Diese Arbeit wurde vom NIH (U54HD41857 und PL1EB008542, ein P30 Biomaterialien Kern innerhalb der Oncofertility Consortium Roadmap Zuschuss) gefördert.

1. Follikel Isolation Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die National Institutes of Health Guide Set für die Pflege und Verwendung von Labortieren und die etablierten institutionellen Tiere Benutzung und Pflege-Protokoll an der Northwestern University durchgeführt. Für optimale Ergebnisse sind alle Sektionen in L15 Medien zur pH-Kontrolle bei Umgebungstemperaturen von CO 2 durchgeführt, auf 37 ° C erhitzt, Stadien für die Temperaturregelung und auf einer sauberen Werkbank, um bakterielle Verunreinigungen zu minimieren. Die Dissektion Medien (DM) ist mit L15-Medien mit 50 IU / mL Penicillin und 50 &amp;mgr; l / ml Streptomycin und 1% FBS vorbereitet. Die Wartung Medien (MM) ist mit αMEM Medien mit 50 IU / mL Penicillin und 50 &amp;mgr; l / ml Streptomycin und 1% FBS vorbereitet. <ol><li> Transfer frisch präparierten Ovarien von 16 Tage alten Maus in eine neue 35-mm-Petrischale mit 1-2 mL MM mit 0,1% Collagenase und 0,1% DNase. Inkubieren für 15 Minuten in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Nach der Inkubation, führen mehrere Waschschritte in DM um Kollagenase zu entfernen, und dann übertragen auf eine 35 mm Petrischale mit frischem DM. Isolieren Follikel aus dem Eierstock durch leichtes Schnippen (oder Schneiden) Follikel weg von den ganzen Eierstock mit zwei 28 8.5 Gauge-Nadeln an Einwegspritzen. Entfernen Sie so viel Stroma wie möglich, ohne die Integrität der Follikel. Herauspräparieren 20-40 sekundären Follikel pro Ovar (130-150mm). Diese Follikel haben in der Regel 2-3 Schichten von somatischen Zellen. </li><li> 1 ml MM an die zentrale Vertiefung einer 60 mm IVF (In-vitro-Fertilisation) Petrischale und 3 mL MM mit dem Außenring. Transfer intakter Follikel mit einer Pipette auf den äußeren Ring des IVF Schüssel kurz abspülen und dann selektiv übertragen sie in die zentrale Vertiefung (siehe 1.4). Bewahren Sie diese IVF Gericht in den Inkubator. </li><li> Nach all den Follikel erhoben werden, erfolgt die Auswahl Schritt unter einem Binokular mit einem 5-8fache Vergrößerung durchgeführt. Gesunde Follikel haben folgende morphologische Merkmale: <ul><li> 2-3 somatische Zellschichten </li><li> 130-150 mm </li><li> Keine Trennung zwischen Oozyte und somatischen Zellen </li><li> Intakte und rund Oozyten Übertragen Sie die gesunde Follikel in das Zentrum der IVF Gerichte für die Verkapselung. </li></ul></li></ol> 2. Follikel Encapsulation, Methode 1 - &quot;The Drop-Methode&quot; <ol><li> 1 ml von 50 IU / ml Thrombin in TBS mit 40 mM CaCl 2 in die Mitte und der IVF Gericht. Tauwetter und halten Fibrinogen Lager (50 mg / mL in TBS) auf Eis. Bringen Sie das Fibrinogen auf Raumtemperatur rechts vor dem Gebrauch. </li><li> Bereiten Sie die Fibrinogen / Alginat-Lösung durch Mischen 1x PBS, 0,5% Alginat in PBS-Lösung und 50 mg / mL Fibrinogen-Lösung bei einem Verhältnis 2:1:1 in einer 1,7 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen. Vermeiden Sie die Einführung Blasen in der Lösung. Vorsichtig vortexen und Spin-down. Die Lösung erscheint leicht bewölkt und sollte unmittelbar vor Gebrauch vorbereitet werden. </li><li> Legen Sie zwei Tropfen von Fibrinogen / Alginat-Lösung in den äußeren Ring einer IVF Gericht: eine 90 ul Tropfen für die Verkapselung und 10 ul Tropfen zum Waschen. Zur Verringerung Verdunstung, schalten Sie die Heizung Etappe auf dem Binokular. Transfer 10-15 Follikel in den 10 l Tropfen mit einer minimalen Menge von Kulturmedien (&lt;5 ul) mit einem 200 um Mikropipette Spitze, und schnell mischen. Übertragen Sie alle der Follikel in den 90 ul Tröpfchen mit einer minimalen Menge der Lösung (&lt;5 ul) aus dem ersten Tropfen, und mischen. </li><li> Gleichzeitig absaugen ein Follikel und 5 ul Fibrinogen / Alginat-Lösung mit einem 10 ul Pipettenspitze und Freisetzung in die Thrombin / Ca 2 +-Lösung in der IVF Gericht. