und Carbogen Sättigung während des Slicing Verfahren. Wenn direkte Kühlung und Sprudeln der Lösung in der Mahlkammer nicht praktikabel ist, in regelmäßigen Abständen wieder aufzufüllen das Schneiden ACSF-Lösung in der Kammer mit Frischwasser gekühlt und sprudelte Lösung. 1,4 Zuschnitte Mit einem Vibratom, zu entfernen Cortex von beiden Hemisphären in der Sagittalebene bis zur seitlichen Ausdehnung der meisten MEC zu identifizieren (typischerweise ~ 1mm unten von der Seitenfläche) (1F). Zwischen den Schnitten heben Sie den Vibratom Klinge bis ~ 200 um zu vermeiden, ziehen Sie die Klinge wieder über und Schäden an der exponierten Gewebes. Gleichzeitig geschnitten 400 um parasagittalen Abschnitten von beiden Halbkugeln (wenn sie wie in 1D gezeigt ausgekleidet sind sie beide zur gleichen Zeit geschnitten werden), bis der medialen Umfang der MEC erreicht ist. Dies kann durch das Fehlen der dicken weißen Band um den ventro-kaudalen Kurve t identifiziert werdener Hippocampus (die äußere Kapsel), die nicht-konvexen Form des rostralen Rand und die Winkelgeschwindigkeit dorso-kaudalen &quot;Ecke&quot;. 1E veranschaulicht die kreisförmiges Erscheinungsbild des Hippocampus in parasagittaler Ebene quer zur MEC. 1F-G zeigen Wie Abschnitte innerhalb des MEC an verschiedenen Positionen lateral-medial erscheinen beim Schneiden. Notieren Sie sich den zunehmend bohnenförmige Aussehen des Hippocampus bei mehr mediale Positionen. Jede Hemisphäre liefert typischerweise zwei oder drei 400 mu m dicke Scheiben schneiden, die das MEC. 1,5 inkubieren Scheiben Nach jedem Schnitt sofort platzieren die Scheiben in Carbogen-gesättigte Standard ACSF in einem Wasserbad bei 35 ° C gehalten Willkommen Scheiben bei 35 ° C für ungefähr 15 Minuten in der ACSF inkubieren nach dem Schneiden abgeschlossen ist. Entfernen Sie das Slice-Halter aus dem Wasserbad und weiterhin sprudeln mit Carbogen bei Raumtemperatur bei lOsten 45 Minuten. 2. Beispiel Parasagittale Slice-Experiment Ein typisches Experiment mit dieser Vorbereitung ist es, elektrophysiologische Ableitungen von Sternzellen in Schicht II des MEC zu machen. 2,1 Optimize Optik Vor der Aufnahme sicher, dass der Kondensator in Fokus auf die Schnittebene (Köhler-Beleuchtung) ist und wird unter der hohen Vergrößerung (zB 40x) Ziel zentriert. 2,2 Identifizieren Zellen von Interesse Verwenden Sie eine geringe Vergrößerung (zB 4x) Ziel, um eine ungefähre Aufzeichnung Region innerhalb des MEC (Abbildung 2A-B) zu identifizieren. Wechseln Sie zu einem hohen Vergrößerung Ziel zu lebensfähigen Zellen innerhalb dieser Region (Abbildung 2C-D) zu identifizieren. Als Beispiel werden putativen Schicht II Sternzellen visuell durch ihre polygonalen oder ovalen Form und mehrere primäre Dendriten mit ähnlichen Durchmesser identifiziertter, und das Fehlen eines einzigen großen Durchmesser apikalen Dendriten 2,13,14. Sie sind zuverlässig auf dem Rand der Schicht I / II Grenze gekennzeichnet, wenn sie reichlich vorhanden und oft in kleinen Gruppen 2,9 (2C-D). Andere Zelltypen, wie Interneuronen und Pyramidenzellen sollte auch erkennbar sein. An diesem Punkt Experimente durchgeführt werden, beispielsweise mit Whole-Cell-Patch-Clamp zu Membranpotential oder Membran Strom von identifizierten Neuronen, und elektrische oder optogenetische Verfahren aufnehmen, um synaptische Eingänge des Neurons aufgezeichnet zu aktivieren. Neuron Identität kann von den elektrophysiologischen Eigenschaften des Neurons aufgezeichnet und durch die Einbeziehung fluoreszierenden Markierungen innerhalb der intrazellulären Lösung überprüft werden. 3. Messen Sie Lage an der dorso-ventrale Achse 3,1 Bild Lage von Interesse und den umliegenden Scheibe Um die Position eines Recor zu bestimmenDED Neuron entlang der dorso-ventralen Achse, verwenden Sie zuerst eine geringe Vergrößerung Ziel, das Bild MEC Region der Scheibe und die umliegenden Gebiete. Markieren Sie die Stelle von Interesse durch, zum Beispiel, einschließlich der Aufnahme-Elektrode in einem Bild (Abbildung 3A) oder durch Rücktritt das Feld Irisblende, um eine helle Kreis um den Ort von Interesse in eine Kopie des Bildes zu verlassen. Um die Aufzeichnung Position innerhalb des Bildes das Duplikat dann auf dem ersten Bild der Aufnahmeort und dessen Umgebung (Abbildung 3B) überlagert werden genau zu bestimmen. Bis zu 3 separate geringer Vergrößerung (4x) Bilder benötigt, um die Fläche aus einer ventralen Aufnahmeort zum dorsalen Rand des MEC gedeckt werden können. Diese Bilder können dann zusammengefügt werden, mit Bildbearbeitungssoftware, um ein Bild, dass Abstandsmessungen aus unternommen werden können (Abbildung 3) bieten. Weitere Überprüfung der Identität und den Aufenthaltsort Neuron kann nach der Aufnahme durchgeführt werden, indeminaktiven Marker wie Biocytin oder Alexa-Farbstoffe in der intrazellulären Lösung und dann mit Hilfe geeigneter Verarbeitung des Gewebes nach der Aufnahme 2. 