Die Autoren bedanken sich bei Norman Krüger für seine ausgezeichneten technischen Support danken.

1. Teil 1: Culture of hNPCs in PuraMatrix <ol><li> Im Vorfeld der Erstellung eines Gerüsts mit einem PuraMatrix Konzentration von 0,25% ohne Laminin man braucht, um die folgenden Lösungen vorbereitet </li><li> Bereiten Sie eine Lösung mit 20% Saccharose und eine Lösung mit 10% Saccharose in sterilem destilliertem Wasser gelöst. </li><li> Für Lösung 1 Mix 120 ul der 20% Saccharose-Lösung mit 120 ul destilliertem Wasser in einem 1,5 ml konischen Röhrchen. </li><li> Für Lösung 2 mischen 60 ul der PuraMatrix Lösung mit 60 ul 20% Saccharose-Lösung in ein 1,5 ml konischen Röhrchen. </li></ol> Bei einer Zubereitung, der ein Gerüst mit einem PuraMatrix Konzentration von 0,25% mit Laminin (8 g pro 100 ul Matrix) braucht man ergänzt um folgende Lösungen herzustellen. <ol class="lroman"><li> Für Lösung 1 Mix 72 ul destilliertem Wasser mit 120 ul 20% Saccharose-Lösung und 48 ul Laminin in einem 1,5 ml konischen Röhrchen. </li><li>Für Lösung 2 mischen 60 ul PuraMatrix Lösung mit 60 ul der 20% Saccharose-Lösung in ein 1,5 ml konischen Röhrchen. </li></ol><ol start="5"><li> Für die Einbettung der Zellen in der PuraMatrix bereiten ein 4-Well-Zellkultur-Platte und legen Sie eine sterilisierte Deckglas (Durchmesser 13 mm) in zwei Brunnen. Bewahren Sie die Platte in der sauberen Bank für die spätere Verwendung. Glasdeckgläschen sind nur für die immunzytochemische Studien verwendet. Wenn keine immunzytochemische Färbungen bestimmt sind, kann der Schritt übersprungen werden. </li></ol> Zur Vorbereitung der hNPCs für die Verkapselung in 3D Gerüste, muss man die folgenden Lösungen herzustellen. Verdünnen Sie die Benzonase in der Trypsin / EDTA-Lösung, mit einem Verdünnungsfaktor von 1:10.000. Für eine Trypsin-Inhibitor/Benzonase Lösung zu mischen: DMEM/F12 + Benzonase 25U/μl + 1% HSA + Trypsin-Inhibitor (0,5-Promillegrenze). <ol start="6"><li> Lösen Sie die Zellen durch Zugabe von 500 ul Trypsin / Benzonase-Lösung und Inkubation für 5 min in einem Inkubator (37 ° C, 5% CO 2). Stoppen Sie die Reaktion mit Trypsin-Inhibitor/Benzonase Lösung. Anschließend Zentrifuge der abgelösten Zellen für 5 min bei 3000 x g. Wash-Zellen mit 5 ml 10% Saccharose-Lösung und Zentrifuge wieder. Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 10% Saccharose-Lösung sollte die endgültige Zelle Lösung enthalten 1x10 6 Zellen / ml. </li></ol> Die nächsten Schritte, 1,8 bis 1,11, sollte so schnell wie möglich erfolgen, da der niedrige pH-Wert des PuraMatrix Lösung, die schädlich für die Zellen könnten. <ol start="8"><li> Mix 60 ul Zellsuspension mit Lösung 1. </li><li> Add 120 ul Lösung 1, die die Zellen enthält, die konische Röhrchen mit Lösung 2 und vorsichtig mischen. </li><li> Platz 100 ul der Mischung sofort auf jedem Deckgläschen in der 4-Well-Platte residierte. </li><li> Fügen Sie langsam 200 ul Zellkulturmedium pro Vertiefung und nach 2-3 Minuten weitere 200 ul. Dies wird zu initiieren die Selbstorganisation der Matrix. </li><li> Inkubieren cEllen bei 37 ° C, für 1 Stunde in der Sterilbank auf einer Heizplatte oder die beheizte Fläche Ihres Sterilbank. So weit wie möglich bewegen sich nicht die Platte, da dies die Montage der Matrizen schaden könnte. </li><li> Entfernen Sie die meisten der mittel-, aber nicht alle, zur Vermeidung der Matrizen fallen trocken, mit einem 1000 ul Pipette. Add 500 ul Medium, um Matrizen für 10 min waschen. Schließlich entfernen Sie das Medium, und fügen Sie 500 ul frisches Medium und Ort der Kultur Platte in einem Inkubator (37 ° C, 5% CO 2). Da die Matrizen sind empfindlich gegen Stöße der Platten so wenig wie möglich bewegt werden sollte und gespeichert, wenn möglich, in einem separaten Brutschrank. </li><li> Die