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle die Follikel gekapselt sind. </li><li> Cross-Link die Perlen für 5-7 Minuten in der Thrombin / Ca 2 +-Lösung. Die Perlen wird dunkler als Fibringele. Übertragen Sie die Perlen in eine Petrischale mit MM, beginnend mit den dunkleren Perlen zuerst. Inkubieren Sie die Schale für 15-30 Minuten inder Inkubator abzuspülen die restlichen Thrombin. </li><li> Übertragen Sie die Perlen in einer 96-well-Kulturplatte mit 100 ul Follikelwachstum Medien und das Bild sofort. Das Wachstum Medien (GM) ist mit αMEM Medien mit 10 mIU / ml rekombinantes FSH, 3 mg / ml BSA ergänzt vorbereitet, 1 mg / ml bovinem Fetuin, 5 g / ml Insulin, 5 ug / ml Transferrin, und 5 ng / ml Selen. </li></ol> 3. Follikel Encapsulation, Methode 2 - &quot;Der Parafilm Method&quot; <ol><li> Bereiten Sie die Fibrinogen / Alginat-Lösung durch Mischen von 0,5% Alginat-Lösung und 50 mg / mL Fibrinogen-Lösung im Verhältnis 1:1 in einem 1,7 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Pipette 7,5 ul Tropfen der Fibrinogen / Alginat-Gemisch auf einem Parafilm beschichteten Objektträger mit 3 mm Abstandhalter. Transfer 1 Follikel in jedem Tropfen mit einem minimal Höhe von Medien. </li><li> Add 7,5 ul von Thrombin / Ca 2 +-Lösung, um jeden Tropfen. Das Mischen ist nicht erforderlich, da das Gel bildet fast augenblicklich. </li><li> Decken Sie die Gele mit dem zweiten Parafilm beschichteten Objektträger, legen Sie die Folien auf den Kopf in eine 100 mm Petrischale und Transfer in den Inkubator für 5 Minuten. </li><li> Übertragen Sie die Perlen in eine Petrischale mit MM, und dann in die Kultur gut wie zuvor beschrieben. Wenn die Perlen aneinander haften, die durch Vernetzung zwischen den Kügelchen ist, kann sie vorsichtig mit einer Pinzette getrennt werden. </li></ol> 4. Follikel Imaging and Media ändern <ol><li> Alle 2 Tage werden die kultivierten Follikel aufgenommen mit einem Lichtmikroskop und dem Follikel Durchmesser ist mit dem Software-Programm ImageJ gemessen. </li><li> Alle 2 Tage wird die Hälfte des Wachstums Medien (50 ul) durch frische, voräquilibriert Wachstum Medien ersetzt. </li></ol> 5. Follikel Erholung von der 3D-Matrix-und in vitro Eizellreifung (IVM) <ol><li> Nach 8 Tagen der Kultur erscheinen die Hydrogele klar durch Abbau des Fibrins Komponente vollständig, und die Follikel mit einem Durchmesser von 300-400 mu m zu erweitern. Die restlichen Alginat abgebaut wird Alginat-Lyase, einem pflanzlichen Enzym, das spezifisch degradiert Alginat und hat keinen Einfluss auf tierische Zellen. </li><li> Entfernen Nährmedien aus Brunnen mit den Perlen und 100 ml 10 IU / mL Alginat-Lyase in αMEM. Lassen Sie die Platte in den Brutschrank für 25-30 Minuten. </li><li> Entfernen Follikel aus dem aufgelösten Kügelchen mit einem stumpfen Ende Spitze. Transfer ersten bis zum äußeren Ring einer IVF Schale mit DM, und dann in der Mitte gut, auch mit DM zu waschen. </li><li> Nach dem Waschen, Transfer der Follikel auf die äußere und dann Innenring eines IVF Schale mit