3,2 Stellen Sie die dorsale Grenze des MEC Der dorsale Rand des MEC bietet eine bequeme Wahrzeichen, von dem dorsal-ventrale Position zu messen. Der ventrale Rand des MEC ist nicht so gut definiert. Abbildung 4 zeigt, wie die MEC zellulären Orte im Nissl gefärbten Schnitten in verschiedenen medial-lateralen Positionen definiert unter DIC Beleuchtung erscheinen. Abbildung 4 A zeigt die kreisförmige Hippocampus (Abbildung 4 (i)) und das Fehlen einer parasubicular Vorsprung in Schicht I (Abbildung 4 (iv)), die mit parasagittale Scheiben mit lateralen entorhinalen Cortex (LEC). Abbildung 4 v. Chr. zeigen typische Scheiben, die die ME enthaltenC. Der dorsale Teil der prominenten dunklen dorsalen Entorhinale / Parasubicular Grenzbereich in den DIC beleuchteten Scheiben enthält einen Bereich des parasubiculum. Die parasubiculum Bereich ist deutlich von Nissl Färbung in den entsprechenden Bildern in der Spalte (iii) ergab. Die dorsalen der MEC (schwarze Pfeile in 4B und 4C-Säule (iv)) ventral der Gruppe von parasubicular Zellen, die weit herausragt in die Schicht I (roten Pfeile in 4B und 4C-Säule (iv)). Ein Vergleich der Abbildungen 4B und 4C Spalten (ii) und (iii) zeigt, dass die dorsale Grenze des MEC in den Nissl Abschnitten zu einem Ort, der ventralen zum dorsalen Rand der dunklen Entorhinale / Parasubicular Grenzbereich in der DIC Scheibe ist entspricht ( schwarze Pfeile). Die Lage der Grenze kann von DIC Bilder und Vergleich mit Referenz-Bildern geschätzt werden (siehe auch Lit.. 14). Zukünftige Validierung des dorsalen MEC Grenze mit molekularen Markern verbessert die Genauigkeit dieser Schätzung. Wir stellen fest, that gefärbt Referenzabschnitte, und Abschnitte, die für morphologische Identifizierung der markierten Neuronen, verarbeitet werden können, unterliegen beträchtliche Schrumpfung. Der Vergleich von absoluten Entfernungen relativ zum Wahrzeichen an der DIC und Kapiteln zum Nachschlagen daher zunächst erforderlich Messung und Korrektur der Schrumpfung (siehe zB Lit. 2). 3,3 kalibrieren und messen Entfernungen Um eine einfache Messung der Distanz in den Bildern zu erleichtern, verwenden das gleiche Ziel zu geringer Vergrößerung Bild eine Referenz Raster, um ein Pixel zu etablieren: Abstand Umtauschverhältnis. Messen Sie die Pixel-Abstand von der dorsalen Grenze des MEC an die Stelle von Interesse entlang der Kontur des MEC mit einem Grafikprogramm und konvertieren Pixel Abstand zum Abstand in um (5A). Wenn Neuronen mit einem Marker wie Biocytin gefüllt sind, dann Position des aufgezeichneten Neuronen kann dann auch durch entsprechende Verarbeitung gewonnen werden (siehe zB Lit. 2). 4. Repr.esentative Ergebnisse 5A zeigt ein Beispiel mit geringer Vergrößerung (4x) zusammengesetztes Bild eines parasagittale Scheibe nach der Aufnahme, mit den Standorten der aufgezeichneten Neuronen und Messung Führer überlagert. Aufnahmen aus den markierten dorsalen und ventralen Sternzellen sind in 5B gezeigt. Diese Aufnahmen helfen, die Identität der Zellen zu schaffen und zeigen, wie elektrischen Eigenschaften des MEC Schicht II Sternzellen am dorsalen und ventralen Orten unterscheiden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig1.jpg" /> Abbildung 1. Vorbereitung der parasagittale Scheiben schneiden. Eine ganze Gehirn ruht mit dorsalen Seite nach oben auf Filterpapier befeuchtet mit Schneiden ACSF. B </sTrong&gt; Rätsel nach Entfernung des Kleinhirns und des rostralen Drittel des frontalen Kortex. C hemiseziert Gehirn zur Montage bereit. D montiert Hemisphären auf Klebestreifen parallel zur Schneide des Vibratom Klinge vor dem Eintauchen in ACSF Schneiden und Schneiden. E Aussehen der Abschnitt mit LEC während das Aufschneiden Verfahren nach dem Entfernen der seitlichen Gewebe und noch nicht ausreichend medial für eine Standard-parasagittale MEC-Slice. F Aussehen der &quot;lateralen&quot; Teil des MEC nach dem Entfernen eines weiteren 400 um von Gewebe (die Oberfläche ist 400 um medial gezeigt, dass in . (F)) g Aussehen des &#39;medialen&#39; Teil des MEC nach einer 400 um parasagittale Scheibe geschnitten worden HALLO Schematics von EF Werte deuten darauf hin anatomischen Landmarken, c:. Kleinhirn, L: lateralen entorhinalen Cortex (LEC), m: Medial entorhinalen Cortex (MEC), h: Hippocampus, orange: äußere Kapsel, blau: Corpus callosum, Cyan: Gyrus dentatus, gr.EEN: CA3 &amp; CA1. Das Aussehen der rostralen Grenze des Hippocampus in Scheiben schneiden, die LEC enthalten ist konkav (schwarzer Pfeil in H), während in Scheiben, die nur MEC enthalten, die Grenze