hier verwendete hNPCs wurden 7 Tage in der 3D-Gerüste vermehrt und Differenzierung wurde durch Rücknahme des Wachstums Faktoren 13 eingeleitet. Das Medium wurde alle 2-3 Tage gewechselt. </li></ol> 2. Teil 2: immunzytochemische Färbung des ganzen Matrizen <ol><li> Im Vorfeld der Färbung muss man vorbereiten: abVerriegelung Pufferlösung bestehend aus 5% normalem Ziegenserum und 0,3% Triton X-100 in PBS gelöst, ein 4% Paraformaldehyd-Lösung auf 0,1 M PBS basiert und bei Bedarf eine Lösung mit 4 &#39;,6-Diamidin-2&#39;-phenylindoldihydrochlorid ( DAPI) für eine Kerne Färbung mit 100 ng DAPI / ml in PBS gelöst. Die Proben wurden mit einer Mischung aus Mowiol und DABCO montiert. </li><li> Zum Waschen der Matrizen entfernen das Medium mit einem 1000 ul Pipette und waschen Sie die Gerüste mit PBS einmal für 5 Minuten. </li><li> Zur Befestigung der Gerüste entfernen Sie die PBS und fügen 400 ul von Paraformaldehyd (4% in 0,1 M PBS) in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Matrizen für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Feste Gerüste können in PBS gelagert werden ergänzt mit 0,02% NaN 3 bei 4 ° C für mehrere Wochen bis zu mehreren Monaten. </li><li> Im Vorfeld einer Färbung waschen die Gerüste mit PBS für 5 Minuten. </li><li> Inkubieren Sie die Gerüste in Blocking-Puffer-Lösung. Blocking-Lösung wurde dreimal alle 2-3 Stunden und subsequ verändertently Gerüste wurden in Blocking-Lösung über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie die Blocking-Puffer-Lösung und fügen Sie den Primärantikörper in PBS gelöst mit 1% normalem Ziegenserum ergänzt und inkubieren Sie die Matrizen über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie den primären Antikörper-Lösung und waschen Gerüste 4-mal für 2 h und anschließend über Nacht bei 4 ° C mit PBS. </li><li> Entfernen Sie die PBS und fügen Sie die Lösung mit dem sekundären Antikörper, in PBS gelöst ergänzt mit 1% normalem Ziegenserum, für 4 h bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Waschen Sie die Proben mit PBS 4-6 mal für 1 h und anschließend über Nacht bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Für eine Kerne Färbung kann man hinzufügen, 400 ul der DAPI-Lösung für 30 min. </li><li> Um die Proben braucht man Objektträger montieren. Dann werden 50 ul Mowiol / Dabco auf dem Objektträger. Entfernen Sie den Deckel rutscht von der 4-Well-Platte und legte sie vorsichtig auf die Montage Medium. </li><li> Hier verwendeten wir eine Biozero 8000Mikroskop (Keyence, Deutschland, Karlsruhe) zu erhalten einzelnen Aufnahmen und z-Stacks. Jeder Stapel enthält 30 einzelne Bilder mit einem Abstand von 1-2 um. Mit Hilfe der entsprechenden Analyse-Software der Unschärfe eigen Fluoreszenz wurde vor vollen Projektionen der z-Stacks produziert wurden entfernt. </li></ol> 3. Teil 3: Release des hNPCs aus der Gerüste für Durchflusszytometrie <ol><li> Im Vorfeld der Veröffentlichung der Zellen von Gerüsten waschen die Gerüste mit 500 ul HBSS. </li><li> Übertragen Sie die Gerüste durch eine 1000 ul Pipette auf eine 15 ml konischen Röhrchen mit Zellkulturmedium. </li><li> Um stören die Gerüste mechanisch resuspendieren der Zelle Lösung mehrmals mit einem 1000 ul Pipette und anschließend zentrifugiert die Lösung bei 3000 xg für 5 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette 500 ul Trypsin / Benzonase Lösung und Zellpellet mehrmals. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen für 5 minbei 37 ° C in der Trypsin / Benzonase Lösung. Zum Stoppen der Reaktion mit 1 ml Trypsin-inhibitor/Benzonase Lösung und Pipette nach oben und unten mehrere Male. </li><li> Centrifuge die Zellsuspension 5 min bei 3000 xg, entfernen Sie den Überstand und die Zellen mit 2 ml HBSS-Puffer. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Dieses Verfahren wird entfernen Matrix Schutt. </li><li> Pass der Zellsuspension Lösung Trog einer Zelle Sieb (Porengröße 70 um), um Aggregate zu entfernen und sammeln Sie die Zellen in Zellkulturmedium. Die erhaltenen Zellen können ausgesät wieder auf Deckgläsern für funktionelle Studien als Patch-Clamp-oder fluometric Messungen z. B. werden. Zur Bearbeitung der Zellen für die Durchflusszytometrie, fixieren die Zellen sofort (siehe 4.1). </li></ol> 4. Teil 4: Quantifizierung von βIII-Tubulin-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie <ol><li> Fix die freigesetzten Zellen in Schritt 3.7 mit 1% PFA erhalten für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Centrifuge die Zellsuspension für 5 min bei 3000 xg und Entfernene der Überstand. Falls erforderlich, können die Zellen bereit, bei 4 ° C für eine spätere Analyse gespeichert werden. Deshalb die Zellen in Waschpuffer (PBS mit 0,5% BSA und 0,02% Na-Azid ergänzt). </li><li> Um mit der Vorbereitung für die Durchflusszytometrie, Zentrifuge die Zellsuspension für 10 min bei 350 xg, Überstand verwerfen und Zellen in 25 ul der Antikörper-Lösung. Daher ist der erste Antikörper wird mit Saponin-Puffer in einer Konzentration 1:100 zB βIII-Tubulin gemischt. Die Saponin-Puffer besteht aus PBS mit einem Saponin-Konzentration von 0,5%, einer BSA-Konzentration von 0,5% und einem Na-Azid-Konzentration von 0,02%. </li><li> Inkubieren Sie die Zellsuspension mit dem ersten Antikörper für 2 h bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. Als Negativ-Kontrolle vorzubereiten einer Probe ohne den ersten Antikörper. </li><li> Zum ersten Waschschritt add 300 pl Saponin-Puffer direkt auf die Zellen. Centrifuge die Zellsuspension für 5 min bei 350 x g. Für den zweiten Waschschritt verwerfenÜberstand, zusätzlich 300 ul Puffer und zentrifugieren die Zellsuspension für 5 min bei 350 x g. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und 25 ul Lösung mit dem sekundären Antikörper (zB Alexa Fluor 647, 1:1000, gelöst in Saponin-Puffer). Inkubieren Zellen mit dem sekundären Antikörper 1h bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Zum ersten Waschschritt add 300 pl Saponin-Puffer direkt auf die Zellen. Centrifuge die Zellsuspension für 5 min bei 350 x g. Für den zweiten Waschschritt den Überstand verwerfen, zusätzlich 300 ul Puffer und zentrifugieren die Zellsuspension für 5 min bei 350 x g. </li><li> Überstand verwerfen und Zellen in 500 ul Waschpuffer für die Durchflusszytometrie. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für hNPCs in der sich selbst organisierenden Hydrogel Gerüst PuraMatrix kultiviert wird in Abbildung 1 dargestellt. Die hNPCs wachsen in sphärische Strukturen in unveränderter Uhr. In dieser Kultur Zustands, Zellen kann es kaum in einem Getriebe Licht erkannt werden, obwohl Bündeln von Prozessen zwischen den Sphären sichtbar sind (Abb. 1A). Je nach den Kulturbedingungen der verwendeten Zelltyp kann die Matrix zB durch Zugabe von Laminin geändert werden. Für die hNPC Zelllinie ReNcell VM (Millipore) Laminin ist notwendig, um ein Wachstum Muster mit weniger dichte Aggregate, sondern eine homogenere Verteilung der Zellen (Abb. 1B) zu induzieren. Unabhängig von Änderungen, kann die Matrix verwendet werden, um zB neuronale Differenzierung zu studieren. Abbildung 1C zeigt eine Färbung der hNPCs für die neuronalen Marker βIII-Tubulin. In diesem Beispiel wurden die Zellen für 7 Tage in der Matrix gewachsen und anschließend für 4 Tage, wo Differenzierung nach Abzug der Wachstumsfaktoren EGF und bFGF. 13 Zellkörper und ein dichtes Netz von Prozessen von den Zellen gebaut induziert wurde, unterschieden werden können anerkannt leicht. Es ist jedoch offensichtlich, dass eine Quantifizierung der Zellzahl zeitaufwendig