Reifung Medien. In-vitro-Maturation Medien (IVM) ist der αMEM, 10% FCS, 1,5 IU / mL hCG zusammengesetzt, und 5 ng / mL des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) </li><li> Transfer zum CO 2-Inkubator für 15-16 Stunden. Untersuchen Sie die Follikel für Kumuluszellen Expansion. Um die Cumulus-Zellen, die aus der Eizelle entfernt, hinzugefügt Hyaluronidase Lösung Endkonzentration 0,1 mg / mL und inkubieren in den Inkubator für 2-3 Minuten. Verwenden Sie eine 75 mm Mikropipette Spitze zu scheren die Cumulus-Zellen aus der Eizelle durch Auf-und Abpipettieren mehrmals. Bestimmen Sie Reifungsphase der Eizelle unter einem Licht oder einem Binokular. Die möglichen Stufen, von der geringsten zur höchsten Reife, sind: <ul><li> Degeneriert. Die Eizelle wird in zwei oder mehr Stücke zersplittert. </li><li> Keimbläschen (GV) der Bühne. Die Eizelle nicht wieder Meiose in Reaktion auf hCG Exposition, was sich durch die fortgesetzte Präsenz der Kern der Eizelle (GV) ist. </li><li> Keimbläschen Aufschlüsselung (GVBD). Die Kernmembran fehlt die Eizelle, aber es gibt keinen Polkörper vorhanden. Daher ist die Eizelle noch in der Meiose-I. </li><li> Metaphase-II verhaftet Eizelle (MII). Die Eizelle wieder Meiose, und ist nun in der Metaphase-II verhaftet. Ein Polkörper sichtbar sein soll auf einem hellen oder einem Binokular. Die Eizelle wird bei MII bleiben, es sei denn in späteren Experimenten befruchtet. </li></ul></li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Wir beschrieben eine neuartige Verkapselung Methode der Eibläschen in einem FA-IPN für In-vitro-Kultur (Abb. 1). Eibläschen bestehen aus einer Eizelle durch mehrere Schichten von somatischen Zellen umgeben. Die Kommunikation zwischen den mehreren zellulären Kompartimenten ist wichtig für gesunde Follikel Entwicklung und Eizellreifung. Follikel Kapselung in einer 3D-Hydrogel unterstützt Follikel Expansion unter Beibehaltung der Architektur des Follikels 9,11,12. Als Follikel entwickeln, baut ihr Volumen exponentiell und die Verkapselung von Biomaterial sollte diese Expansion ohne die Entwicklung einer Hemmung der Druckkraft zu ermöglichen. FA-IPN ist ein Netzwerk von zwei natürlichen Materialien, in denen Fibrin proteolytisch abbaubar durch Plasmin aktiviert durch die Follikel und Alginat ist biologisch inert 13 (Abbildung 2) gebaut. Während das Wachstum der Follikel, beginnt Fibrinabbauprodukten lokal in der Nähe der Follikel, und dauert bis das Fibrin aus dem Hydrogel deaktiviert ist. Die nicht-abbaubaren Alginat-Komponente, die intakt in die Kultur Zeit bleibt, unterstützt die 3D-Struktur des Hydrogels. Follikel wurden in der zweiten Stufe der Entwicklung (150-180 Mikrometer Durchmesser) isoliert und erweitert, um 400 um die antral Stadium der Entwicklung in den FA-IPN-Gelen. Mit hCG Stimulation kann der kultivierte Follikel unterziehen cumulus Zellexpansion und Eizellen können Meiose und Fortschritt zu Metaphase II wieder für die Befruchtung. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Kapselung Methode und das Einkapselungsmaterial Follikel Kultur und erfolgreiche Reifung in vitro (Abbildung 3) erlaubt. Fibrinabbauprodukten rund um die encapsulEINZELNEN SEKTOREN Follikel beginnt am ersten Tag der Kultur und wird von Tag 6 abgeschlossen. Aprotinin, einem löslichen Plasmin-Inhibitor, kann verwendet werden, um Fibrinabbauprodukten ändern und mechanische Gradienten in das Einkapselungsmaterial (Abbildung 4) zu verlängern. Wenn Follikel mit 0,01 TIU / mL Aprotinin kultiviert werden, ist das Fibrin abgebaut langsamer in den ersten 4 Tagen. Dennoch ist die Follikel noch die antral Bühne entwickeln und Eizellen zuständig bleiben, um die Meiose zu Metaphase II fortgesetzt, nachdem Aprotinin removed.A hohe Konzentration von Aprotinin (0,1 TIU / mL) deutlich hemmt Fibrinabbauprodukten verhindert Matrix Steifigkeit Follikel Expansion und somatischen Zellen Invasion in der Matrix zu beobachten ist. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Flowchart der Follikelentwicklung. Die Ovarialfollikel besteht aus einem zentral gelegenen Eizelle durch eine oder mehrere Lagen von somatischen Zellen, die Eizelle Entwicklung zu unterstützen umgeben. Als Follikel aus sekundären den präovulatorischen antral Bühne entwickeln, vermehren sich die somatischen Zellen rund um die Eizelle und zu differenzieren, und die Eizelle an Größe zunimmt. In-vitro-Maturation (IVM) ist der letzte Schritt für die Follikel Kultur, wenn die somatischen Zellen mit den benachbarten Eizelle bezeichnet Kumuluszellen nach hCG Stimulation zu erweitern, und die Eizelle wieder Meiose und schreitet zu einem Metaphase II (MII) Bühne. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2a.jpg" alt="Abbildung 2a" /> Abbildung 2a. Alginat und Fibrin-Alginat für 3D-Follikel Kultur in vitro. (A) Alginat ist ein natürliches Biomaterial, geeignet für in-vitro-Kultur Follikel wegen seiner sanften Gelierung und biochemischen Eigenschaften, wie Maschenweite, steuerbare Steifigkeit und biologischen Inertheit. Alginat ist ein lineares Polysaccharid Copolymer aus α-L-Guluronsäure (G) und β-D-Mannuronsäure (M). Bereiche mit sich wiederholenden G Monomeren, genannt &quot;G-Blöcke&quot;, sind vernetzt, um ein Hydrogel, in Gegenwart von zweiwertigen Calcium-Ionen bilden. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2b.jpg" alt="Abbildung 2b" /> Abbildung 2b. (Bi) Small eingekapselt Follikel Erfahrung niedrige Druckkraft in Alginat zu Beginn der Kultur. Allerdings ist die Follikel das verdrängte Volumen in der Perle erweitert zunimmt, die in größeren Druckkraft in die entgegengesetzte Richtung des Follikel-Erweiterung (b-ii) Ergebnisse. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2c.jpg" alt="Abbildung 2c" /> Abbildung 2c. Die Ketten der einzelnen Polymere sind völlig verstrickt in das Fibrin-Alginat-Lösung vor Quervernetzung. Beide Komponenten des FA-IPN sofort anfangen zu vernetzen, wie sie zu der Mischung von Thrombin und Calcium ausgesetzt sind. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3a.jpg" alt="Abbildung 3a" /> Abbildung 3a. Flussdiagramm für Follikel Isolierung und Verkapselung in einem FA-IPN. Sekundäre Follikel sind von einer 16-Tage alten Maus (Ai) isoliert. Die Fortpflanzungsorgane sind seziert (A-ii) und isolierten Follikel werden, um ein Gericht mit Wartungs-Medien (A-iii) übertragen. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3b.jpg" alt="Abbildung 3b" /> Abbildung 3b Die Drop-Methode für Follikel Verkapselung in Fibrinogen Alginatlösung (B: i-iv).. Zwei Tropfen von Fibrinogen-Alginat-Lösung sind die Spül-drop (10 l) und die Kapselung Tropfen (90 ul) in die Schüssel (Bi) pipettiert. Nächsten 3-5 Follikel zu einem Spülen Drop (B-ii) übertragen. Nach dem Spülen und Medien Entfernung sind Follikel auf die Verkapselung Drop (B-iii) übertragen. Jeder Follikel ist mit 5 ul Fibrinogen-Alginat-Lösung mit einem 10 ul Pipettenspitze angesaugt und dann ausgewiesen in Thrombin / Calcium-Lösung (B-iv). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3c.jpg" alt="Abbildung 3c" /> Abbildung 3c. Die Perle Vernetzungen für 5 Minuten. Der Parafilm Methode zur Kapselung Follikel in Fibrinogen Alginatlösung (C: I-III). Fibrinogen-Alginat-Lösung (7,5 ul) ist auf dem Parafilm beschichteten Objektträger pipettiert und Follikel sind individuell auf jeden Tropfen übertragen nach dem Spülen (Ci, ii). Thrombin-Lösung (7,5 ul) ist zu jedem Tropfen (C-iii) aufgenommen. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3d_e.jpg" alt="Abbildung 3d-e" /> Abbildung 3d - e. Die Tropfen werden mit einem zweiten Parafilm beschichteten Objektträger abgedeckt und die FA-IPN ist in den Inkubator für 5 Minuten vernetzt. (D) Die gekapselten Follikel zum Wachstum Medien in einer 96-Well-Platte übertragen. (E) Ein Bild von einem gekapselten Follikel in der FA-IPN (weißer Pfeil). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Fibrin Abbau durch den wachsenden Follicle. Follikel degradieren das Fibrin des FA-IPN während der Anzucht, die durch eine klare Kreis um die Follikel nachgewiesen wird. Der Follikel ist 3D-Architektur wird durch die restlichen Alginat unterstützt. Am Tag 0 (D0) das Fibrin noch intakt ist und die Matrix um die Follikel ist bewölkt, nach 1 Tag in Kultur (D1) die klare Ring um die Follikel erscheint (weißer Pfeil) und die Fibrinabbauprodukten vorne weiterhin radial am Tag zu erweitern 2 (D2) und Tag 4 (D4) der Kultur. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Bilder von Follikelwachstum. Repräsentative Bilder ofsecondary Follikelwachstum in der FA-IPN am Tag 0 (A), 4 (B), 6 (C) und 8 (D) der Kultur. Nach 8 Tagen wurden Antralfollikeln in vitro gereift, und die daraus resultierenden MII-Oozyten Bühne gezeigt werden (E, die Polkörper mit schwarzer Pfeil). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Fibrin Degradation wurde durch Aprotinin gehemmt. Wachsenden Follikel am Tag 2, 4, 10 und 12 sind in der ersten Zeile angezeigt. Aprotinin in Konzentrationen 0,01 TIU / mL (zweite Reihe) und 0,1 TIU / mL wurde das Kulturmedium an den Tagen 0, 2 und 4 aufgenommen. Nur Follikel Kulturen mit 0,01 TIU / mL Aprotinin degradiert das Fibrin nach Aprotinin Entfernung und erreicht antral Bühne. Follikel in 0,1 kultiviert TIU / mL Aprotinin nicht in der FA-IPN wachsen. <table border="1"><tbody><tr><td> Abkürzung </td><td> Vollständiger Name </td></tr><tr><td> CO 2-Inkubator </td><td> 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 </td></tr><tr><td> COC </td><td> Cumulus Oozyten-Komplex </td></tr><tr><td> 3D </td><td> 3-dimensionale </td></tr><tr><td> DM </td><td> Dissection Medien </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Epidermal Growth Factor </td></tr><tr><td> FA-IPN </td><td> Fibrin-Alginat durchdringendes Netzwerk </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Fetal Bovine Serum </td></tr><tr><td> GM </td><td> Nährmedien </td></tr><tr><td> GV </td><td> Keimbläschen </td></tr><tr><td> hCG </td><td> Humanes Choriongonadotropin </td></tr><tr><td> ITS </td><td> Insulin Transferrin Selen ergänzen </td></tr><tr><td> IVF Gericht </td><td> Zentrum und 60 mm in-vitro-Fertilisation Gericht </td></tr><tr><td> MM </td><td> Wartung Medien </td></tr><tr><td> MII Bühne Eizelle </td><td> Metaphase II Stadium Eizelle </td></tr><tr><td> rFSH </td><td> Rekombinante Follicular Hormon </td></tr><tr><td> TBS </td><td> Tris-gepufferter Kochsalzlösung </td></tr><tr><td> TIU </td><td> Trypsin hemmenden Einheiten </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Abkürzungen