kann linear (roter Pfeil in I) oder konkav (roter Pfeil in J). Die ungefähren Formen von farbigen anatomischen Landmarken wurden aus den Anmerkungen in der Allen Brain Atlas (erhalten <a href="http://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html">http://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html</a> ). <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig2.jpg" /> Abbildung 2. Identifizieren MEC Schicht II-Zellen unter DIC Beleuchtung. Ein Beispiel zusammengesetztes Bild eines para<html> sagittalen Hirnschnitt bei geringer Vergrößerung (4x). Separate Bilder wurden ausgerichtet und vermischt, um störende Kanten und Vignettierung zu entfernen. Wichtiger Meilenstein Bereichen h: Hippocampus, m:. MEC B Crop von einem individuellen geringer Vergrößerung (4x) Bild, das Schicht II des MEC, sichtbar als dunkle vertikale Streifen in der Nähe des rechten Randes C MEC Schicht II bei hoher Vergrößerung enthält (. 40x) mit DIC-Beleuchtung. Das Bild ist ein ausgerichtetes und gemischt Verbund mehrerer Bilder. Die dichte zentrale &quot;Säule&quot; der Zellen ist Layer II. D Single hoher Vergrößerung DIC Bild zeigt eine Gruppe von gesunden vermeintlichen Sternzellen und Interneuronen in Schicht II. Wie hier gezeigt, Sternzellen treten oft in Gruppen an der Grenze der Schicht I / II. Pyramidenzellen neigen dazu, näher an den Layer II / III-Grenze gefunden werden. Die gestrichelten Linien in AC zeigen das Ausmaß der BD sind. Maßstab: in A-und B 500 um, in C und D 100 um. Abbildung 3 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3802/3802fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3. Die Messung der dorso-ventralen Position von Orten von Interesse. Ein ausgerichtet geringer Vergrößerung (4x) geben, die die gesamte dorso-ventralen Umfang des MEC zwischen dem Ort von Interesse (gekennzeichnet durch die Spitze eines Aufzeichnungselektrode) und dem dunklen Entorhinale / Parasubicular Grenzbereich Landmarke (verwendet, um die dorsalen Ziele einschließen der MEC - siehe Abbildung 4) B, wie in A, aber auch ein überlagertes Bild mit einem abgeblendet Leuchtfeldblende (überlagert mit reduzierter Deckkraft) statt einer Aufnahme Elektrode, um den Ort von Interesse zu markieren.. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig4.jpg" /> Abbildung 4. Die Schätzung der Dorsalrand des MEC von DIC Bilder von parasagittale Scheiben schneiden. AC Parasagittale Abschnitte (lateral nach medial) aus dem entorhinalen Kortex. DIC und Nissl Abschnitte sind aus verschiedenen mice AC Spalte (i):.. Ganze parasagittale Scheiben (400 um dick) (ausgerichtet und Blended-Komposite aus geringer Vergrößerung (4x) Bilder) AC Spalte (ii): Nahaufnahme der entorhinalen Kortex mit charakteristisch dunklen Entorhinale / Parasubicular im Grenzbereich Der obere Bereich eines jeden Bildes. AC Spalte (iii) Nissl gefärbten Schnitten (40 &amp;mgr; m dick) aus einer anderen Maus mit Bildern in AC (ii) ausgerichtet ist. Je dunkler, dichte Schicht von Zellen ist Schicht II. Vergleich von Spalten (ii) und (iii) zeigt, wie die Nissl gefärbten Zellen an der DIC Bilder erscheinen AC Spalte (iv):. Detail der Nissl gefärbten Schnitten. B-und C-Säule (iv)-Zellen aus dem parasubiculum (dorsalen Teil des dunklen Entorhinale / Parasubicular Grenzbereich in den DIC-Bilder) und Zellen aus dorsalen MEC. In B (iv) und C (iv) die große Rückenflosse Patch von parasubicular Zellen, die tief in die Schicht erstreckt I ist gut sichtbar (rote Pfeile). Die ventralen Rand dieser Patches entspricht der dorsalen border der MEC (schwarze Pfeile). In A (iv) die parasubicular Patch nicht vorhanden ist, der angibt, dass das Segment zu lateral für eine Standard-parasagittalen MEC Hirnschnittpräparat ist. In allen Platten, zeigen schwarze Pfeile die dorsale Grenze des MEC. Graue Pfeile geben die ungefähre ventralen Rand des MEC. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig5.jpg" /> Abbildung 5. Repräsentative Ergebnisse. Ein Blended abgeschnitten und Teil des Bildes in Abbildung 3 A. Die Positionen der Zelle einer dorsalen und einer ventralen Zelle werden durch blaue und grüne Kreise angezeigt bzw. gefüllt. Der schwarze Pfeil markiert den geschätzten Dorsalrand des MEC und wird in die tiefen Schichten durch die weiße gestrichelte Linie verlängert. Das feste weiße Linie ist eine Führung, welche die Kontur entlang der das Pixel Messung des Abstandes von der dorsalen des MEC der ventral gelegene Zelle aufgenommen wurde. Maßstab: B 500 um Electro.physiologische Spuren aus den Zellen angegeben in A. Von links nach rechts - unterschwellige Reaktionen auf aktuelle Schritte zur Eingangswiderstand berechnen, Spiking Antwort auf eine große positive aktuellen Schritt, Spike Detail.