ist, da eine große Anzahl vonBilder von verschiedenen Regionen der Matrix muss analysiert werden, um eine zuverlässige Datenbasis für eine statistische Analyse zu erhalten. In Abb. 1D kann man sehen, ein Beispiel von Zellen aus der Matrix freigesetzt und anschließend auf Deckgläsern flochten. Diese Zellen könnten für funktionelle Studien verwendet werden. Die Freisetzung der Zellen aus dem 3D-Gerüsten bietet die Möglichkeit, verschiedene Parameter wie Expression von Marker-Proteinen oder Überlebensrate der Zellen durch AnnexinV / PI-Färbung oder eine TUNEL-Assay analysiert. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel eines Durchflusszytometrie-Analyse des Prozentsatzes der βIII-Tubulin + Zellen. Die Negativ-Kontrolle (Zellen, die nicht für βIII-Tubulin markiert) ist in Abbildung 2a dargestellt. Diese Kontrollen werden verwendet, um das Tor für die spätere Detektion von βIII-Tubulin +-Zellen (Abb. 2B) zu bestimmen. Ein Vergleich der manuellen Zählung von Zellen und eine Analyse mittels Durchflusszytometrie ist in Abbildung 2C dargestellt. Der Anteil der βIII-Tubulin + Zellen wurde bestiminiert durch Zählen der Gesamtzellzahl (mittels eines nuklearen DAPI-Färbung) und die Anzahl der βIII-Tubulin + Zellen in der Fluoreszenz-Bildern. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3830/3830fig1.jpg" /> Abbildung 1. hNPCs in der sich selbst organisierenden Peptid-Hydrogel PuraMatrix kultiviert. A) hNPCs in PuraMatrix gekapselt (PM) wachsen in sphärische, dicht gepackte Strukturen, wo der Durchmesser der Kugeln kann bis zu mehreren hundert um. In zwischen den Kugeln kann man erkennen, Bündeln von Prozessen von den Zellen (Pfeile) gebaut. B) Zellen in PuraMatrix gekapselt mit Laminin (PML) in weniger dichten Strukturen wachsen, mehr homogen verteilt ergänzt. In der Laminin ergänzt Matrix kann man einzelne Zellen in weniger dicht besiedelten Gebieten (Pfeile) zu erkennen, aber es ist kaum möglich, die Anzahl der Zellen zu quantifizieren. C) hNPCs für 4 Tage in PML ausdrückliche neuronalen Marker wie βIII-Tubulin (grün) differenziert. Um Auswertungente der Anteil der positiven Zellen muss man die gesamte Zellzahl von einem Kerne Färbung wie DAPI (blau) zu bestimmen. Die Mikrofotografie stellt die volle Projektion einer Z-Stapel von Bildern mit Biozero-8000 Lupe genommen. D) Zellen aus der Matrix freigesetzt werden zB auf Deckgläsern für die weitere funktionelle Studien ausgesät werden. Die Mikrofotografie zeigt Zellen für 3D kultiviert, anschließend das Freigabeverfahren. Die Färbung für βIII-Tubulin (rot) zeigt eine vergleichbare Morphologie der Zellen in die 3D-Gerüst gehostet. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3830/3830fig2.jpg" /> Abbildung 2. Durchflusszytometrie Zellen aus PuraMatrix freigegeben. Um die zeitaufwendige Quantifizierung von Mikrophotographien verwendeten wir ein Protokoll, um Zellen in PuraMatrix den Zugang zu schnelleren Analyse mittels Durchflusszytometrie kultivierten Version zu überwinden. A) Ungefärbte Zellen wurden als negative Kontrolle verwendet, um das Tor (schwarzer Rahmen) für die nachfolgend dargestellt und analysiertvon z. B. βIII-Tubulin-Zellen. B) Zur Quantifizierung der Anteil der βIII-Tubulin + Zellen die gleiche Tor, in der Negativ-Kontrolle eingestellt, verwendet wurde. Positive Zellen werden im rechten Teil der x-Achse, wo sich auch ein Zwischenprodukt Bevölkerung beobachtet wurde (gestrichelte Rahmen), am ehesten entspricht Zelltrümmer. C) Der Vergleich der manuellen gezählten Zellen und Zellen mittels Durchflusszytometrie gezählt zeigte einen viel höheren Anteil an positiven Zellen, in denen die zeitliche Abhängigkeit von der Anzahl der βIII-Tubulin + war vergleichbar mit Angabe der Zuverlässigkeit der Durchflusszytometrie Protokoll.