<ol>
	<li>Cortvrindt, R., Smitz, J., VanSteirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+maturation,+fertilization+and+embryo+development+of+immature+oocytes+from+early+preantral+follicles+from+prepuberal+mice+in+a+simplified+culture+system.">In-vitro maturation, fertilization and embryo development of immature oocytes from early preantral follicles from prepuberal mice in a simplified culture system.</a> Human Reproduction. 11, 2656-2666 (1996).</li><li>Smitz, J., Cortvrindt, R., Hu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+combined+with+recombinant+human+chorionic+gonadotrophin+improves+meiotic+progression+in+mouse+follicle-enclosed+oocyte+culture.">Epidermal growth factor combined with recombinant human chorionic gonadotrophin improves meiotic progression in mouse follicle-enclosed oocyte culture.</a> Human Reproduction. 13, 664-669 (1998).</li><li>Xu, M., Banc, A., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+Follicle+Growth+and+Oocyte+Maturation+by+Culture+in+Alginate+Hydrogel+Following+Cryopreservation+of+the+Ovary+or+Individual+Follicles.">Secondary Follicle Growth and Oocyte Maturation by Culture in Alginate Hydrogel Following Cryopreservation of the Ovary or Individual Follicles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103, 378-386 (2009).</li><li>Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+achievements+and+future+research+directions+in+ovarian+tissue+culture,+in+vitro+follicle+development+and+transplantation:+implications+for+fertility+preservation.">Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation.</a> Human Reproduction Update. 16, 395-414 (2010).</li><li>Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpenetrating+fibrin-alginate+matrices+for+in+vitro+ovarian+follicle+development.">Interpenetrating fibrin-alginate matrices for in vitro ovarian follicle development.</a> Biomaterials. 30, 5476-5485 (2009).</li><li>West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+properties+of+alginate+hydrogels+and+their+effects+on+in+vitro+follicle+development.">Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development.</a> Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).</li><li>Kreeger, P. K., Fernandes, N. N., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mouse+follicle+development+by+follicle-stimulating+hormone+in+a+three-dimensional+in+vitro+culture+system+is+dependent+on+follicle+stage+and+dose.">Regulation of mouse follicle development by follicle-stimulating hormone in a three-dimensional in vitro culture system is dependent on follicle stage and dose.</a> Biology of Reproduction. 73, 942-950 (2005).</li><li>Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+for+the+three-dimensional+culture+of+granulosa+cell-oocyte+complexes.">Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes.</a> Tissue Engineering. 9, 1013-1021 (2003).</li><li>Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+stage-specific+permissive+in+vitro+culture+environment+for+follicle+growth+and+oocyte+development.">Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development.</a> Biology of Reproduction. 75, 916-923 (2006).</li><li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulated+Three-Dimensional+Culture+Supports+Development+of+Nonhuman+Primate+Secondary+Follicles.">Encapsulated Three-Dimensional Culture Supports Development of Nonhuman Primate Secondary Follicles.</a> Biology of Reproduction. 81, 587-594 (2009).</li><li>West, E. R., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+follicle+micro+environment.">Engineering the follicle micro environment.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25, 287-299 (2007).</li><li>Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+follicles+produce+live,+fertile+offspring.">Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.</a> Tissue Engineering. 12, 2739-2746 (2006).</li><li>Ebisch, I. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+role+of+the+plasminogen+activator+system+and+vascular+endothelial+growth+factor+in+subfertility.">Review of the role of the plasminogen activator system and vascular endothelial growth factor in subfertility.</a> Fertility and Sterility. 90, 2340-2350 (2008).</li></ol>