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Nichts zu offenbaren.

Zur Untersuchung des MEC Schaltung Eigenschaften, die eine dorsal-ventrale Organisation, die wir hier im Detail beschrieben ein Verfahren zur Herstellung einer Scheibe parasagittale Vorbereitung, die die dorsal-ventralen Umfang der MEC bewahrt folgen zu erleichtern. Kritische Schritte Entfernung des Gehirns aus dem Tier. Seien Sie besonders vorsichtig, um Druck auf das Gehirn zu vermeiden. Dies ist wichtiger als die schnelle Entfernung des Gehirns. ...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Cutting ACSF (mM) </td><td> Standard-ACSF (mM) </td><td> Interne Lösung (mM) </td><td> CASNumber </td><td> Lieferant Katalognummer </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 86 </td><td> 124 </td><td></td><td> 7647-14-5 </td><td> Sigma S9888 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 1,2 </td><td> 1,2 </td><td></td><td> 13472-35-0 </td><td> Sigma 71505 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 </td><td> 2,5 </td><td> 10 </td><td> 7447-40-7 </td><td> Sigma P3911 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 25 </td><td> 25 </td><td></td><td> 144-55-8 </td><td> Fischer S/4240 </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 25 </td><td> 20 </td><td></td><td> 50-99-7 </td><td> Sigma G5767 </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> 75 </td><td></td><td></td><td> 57-50-1 </td><td> Sigma S5016 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0,5 </td><td> 2 </td><td></td><td> 10043-52-4 </td><td> VWR 190464K </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 7 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 7786-30-3 </td><td> Sigma 63020 </td></tr><tr><td> K Gluconat </td><td></td><td></td><td> 130 </td><td> 299-27-4 </td><td> Sigma G4500 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 7365-45-9 </td><td> Sigma H3375 </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td></td><td> 0,1 </td><td> 67-42-5 </td><td> Sigma E4378 </td></tr><tr><td> Na 2 ATP </td><td></td><td></td><td> 2 </td><td> 34369-07-8 </td><td> Sigma A7699 </td></tr><tr><td> Na 2 GTP </td><td></td><td></td><td> 0,3 </td><td> 36051-31-7 </td><td> Sigma G8877 </td></tr><tr><td> NaPhospho-Creatin </td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 19333-65-4 </td><td> Sigma P7936 </td></tr><tr><td> Biocytin (optional) </td><td></td><td></td><td> 2,7 </td><td> 576-19-2 </td><td&gt; Sigma B4261 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Schneiden ACSF, Standard ACSF und K-Gluconat interne Lösung Rezepten.