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	<li>Zhang, S., Gelain, F., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+for+3D+tissue+cell+cultures.">Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures.</a> Semin. Cancer. Biol. 15, 413-420 (2005).</li><li>Gelain, F., Horii, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+scaffolds+for+3-d+tissue+cell+cultures+and+regenerative+medicine.">Designer self-assembling peptide scaffolds for 3-d tissue cell cultures and regenerative medicine.</a> Macromol. Biosci. 7, 544-551 (2007).</li><li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Culture:+building+a+better+matrix.">Cell Culture: building a better matrix.</a> Nature. Methods. 6 (8), 619-622 (2009).</li><li>Hauser, C. A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+biological+materials.">Designer self-assembling peptide nanofiber biological materials.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 2780-2790 (2010).</li><li>Teng, Y. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der Einsatz von 3D-Gerüsten bietet die Möglichkeit, die Entwicklung verschiedener Zelltypen in einer Zellkultur Situation näher an die in vivo Situation zu studieren. Doch in Bezug auf die Analyse von zB neuronale Differenzierung oder funktionelle Untersuchungen muss man einige Hürden überwinden, um zuverlässige Daten für zB Quantifizierung von Zelltypen zu gewinnen. Hier beschreiben wir die Kultur des hNPCs in der Peptid-Hydrogel-basierte Gerüst PuraMatrix und anschließend...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> PuraMatrix Peptid-Hydrogel </td><td> BD Bioscience </td><td> 354250 </td><td></td></tr><tr><td> Maus Laminin I </td><td> Cultrex </td><td> 400-2009090 </td><td></td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> Sigma </td><td> S9378-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Normalem Ziegenserum </td><td> Dako </td><td> X0907 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X 100 </td><td> Roth </td><td> 3051,3 </td><td></td></tr><tr><td> PBS Dulbecco </td><td> Biochrom AG </td><td> L 1825 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170-088 </td><td> Hanks &#39;Balanced Salt Solution 1X </td></tr><tr><td&gt; ΒIII-Tubulin-Antikörper </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-51670 </td><td> Maus, monoklonal, 1:500 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A 11029 </td><td> Ziege α-Maus, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 </td><td> Invitrogen </td><td> A 11031 </td><td> Ziege α-Maus, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A 21235 </td><td> Ziege α-Maus, 1:1000 </td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 Reagent </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> Aldrich </td><td> D2 ,780-2 </td><td> 1,4-Diazabicyclo [2.2.2] octan 98% </td></tr><tr><td> Zellsieb </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> 70 um Porengröße </td></tr><tr><td> Saponin </td><td> Merck </td><td> 7695 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin/ EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase 250 U / ul </td><td> Merck </td><td> 1.01654.0001 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin Inhibitor </td><td> Sigma </td><td> T6522 (500 mg) </td><td></td></tr><tr><td> 20% HSA </td><td> Octapharma </td><td> Human-Albumin Kabi 20% </td><td></td></tr></tbody></table>