Die vorgestellten Ovarialfollikel Verkapselungsmethode in einem FA-IPN ermöglicht Follikel Kultur in einer 3D-Umgebung in vitro. Ein FA-IPN ist ein dynamisches, Zell-responsive Matrix, in der die ersten mechanischen Eigenschaften durch die Kombination der beiden Fibrin und Alginat bestimmt werden. Während der Kultur, aktiviert die gekapselte Follikel Proteasen, die nur eine Komponente des IPN, das Fibrin, das in einer allmählich abnehmenden Gel Steifigkeit, die ausschließlich durch die restlichen Alginat am...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fetuin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>F3385</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen, Gibco</td>
<td>10082-139</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aprotinin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>10236624001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wako</td>
<td>039-00475</td>
<td>40 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A412</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>rFSH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A.F. Parlow, National Hormone and Peptide Program, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>hCG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CG-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A1603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ITS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I1884-1VL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;MEM+Gluta MAX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>32561</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen-Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>30-002-CI</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pierce</td>
<td>28379</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tisseel Fibrin kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>921030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Alginate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FMC BioPolymers</td>
<td>LF200DL</td>
<td>Mw 418kDa</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
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a method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3 dimensional system

Die Ovarialfollikel ist die funktionelle Einheit des Eierstocks, dass Sexualhormone absondert und unterstützt Eizellreifung. In-vitro-Follikel-Techniken bieten ein Werkzeug zur Modellierung Follikelentwicklung, um Grundlagen der Biologie zu untersuchen, und werden weiter als eine Technik, um die Fruchtbarkeit in der Erhaltung entwickelt Klinik 1-4. Unsere in vitro-Kultur-System nutzt Hydrogele, um die einheimischen Eierstock-Umgebung durch die Beibehaltung des 3D-follikuläre Architektur, Zell-Zell-Interaktionen und parakrine signalisiert, dass direkte Follikel Entwicklung 5 zu imitieren. Bisher wurden Follikel erfolgreich in Alginat, einem inerten Algen gewonnene Polysaccharid, dass die Gelbildung unterzogen mit Calciumionen 6-8 kultiviert. Alginat-Hydrogele in einer Konzentration von 0,25% w / v gebildet waren die permissive für Follikel Kultur, und behielt die höchste Entwicklungskompetenz 9. Alginat-Hydrogele sind nicht abbaubar und somit eine Erhöhung der Follikel Durchmesser ergibt sich eine Druckkraft auf die Follikel, Follikel Wachstum 10 auswirken können. Wir Folge entwickelte eine Kultur, das auf einem Fibrin-Alginat durchdringendes Netzwerk (FA-IPN), in dem eine Mischung aus Fibrin und Alginat gleichzeitig gelierte basiert. Diese Kombination bietet eine dynamische mechanische Umwelt, weil beide Komponenten Matrix Steifigkeit beitragen zunächst, allerdings verschlechtern Proteasen, die durch den wachsenden Follikel sezerniert Fibrin in der Matrix so dass nur Alginat zu unterstützen. Mit dem IPN, kann das Alginat-Gehalt unter 0,25%, was nicht mit Alginat allein 5 möglich reduziert werden. So, wie die Follikel erweitert, wird sie erleben eine reduzierte Druckkraft aufgrund der geringeren Feststoffgehalt. Hier beschreiben wir eine Kapselung Verfahren und eine in-vitro-Kultur-System für Eibläschen in einem FA-IPN. Die dynamisch-mechanischen Umfeld ahmt die natürliche Eierstock-Umfeld, in dem kleine Follikel in eine starre Kortex befinden und bewegen, um eine permissive Medulla als sie erhöhen in Größe 11. Die abbaubaren Komponente kann als besonders kritisch für die klinische Übersetzung, um die größer als 10 6-fachen Anstieg des Volumens, dass die menschliche Follikel in der Regel durchlaufen in vivo zu unterstützen.

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A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

Eine neue Methode zur Ovarialfollikel Kapselung in einer 3D-Fibrin-Alginat durchdringendes Netzwerk beschrieben. Dieses System kombiniert strukturelle Unterstützung mit proteolytischen Abbau der Entwicklung von unreifen Follikeln Unterstützung, um zu reifen Eizellen zu produzieren. Diese Methode kann zur Kultur Zellaggregate angewendet werden, um Zell-Zell-Kontakte ohne Beschränkungen für die Ausweitung aufrecht zu erhalten.

Eine Methode zur Ovarialfollikel Encapsulation und Kultur in einem Proteolytisch Degradable 3 Dimensional-System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.2K Aufrufe.  Northwestern University. Eine neue Methode zur Ovarialfollikel Kapselung in einer 3D-Fibrin-Alginat durchdringendes Netzwerk beschrieben. Dieses System kombiniert strukturelle Unterstützung mit proteolytischen Abbau der Entwicklung von unreifen Follikeln Unterstützung, um zu reifen Eizellen zu produzieren. Diese Methode kann zur Kultur Zellaggregate angewendet werden, um Zell-Zell-Kontakte ohne Beschränkungen für die Ausweitung aufrecht zu erhalten.

Serie: A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotypische Collagen I Assay: A Temperguss Platform to Cell Verhalten in 3-Dimensional Kontext beurteilen

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Forschung

Biotechnik

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

Kultivierung humaner neuronaler Vorläuferzellen in einer 3-dimensionalen Self-Montage Peptide Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Eine neue Methode zur Lokalisierung Reporter fluoreszierende Kügelchen In der Nähe der Zellkulturoberfläche für Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Erzeugung eines dreidimensionalen Vollhaut Equivalent und automatisierte Verwundung

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as well as substance testing. These models are mostly cultivated in membrane-insert systems, their permeability toward different substances being an essential factor. Typically, applied methods for determination of these parameters usually require large sample sizes (e.g., Franz diffusion cell) or laborious equipment (e.g., fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)). This study presents a method for determining permeability coefficients directly in membrane-insert systems with diameter sizes of 4.26 mm and 12.2 mm (cultivation area). The method was validated with agarose and collagen gels as well as a collagen cell model representing skin models. The permeation processes of substances with different molecular sizes and permeation through different cell models (consisting of collagen gel, fibroblast, and HaCaT) were accurately described.
Moreover, to support the above experimental method, a simulation was established. The simulation fits the experimental data well for substances with small molecular size, up to 14 x 10-10 m Stokes radius (4,000 MW), and is therefore a promising tool to describe the system. Furthermore, the simulation can considerably reduce experimental efforts and is robust enough to be extended or adapted to more complex setups.

A method for determination of permeability in a membrane insert system for multi-well plates and in silico parameter optimization for the calculation of diffusion coefficients using simulation are presented.

Eine Methode zur Bestimmung und Simulation von Durchlässigkeit und Diffusion in einem 3D Gewebe-Modell in einer Membran einfügen System für Multi-well-Platten

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

Produktion von Elastin-Like Protein Hydrogele für Kapselung und Immunostaining Zellen in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

Hyaluronsäure basierte Hydrogele für 3-dimensionale Kultur des Patienten abgeleitet Glioblastom-Zellen

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low cell retention and poor survival within the target zone. However, during the in vitro construction process, a solution for maintaining stem cell bioactivity and increasing the cell amount within the cell sheet is urgently needed. Here, this protocol presents a method for constructing a multilayered cell sheet with favorable stem cell bioactivity and optimal operability. Decellularized porcine pericardium (DPP) is prepared by phospholipase A2 (PLA2) decellularization method as the cell sheet scaffold, and rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are isolated and expanded as the seeded cells. The temporary multilayered cell sheet structure is constructed by using RAD16-I peptide hydrogel. Finally, the cell sheet is cultured with a dynamic perfusion system to stabilize the three-dimensional (3D) structure, and the cell sheet could be obtained following a 48-hour culture in vitro. This protocol provides an efficient and feasible method for constructing a multilayered stem cell sheet, and the cell sheet could be developed as a favorable stem cell therapy product in the future.

This article provides an efficient and feasible method for constructing multilayered stem cell sheets with favorable stem cell property.

Bau eines vielschichtigen mesenchymale Stammzellen-Blatt mit einem 3D dynamische Kultursystem

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...