preparation of parasagittal slices for the investigation of dorsal-ventral organization of the rodent medial entorhinal cortex

Rechnen im Gehirn beruht auf Neuronen reagiert angemessen auf ihre synaptische Eingänge. Neuronen unterscheiden sich in ihrer Ergänzung und Verteilung von Ionenkanälen, die Membran, wie sie synaptische Eingänge reagieren zu bestimmen. Allerdings ist die Beziehung zwischen diesen zellulären Eigenschaften und neuronale Funktion im lebenden Tier nicht gut verstanden. Ein Ansatz, dieses Problem ist, topographisch organisierten neuronalen Schaltkreise, in denen die Position der einzelnen Neuronen Karten auf Informationen, die sie kodieren, oder Berechnungen von ihnen durchgeführten 1 zu untersuchen. Experimente mit Hilfe dieses Ansatzes lassen Grundsätze für die Abstimmung der synaptischen Antworten zugrunde liegenden Informationen Codierung in sensorischen und kognitiven Schaltungen 2,3. Die topographische Organisation der räumlichen Darstellung entlang der dorso-ventralen Achse des medialen entorhinalen Cortex (MEC) bietet die Möglichkeit, zwischen zellulären Mechanismen und Berechnungen zu schaffen iW ichtig für die räumliche Wahrnehmung. Neurone in Schicht II des MEC Nagetier kodieren Lage mit gitterartigen Brennen Felder 4-6. Für Neuronen in dorsalen Position in der MEC vor der Abstand zwischen den einzelnen Brennen Bereichen, die ein Raster bilden in der Größenordnung von 30 cm, während für Neuronen in zunehmend ventralen Positionen dieser Abstand erhöht, um größer als 1 m. Mehrere Studien haben zellulären Eigenschaften von Neuronen in Schicht II des MEC, dass, wie der Abstand zwischen Gitter Brennen Felder, unterscheiden sich auch je nach dorsal-ventrale Position enthüllt, was darauf hindeutet, dass diese zellulären Eigenschaften wichtig sind für die räumliche Berechnung 2,7-10. Hier beschreiben wir Verfahren für die Vorbereitung und elektrophysiologische Ableitung von Hirnschnitten, die dorsal-ventralen Umfang der MEC ermöglicht Untersuchung der topographischen Organisation der biophysikalischen und anatomischen Eigenschaften von MEC Neuronen aufrecht zu erhalten. Die dorsal-ventrale Position des identifizierten neurons relativ zu anatomischen Landmarken ist schwierig, genau festzustellen mit Protokollen, die horizontale Scheiben von MEC 7,8,11,12 zu verwenden, da es schwierig, Anhaltspunkte für die genaue dorsal-ventrale Lage der Scheibe zu etablieren. Die Verfahren beschreiben wir ermöglichen präzise und einheitliche Messung der Lage der aufgenommenen Zellen entlang der dorso-ventralen Achse des MEC sowie die Visualisierung molekularer Gradienten 2,10. Die Verfahren wurden für die Verwendung mit erwachsenen Mäusen (&gt; 28 Tage) entwickelt worden und haben sich bislang mit Mäusen bis zu 1,5 Jahre alt beschäftigt. Mit Anpassungen konnten sie mit jüngeren Mäusen oder anderen Nagetieren eingesetzt werden. Ein standardisiertes System der Vorbereitung und Messung helfen werden systematische Untersuchung der zellulären und Mikroschaltung Eigenschaften dieser Gegend.

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Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

Wir beschreiben die Verfahren zur Herstellung und elektrophysiologische Ableitung von Hirnschnitten, die dorso-ventralen Achse des medialen entorhinalen Cortex (MEC) zu halten. Da neuronale Codierung der Lage folgt eine dorsal-ventrale Organisation innerhalb des MEC, erleichtern diese Verfahren Untersuchung der zellulären Mechanismen, die wichtig für die Navigation und das Gedächtnis.

Vorbereitung der Parasagittale Slices für die Untersuchung von dorsal-ventrale Organisation des medialen entorhinalen Cortex Nager

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of ...

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JoVE Journal

Neuroscience

15.6K Aufrufe.  University of Edinburgh. Wir beschreiben die Verfahren zur Herstellung und elektrophysiologische Ableitung von Hirnschnitten, die dorso-ventralen Achse des medialen entorhinalen Cortex (MEC) zu halten. Da neuronale Codierung der Lage folgt eine dorsal-ventrale Organisation innerhalb des MEC, erleichtern diese Verfahren Untersuchung der zellulären Mechanismen, die wichtig für die Navigation und das Gedächtnis.

Serie: Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

Brain Imaging Investigation of the Neural Correlates of Emotional Autobiographical Recollection

Recollection of emotional autobiographical memories (AMs) is important to healthy cognitive and affective functioning 1 - remembering positive AMs is associated with increased personal well-being and self-esteem 2, whereas remembering and ruminating on negative AMs may lead to affective disorders 3. Although significant progress has been made in understanding the brain mechanisms underlying AM retrieval in general (reviewed in 4, 5), less is known about the effect of emotion on the subjective re-experience of AMs and the associated neural correlates. This is in part due to the fact that, unlike the investigations of the emotion effect on memory for laboratory-based microevents (reviewed in 6, 7-9), often times AM studies do not have a clear focus on the emotional aspects of remembering personal events (but see 10). Here, we present a protocol that allows investigation of the neural correlates of recollecting emotional AMs using functional magnetic resonance imaging (fMRI). Cues for these memories are collected prior to scanning by means of an autobiographical memory questionnaire (AMQ), therefore allowing for proper selection of emotional AMs based on their phenomenological properties (i.e., intensity, vividness, personal significance). This protocol can be used in healthy and clinical populations alike.

We present a protocol that allows investigation of the neural correlates of recollecting emotional autobiographical memories, using functional magnetic resonance imaging. This protocol can be used with both healthy and clinical participants.

Brain Imaging Untersuchung der neuronalen Korrelate der emotionalen Autobiographische Erinnerung

Recollection of emotional autobiographical memories (AMs) is important to healthy cognitive and affective functioning 1 - remembering positive AMs is ...