cultivation of human neural progenitor cells in a 3-dimensional self-assembling peptide hydrogel

Der Einfluss von 3-dimensionalen (3D) Gerüste auf Wachstum, Proliferation und schließlich neuronale Differenzierung ist von großem Interesse, um neue Methoden für die zellbasierte und standardisierte Therapien bei neurologischen Erkrankungen oder neurodegenerativen Erkrankungen zu finden. 3D-Strukturen sollen ein Umfeld viel näher liefern, um die in vivo Situation als 2D-Kulturen. Im Rahmen der regenerativen Medizin, hält die Kombination von Biomaterial Gerüste mit neuralen Stamm-und Vorläuferzellen großes Versprechen als therapeutisches Werkzeug. 1-5 Kultur-Systemen emuliert eine dreidimensionale Umgebung haben gezeigt, dass die Proliferation und Differenzierung in verschiedene Arten von Stammzellen beeinflussen und Vorläuferzellen. Hierbei wird die Bildung und Funktionalisierung der 3D-Mikroumgebung wichtig für das Überleben und das Schicksal der eingebetteten Zellen zu bestimmen. 6-8 Hier haben wir PuraMatrix 9,10 (RADA16, PM), ein Peptid Hydrogel Gerüst,die ist gut beschrieben und verwendet werden, um den Einfluss einer 3D-Umgebung auf verschiedenen Zelltypen zu untersuchen. 7,11-14 PuraMatrix kann leicht angepasst werden und das synthetische Herstellung der Nano-Fasern bietet eine 3D-Kultursystem von hoher Zuverlässigkeit, die wird zusätzlich xeno-frei. Vor kurzem haben wir den Einfluss der PM-Konzentration auf die Bildung des Gerüstes untersucht. 13 In dieser Studie verwendeten Konzentrationen von PM hatten einen direkten Einfluss auf die Bildung der 3D-Struktur, die durch Rasterkraftmikroskopie nachgewiesen wurde. Eine anschließende Analyse der Überleben und die Differenzierung der hNPCs zeigte einen Einfluss der verwendeten Konzentrationen von PM auf das Schicksal der eingebetteten Zellen. Allerdings zeigt die Analyse des Überlebens oder der neuronalen Differenzierung durch Immunfluoreszenztechniken besitzen einige Hürden. Um sich verlässliche Daten, muss man die Gesamtzahl der Zellen in einer Matrix zu bestimmen, um die relative Anzahl von z. B. erhalten. neuronalen Zellen durch βIII-Tubulin markiert. Diese Voraussetzungen eine Technik, um die Gerüste in allen 3-Dimensionen mit einem konfokalen Mikroskop oder eine vergleichbare Technik wie Fluoreszenz-Mikroskope in der Lage, Z-Stapel von der Probe zu analysieren. Des Weiteren wird diese Art der Analyse ist extrem zeitaufwendig. Hier zeigen wir eine Methode, um Zellen aus dem 3D-Gerüste für die spätere Analyse zB mittels Durchflusszytometrie freizugeben. In diesem Protokoll menschliche neurale Vorläuferzellen (hNPCs) der ReNcell VM-Zelllinie (Millipore USA) wurden kultiviert und differenziert in 3D-Gerüsten aus PuraMatrix (PM) oder PuraMatrix mit Laminin (PML) ergänzt. In unseren Händen ein PM-Konzentration von 0,25% war optimal für die Kultivierung der Zellen 13, aber die Konzentration auf andere Zelltypen können angepasst werden. 12 Die freigesetzten Zellen können zB immunzytochemische Studien eingesetzt werden und anschließend mittels Durchflusszytometrie analysiert. Dies beschleunigt die Analyse und more über die gewonnenen Daten beruhen auf einer breiteren Basis, die Verbesserung der Zuverlässigkeit der Daten.