Forschung

Neurowissenschaften

Brain Imaging Investigation of the Neural Correlates of Emotion Regulation

The ability to control/regulate emotions is an important coping mechanism in the face of emotionally stressful situations. Although significant progress has been made in understanding conscious/deliberate emotion regulation (ER), less is known about non-conscious/automatic ER and the associated neural correlates. This is in part due to the problems inherent in the unitary concepts of automatic and conscious processing1. Here, we present a protocol that allows investigation of the neural correlates of both deliberate and automatic ER using functional magnetic resonance imaging (fMRI). This protocol allows new avenues of inquiry into various aspects of ER. For instance, the experimental design allows manipulation of the goal to regulate emotion (conscious vs. non-conscious), as well as the intensity of the emotional challenge (high vs. low). Moreover, it allows investigation of both immediate (emotion perception) and long-term effects (emotional memory) of ER strategies on emotion processing. Therefore, this protocol may contribute to better understanding of the neural mechanisms of emotion regulation in healthy behaviour, and to gaining insight into possible causes of deficits in depression and anxiety disorders in which emotion dysregulation is often among the core debilitating features.

We present a protocol that allows investigation of the neural correlates of deliberate and automatic emotion regulation, using functional magnetic resonance imaging. This protocol can be used in healthy participants, both young and older, as well as in clinical patients.

Brain Imaging Untersuchung der neuronalen Korrelate der Emotionsregulation

The ability to control/regulate emotions is an important coping mechanism in the face of emotionally stressful situations. Although significant progress ...

Brain Imaging Investigation of the Memory-Enhancing Effect of Emotion

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the neural mechanisms underlying this enhancing effect of emotion on memory. A method that has proven particularly influential in the 
investigation of the memory-enhancing effect of emotion is the so-called subsequent memory paradigm (SMP). This method was originally used to investigate the 
neural correlates of non-emotional memories3, and more recently we and others also applied it successfully to studies of emotional memory (reviewed in4, 5-7). 
Here, we describe a protocol that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion using the SMP in conjunction with 
event-related functional magnetic resonance imaging (fMRI). An important feature of the SMP is that it allows separation of brain activity specifically 
associated with memory from more general activity associated with perception. Moreover, in the context of investigating the impact of emotional stimuli, 
SMP allows identification of brain regions whose activity is susceptible to emotional modulation of both general/perceptual and memory-specific processing. 
This protocol can be used in healthy subjects8-15, as well as in clinical patients where there are alterations in the neural correlates of emotion perception 
and biases in remembering emotional events, such as those suffering from depression and post-traumatic stress disorder (PTSD)16, 17.

We present a protocol that uses functional magnetic resonance imaging to investigate the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion. This protocol allows identification of brain activity specifically linked to memory-related processing, contrary to more general perceptual processing, and can be used with healthy and clinical populations.

Brain Imaging Untersuchung der Memory-Effekt der Emotion

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the ...

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional distractibility) effects (reviewed in 1). Complementing our recent protocol 2 describing a method that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion (see also 1, 3-5), here we present a protocol that allows investigation of the neural correlates of the detrimental impact of emotion on cognition. The main feature of this method is that it allows identification of reciprocal modulations between activity in a ventral neural system, involved in 'hot' emotion processing (HotEmo system), and a dorsal system, involved in higher-level 'cold' cognitive/executive processing (ColdEx system), which are linked to cognitive performance and to individual variations in behavior (reviewed in 1). Since its initial introduction 6, this design has proven particularly versatile and influential in the elucidation of various aspects concerning the neural correlates of the detrimental impact of emotional distraction on cognition, with a focus on working memory (WM), and of coping with such distraction 7,11, in both healthy 8-11 and clinical participants 12-14.

We present a protocol that allows investigation of the neural mechanisms mediating the detrimental impact of emotion on cognition, using functional magnetic resonance imaging. This protocol can be used with both healthy and clinical participants.

Brain Imaging Untersuchung der beeinträchtigende Wirkung von Emotion auf Kognition

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural progenitor cells with astrocytic features (called SVZ astrocytes), neuroblasts, and intermediate progenitor cells. Neuroblasts born in the SVZ tangentially migrate a great distance to the olfactory bulb, where they differentiate into interneurons. Intercellular signaling through adhesion molecules and diffusible signals play important roles in controlling neurogenesis. Many of these signals trigger intercellular calcium activity that transmits information inside and between cells. Calcium activity is thus reflective of the activity of extracellular signals and is an optimal way to understand functional intercellular signaling among SVZ cells.
Calcium activity has been studied in many other regions and cell types, including mature astrocytes and neurons. However, the traditional method to load cells with calcium indicator dye (i.e. bath loading) was not efficient at loading all SVZ cell types. Indeed, the cellular density in the SVZ precludes dye diffusion inside the tissue. In addition, preparing sagittal slices will better preserve the three-dimensional arrangement of SVZ cells, particularly the stream of neuroblast migration on the rostral-caudal axis.
Here, we describe methods to prepare sagittal sections containing the SVZ, the loading of SVZ cells with calcium indicator dye, and the acquisition of calcium activity with time-lapse movies. We used Fluo-4 AM dye for loading SVZ astrocytes using pressure application inside the tissue. Calcium activity was recorded using a scanning confocal microscope allowing a precise resolution for distinguishing individual cells. Our approach is applicable to other neurogenic zones including the adult hippocampal subgranular zone and embryonic neurogenic zones. In addition, other types of dyes can be applied using the described method.

A method to load subventricular zone (SVZ) cells with calcium indicator dyes for recording calcium activity is described. The postnatal SVZ contains tightly packed cells including neural progenitor cells and neuroblasts. Rather than using bath loading we injected the dye by pressure inside the tissue allowing better dye diffusion.

Vorbereitung der akuten Subventrikulärzone Slices für Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

A Comprehensive Protocol for Manual Segmentation of the Medial Temporal Lobe Structures

The present paper describes a comprehensive protocol for manual tracing of the set of brain regions comprising the medial temporal lobe (MTL): amygdala, hippocampus, and the associated parahippocampal regions (perirhinal, entorhinal,&#160;and parahippocampal proper). Unlike most other tracing protocols available, typically focusing on certain MTL areas (e.g., amygdala and/or hippocampus), the integrative perspective adopted by the present tracing guidelines allows for clear localization of all MTL subregions. By integrating information from a variety of sources, including extant tracing protocols separately targeting various MTL structures, histological reports, and brain atlases, and with the complement of illustrative visual materials, the present protocol provides an accurate, intuitive, and convenient guide for understanding the MTL anatomy. The need for such tracing guidelines is also emphasized by illustrating possible differences between automatic and manual segmentation protocols. This knowledge can be applied toward research involving not only structural MRI investigations but also structural-functional colocalization and fMRI signal extraction from anatomically defined ROIs, in healthy and clinical groups alike.

The present work provides a comprehensive set of guidelines for manually tracing the medial temporal lobe (MTL) structures. This protocol can be applied to research involving structural and/or combined structural-functional magnetic resonance imaging (MRI) investigations of the MTL, in both healthy and clinical groups.

Eine umfassende Protokoll für die manuelle Segmentierung der medialen Temporallappen Structures

The present paper describes a comprehensive protocol for manual tracing of the set of brain regions comprising the medial temporal lobe (MTL): amygdala, ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

Die Herstellung von Oblique Spinal Cord Slices für Ventralwurzel Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

Vorbereitung von Horizontal Scheiben der erwachsenen Maus Retina für elektrophysiologische Untersuchungen

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific frequency and in turn modulate ongoing cortical oscillatory activity. This neurotool allows the establishment of a causal link between endogenous oscillatory activity and behavior. Most of the tACS studies have shown online effects of tACS. However, little is known about the underlying action mechanisms of this technique because of the AC-induced artifacts on Electroencephalography (EEG) signals. Here we show a unique approach to investigate online physiological frequency-specific effects of tACS of the primary motor cortex (M1) by using single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) to probe cortical excitability changes. In our setup, the TMS coil is placed over the tACS electrode while Motor Evoked Potentials (MEPs) are collected to test the effects of the ongoing M1-tACS. So far, this approach has mainly been used to study the visual and motor systems. However, the current tACS-TMS setup can pave the way for future investigations of cognitive functions. Therefore, we provide a step-by-step manual and video guidelines for the procedure.

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) allows the modulation of cortical excitability in a frequency-specific fashion. Here we show a unique approach which combines online tACS with single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) in order to "probe" cortical excitability by means of Motor Evoked Potentials.

Effekte der transkraniellen Wechselstrom Stimulation auf Primärbewegungsrinde durch Online-kombinierter Ansatz mit Transcranial magnetische Anregung

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...