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Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Hier beschreiben wir die Verwendung eines sich selbst organisierenden 3-dimensionalen Gerüst zur Kultur humaner neuraler Vorläuferzellen. Wir präsentieren ein Protokoll, um die Zellen aus dem Gerüste Freisetzung analysiert anschließend zB mittels Durchflusszytometrie werden. Dieses Protokoll kann zu anderen Zelltypen angepasst werden, um detaillierte mechanistisch Studien durchzuführen.

Kultivierung humaner neuronaler Vorläuferzellen in einer 3-dimensionalen Self-Montage Peptide Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.5K Aufrufe.  University of Rostock. Hier beschreiben wir die Verwendung eines sich selbst organisierenden 3-dimensionalen Gerüst zur Kultur humaner neuraler Vorläuferzellen. Wir präsentieren ein Protokoll, um die Zellen aus dem Gerüste Freisetzung analysiert anschließend zB mittels Durchflusszytometrie werden. Dieses Protokoll kann zu anderen Zelltypen angepasst werden, um detaillierte mechanistisch Studien durchzuführen.

Serie: Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Eine Methode zur Ovarialfollikel Encapsulation und Kultur in einem Proteolytisch Degradable 3 Dimensional-System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Forschung

Biotechnik

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotypische Collagen I Assay: A Temperguss Platform to Cell Verhalten in 3-Dimensional Kontext beurteilen

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Adaptation of a Haptic Robot in a 3T fMRI

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing radiation, millimeter spatial accuracy of anatomical and functional data 2, and nearly real-time analyses 3. Haptic robots provide precise measurement and control of position and force of a cursor in a reasonably confined space. Here we combine these two technologies to allow precision experiments involving motor control with haptic/tactile environment interaction such as reaching or grasping. The basic idea is to attach an 8 foot end effecter supported in the center to the robot 4 allowing the subject to use the robot, but shielding it and keeping it out of the most extreme part of the magnetic field from the fMRI machine (Figure 1).
The Phantom Premium 3.0, 6DoF, high-force robot (SensAble Technologies, Inc.) is an excellent choice for providing force-feedback in virtual reality experiments 5, 6, but it is inherently non-MR safe, introduces significant noise to the sensitive fMRI equipment, and its electric motors may be affected by the fMRI's strongly varying magnetic field. We have constructed a table and shielding system that allows the robot to be safely introduced into the fMRI environment and limits both the degradation of the fMRI signal by the electrically noisy motors and the degradation of the electric motor performance by the strongly varying magnetic field of the fMRI. With the shield, the signal to noise ratio (SNR: mean signal/noise standard deviation) of the fMRI goes from a baseline of &tilde;380 to &tilde;330, and &tilde;250 without the shielding. The remaining noise appears to be uncorrelated and does not add artifacts to the fMRI of a test sphere (Figure 2). The long, stiff handle allows placement of the robot out of range of the most strongly varying parts of the magnetic field so there is no significant effect of the fMRI on the robot. The effect of the handle on the robot's kinematics is minimal since it is lightweight (&tilde;2.6 lbs) but extremely stiff 3/4" graphite and well balanced on the 3DoF joint in the middle. The end result is an fMRI compatible, haptic system with about 1 cubic foot of working space, and, when combined with virtual reality, it allows for a new set of experiments to be performed in the fMRI environment including naturalistic reaching, passive displacement of the limb and haptic perception, adaptation learning in varying force fields, or texture identification 5, 6.

The adaptation and use of a haptic robot in a 3T fMRI is described.

Anpassung eines Haptic Robot in einem 3T fMRT

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing ...

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

Electric Field-gesteuerte gerichtete Wanderung von neuralen Vorläuferzellen in 2D-und 3D-Umgebungen

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

Anbau von Säugetierzellen mit einem Einweg-Bioreaktorsystem Pneumatische

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

3D Hydrogel Kulturen von primären Gliazellen für In-vitro- Modellierung von Neuroinflammation verbessert

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

Hyaluronsäure basierte Hydrogele für 3-dimensionale Kultur des Patienten abgeleitet Glioblastom-Zellen

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Synthesis of Strong Adhesive Hydrogel, Gelatin O-Nitrosobenzaldehyde

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - gelatin o-nitrosobenzaldehyde (gelatin-NB) - which is mainly used for tissue regeneration and has been validated in animal models of corneal injury and inflammatory bowel disease. This is a novel hydrogel formed by modifying biological gelatin with o-nitrosobenzaldehyde (NB). Gelatin-NB was synthesized by activating the carboxyl group of NB-COOH and reacting with gelatin through 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). The obtained compound was purified to generate the final product, which can be stably stored for at least 18 months. NB has a strong adhesion to -NH2 on the tissue, which can form many C = N bonds, thus increasing the adhesion of gelatin-NB to the tissue interface. The preparation process comprises steps for the synthesis of the NB-COOH group, modification of the group, synthesis of gelatin-NB, and purification of the compound. The goal is to describe the specific synthesis process of gelatin-NB in detail and to demonstrate the application of gelatin-NB to damage repair. Moreover, the protocol is presented to further strengthen and expand the nature of the material produced by the scientific community for more applicable scenarios.

The protocol presented here shows the synthesis of a strong adhesive hydrogel gelatin o-nitrosobenzaldehyde (gelatin-NB). Gelatin-NB has rapid and efficient tissue adhesion ability, which can form a strong physical barrier to protect wound surfaces, so it is expected to be applied to the field of injury repair biotechnology.

Synthese von stark adhäsivem Hydrogel, Gelatine O-Nitrosobenzaldehyd

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - ...