Die Finanzierung aus dem BBSRC wird freundlich quittiert (Förderkennzeichen BB H011293 / 1).

Überblick Abschnitt 1 beschreibt die Herstellung von pH-Wert reagieren Nanosensoren und Charakterisierung von Nanosensor Reaktion auf pH-Wert mit Fluoreszenzspektroskopie und ihrer Größe mit SEM. Abschnitt 2 beschreibt die Herstellung von elektroPolymerGerüsten und Charakterisierung von ihrer Morphologie und Größe mit SEM. Abschnitt 2 beschreibt auch die Herstellung von Selbstberichts Gerüste, die elektro Gerüste mit der Aufnahme der pH-Wert reagieren Nanosensoren sind. Die daraus resultierenden Selbstberichts Gerüste werden von SEM charakterisiert, um zu beurteilen, ob morphologische Veränderungen der elektrogesponnenen Fasern ist aufgetreten. Die Fluoreszenz von den Selbstberichts Gerüste aus den Nanosensoren eingearbeitet resultiert, wird durch konfokale Mikroskopie beurteilt. Abschnitt 3 beschreibt die Kultur der Zellen auf die elektro Gerüst und die Selbstberichts Schafott. Die Gerüste werden zunächst in preparat sterilisiertIonen für die Zellkultur, die die folgenden Gerüsten werden bewertet, um zu bestimmen, ob die Sterilisation und die Kultur von Zellen auf die Fluoreszenzfähigkeit der Selbstberichts Gerüsten. Das Protokoll beschreibt auch die Lieferung von Nanosensoren auf Zellen, die auf elektro Gerüste kultiviert werden. Lysotracker Farbstoff wird verwendet, um sicherzustellen, dass Nanosensoren nicht in die zellulären sauren Kompartimenten entnommen. 1. Herstellung und Analyse von pH Responsive Sol-Gel-Nanosensoren 1.1 Herstellung von pH Responsive Sol-Gel-Nanosensoren Hinweis: Diese Vorbereitung sollte in einem Abzug durchgeführt werden. <ol><li> Vorbereitung der Fluorophore zur Verwendung im pH-Nano durch Auflösen von 5 - (und-6)-Carboxyfluorescein, Succinimidylester (FAM-SE) (1,5 mg) in Dimethylformamid (DMF) (1 ml) in einem Rundkolben und 6-Carboxytetramethylrhodamin , Succinimidylester (TAMRA-SE) (1,5 mg) in DMF (1 ml) in einem anderen Rundkolben.In 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES) (1,5 ml) zu jedem Kolben und rühren unter einer trockenen Stickstoffatmosphäre (21 ° C) für 24 Stunden in der Dunkelheit dh wickeln die Proben in Folie. </li><li> Alle beide der obigen Farbstoffe (250 ul) zu einer Mischung von Ethanol (6 ml) und Ammoniumhydroxid (30 Gew.%, 4 ml) in einem Rundkolben enthalten und rühre 1 Stunde (21 ° C). </li><li> Langsam Tetraethylorthosilikat (TEOS) (0,5 ml) zu dem Gemisch, weiterhin zugegeben und für weitere 2 Stunden. Die Mischung wird trüb. Die Nanosensoren können durch Rotationsverdampfung gesammelt werden. Nanosensoren können in einem Glasfläschchen bei 4 º C zur weiteren Verwendung gelagert werden. ACHTUNG: die weitere Handhabung der Nanosensoren in ihrer trockenen Form sollte in einem Abzug oder im Fall der Verwiegung, die Balance sollte beigefügt werden, zum Beispiel in einem Weighsafe durchgeführt werden. </li></ol> 1.2 Nanosensor Antwort auf pH <ol><li> Bereiten Sørensen Phosphatpufferlösungen von pH 5,5 bis 8,0 von mixing spezifische Verhältnisse von Mononatriumphosphat (0,2 M) und Natriumhydrogenphosphat (0,2 M) stock-Lösungen. Überprüfen Sie die endgültige pH-Wert mit einem pH-Meter. Machen keine geringfügige Anpassungen der pH-Wert mit Natriumhydroxid (NaOH) (4 M) oder Salzsäure (HCl) (2 M). </li><li> Hängen Sie das pH-Nanosensoren in den pH-Puffer (5 mg / ml), indem zunächst die Haltegefäß, das die Nanosensor-Lösung auf einem Vortex 3 min dann das Eintauchen des Schiffes in einem Ultraschallgerät, bis die Lösung trüb wird (ca. 5 min). Wiederholen Sie diese Schritte, um die Nanosensoren in Lösung vollständig auszusetzen. </li><li> Legen Sie die erste Lösung in einem optischen Küvette und verwenden Anregungswellenlängen von 488 nm für 5 - (und-6)-Carboxy-(FAM) und 568 nm für 6-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA). Sammeln Sie die Emissionswellenlängen bei 500 bis 530 nm für FAM und 558-580 nm für TAMRA mit einem Fluoreszenz-Spektrometer. </li><li> Ändern der Lösungen in der optischen Küvette, so daß der pH-Wert kann bei unterschiedlichen pH beobachtet werden und weiterhin collecting die Emissionsspektren. </li><li> Berechnen des Verhältnisses der bei jedem pH-Wert erzeugt, um eine Kalibrierungskurve zu erzeugen Emissionsmaxima. </li></ol> 1.3 SEM von Nanosensoren <ol><li> Legen Sie eine Probe der Nanosensoren auf eine Kohlenstoff beschichtet Elektronenmikroskop Stub-und Sputter-Mantel mit Gold für 5 min unter Argonatmosphäre. </li><li> Beobachten durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM). Während der Bilderzeugung einzustellen den Arbeitsabstand, Spannung und Vergrößerung der Elektronenladung (1) zu minimieren. </li></ol> 2. Herstellung und Analyse von PLGA Scaffolds 2.1 Das Elektro PLGA Scaffolds <ol><li> In einer Abzugshaube lösen Poly (milch-co-glykolsäure) (PLGA) in Dichlormethan (DCM) (20% (w / w)) mit Pyridinium-Formiat (PF) (1% (w / w)). Platzieren der Lösung in einen 10-ml-Spritze mit einer 18 G Nadel stumpf Füllung und sicheren Sitz mit einer Spritzenpumpe. </li><li> Entfernung der Nadelspitze 20 cm von einem 20cm x 15 cm Aluminium-Sammelplatte. </li><li> Befestigen der Elektrode von einer Hochspannungsstromversorgung mit der Spitze der Spritze und der Erde, um die Aluminiumsammelplatte. VORSICHT: Achten Sie darauf, wie Hochspannung wird verwendet, dh immer schalten die Stromversorgung aus, bevor Umgang mit einem der Elektrogeräte werden. </li><li> Geben Sie sich die Lösung unter Verwendung eines konstanten Fließgeschwindigkeit von 3,5 m / h bei 12 kV für 2 Stunden. Elektrospinning mit diesen Bedingungen geben ein Gerüst Tiefe von etwa 60 um. </li><li> Lassen Sie das Gerüst in einem Abzug für 24 Stunden, damit Lösungsmittelreste zu verdampfen. </li></ol> 2.2 Das Elektro pH Responsive PLGA Scaffolds <ol><li> Bereiten Gerüste Einbeziehung pH-Wert reagieren Nanosensoren wie in Abschnitt 2.1, aber mit der Modifikation, dass Nanosensoren zur Polymerlösung (5 mg / ml) beschrieben. Suspend die Nanosensoren in der PLGA-Lösung mit Hilfe der Ultraschallbehandlung (ca. 5 min) vor<html> dem Platzieren in einen 10-ml-Spritze. </li></ol> 2.3 SEM von PLGA Gerüst-und pH-Responsive Gerüst <ol><li> Legen Sie eine Probe des PLGA-Gerüst-oder pH-Gerüst reagiert auf eine Kohlenstoff beschichtet Elektronenmikroskop Stub und gehen Sie wie bei SEM von Nanosensoren (Abbildung 1) beschrieben. </li></ol> 2.4 Kalibrierung von pH Responsive Gerüst <ol><li> Legen Sie eine Probe der pH-Wert reagieren Gerüst in eine 35 mm Kulturplatte und tauchen in geeigneten Pufferlösungen. </li><li> Auf einem konfokalen Mikroskop mit einem 488 nm Argon-Laser, um die FAM und einem 568 nm Krypton-Laser, die in den Nanosensoren TAMRA erregen erregt. Beachten Sie die Fluoreszenzemission für pH reagiert Gerüste bei 500-530 nm für FAM und 558-580 nm für TAMRA. (Abbildung 2). Verwenden sequentielle Scannen Sammlung von Anregungswellenlängen zu vermeiden. </li></ol> 3. Zellkultur auf PLGA Scaffolds und pH-Responsive PLGA Scaffolds ntent &quot;&gt; Hinweis: Die folgende Beschreibung ist in einem Zellkulturschrank durchgeführt werden. 3.1 Herstellung von PLGA Scaffolds für die Zellkultur <ol><li> Schneiden Sie die PLGA-oder pH-Wert reagieren PLGA Scaffolds in 2 cm 2 Stück. </li><li> Sterilisieren Gerüste durch Bestrahlen mit ultraviolettem Licht (UV) in einem Abstand von 8 cm für 15 min auf jeder Seite. </li><li> Übertragen Sie die Gerüste zu einer 12-Well-Kulturplatte und legen Sie eine Stahlring an der Spitze. Eine Lösung von Penicillin / Streptomycin (5% v / v) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf der Innenseite und der Außenseite des Stahlrings, über Nacht inkubiert (37 ° C, 5% CO 2). Hinweis der Stahlring wurde an der Universität von Nottingham hergestellt und hat folgende Abmessungen: Außendurchmesser 2 cm, 1 cm Innendurchmesser von 1 cm Tiefe. </li><li> Entfernen Sie die Sterilisationslösung und waschen mit PBS. </li><li> Hinzufügen Zellkulturmedien auf die Innenseite (500 ul) und außerhalb (500 ul) des Stahlrings, in einem Inkubator (37 ° C, 5% CO 2 </sub&gt;) während der Vorbereitung einer Zellsuspension. </li><li> Bereiten Sie eine Zellsuspension und führen Sie eine Zellzahl mit einer Trypanblau-Ausschluss-Assay. </li><li> Erstellen einer Zellsuspension bis zu einer Zellzahl von 1 x 10 6 Zellen / ml zu erreichen. </li><li> Entfernen Medien von der Innenseite und Außenseite des Stahlrings. </li><li> Ersetzen mit vorgewärmtem Zellkulturmedium auf der Außenseite des Stahlrings (1 m). </li><li> In 300 ul der Zellsuspension auf der Innenseite der Stahlring - Felsplatte hin und her vorsichtig, um Zellen zu verteilen. </li><li> Setzen Sie den Zellkulturplatte in einen Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) - sollte die Zellhaftung innerhalb von 24 Stunden genommen haben, aber Kultur weiterhin so lange wie das Experiment erfordert - erfrischend die Medien alle 2-3 Tage. </li></ol> 3.2 Nanosensor Lieferung Cells auf PLGA-Gerüst kultiviert <ol><li> Seed Zellen auf PLGA-Gerüst, wie in Abschnitt 3.1 beschrieben. Für diese Studie eine leere PLGA-Gerüst (nicht Containing Nanosensoren) wurde aufgrund der Überlappung der Fluoreszenzemission verwendet bei der Abbildung. </li><li> Küvette ausgesät Gerüst in einen Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für 72 Stunden, damit die Zellen wachsen und in dem Gerüst vor der Auslieferung Nano migrieren. </li><li> Vor der Auslieferung Nanosensor (37 ° C, 5% CO 2) Waschen Sie die Zellen mit PBS und ändern Sie das Medium aus Standard-Kulturmedien Antibiotika und Serum-freie Medien, Inkubation für 1 Stunde. Hinweis: Standardkulturmedien für 3T3-Zellen besteht aus Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium mit fötalem Kälberserum (10% (v / v)), L-Glutamin-Lösung (2 mM), Penicillin / Streptomycin (1% (v / v)) . </li><li> Während der Inkubationszeit bereiten die Nanosensor-Liposom-Komplex durch kurzes Beschallen Nanosensoren (5 mg) mit Optimem (50 ul) der Lösung A erstellen </li><li> Lösung B erstellen, indem Lipofectamine 2000 (5 ul) zu Optimem (45 ul), Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> In LösungA zu Lösung B, Inkubation bei Raumtemperatur für 20 min Lösung C, die der Nanosensor-Liposom-Komplex zu bilden. </li><li> Lösung C (100 ul) zu den Zellen und inkubiert (37 ° C, 5% CO 2) für 3 Stunden. </li><li> Entfernen Sie die Zelle ausgesät Gerüste aus dem Inkubator, absaugen Medien und zweimal waschen mit PBS, bevor PBS (1 ml), um Live-Cell-Visualisierung durch konfokale Mikroskopie zu ermöglichen. Hinweis: PBS wurde in diesem Protokoll verwendet, so daß der Indikator Phenolrot in Zellkulturmedium nicht vorhanden Autofluoreszenz verursachen und auch, weil eine Kalibrierung bei verschiedenen pH-Wert durchgeführt wird. Allerdings könnte Phenolrot freien Medien für längerfristige Analyse von Zellkulturen verwendet werden. </li><li> Tauchen der Zelle seeded Gerüst in Puffern mit unterschiedlichen pH-und überwacht die Reaktion der Nano mit den Zellen verbunden. </li><li> Überwachen Sie die pHi durch Bestimmung des Verhältnisses der Fluoreszenzintensitäten von FAM und TAMRA durch Beobachtung Fluoreszenz mittels konfokaler Mikroskopie (Figure 3). </li></ol> 3.3 Nanosensor Lage im Säugetierzellen <ol><li> Inkubieren Zellen mit Nanosensoren, die nur die, wie in Abschnitt 3.2 beschrieben FAM-Farbstoff (das ist, weil die Fluoreszenzemission von TAMRA ist in der gleichen Region wie die LysoTracker Rot). Bereiten Sie diese Nanosensoren wie in Abschnitt 1.1, aber mit dem Wegfall der Vorbereitung und Zugabe TAMRA beschrieben. </li><li> Nach der Nanosensor Lieferfrist verdünnen LysoTracker Red-Stammlösung zu 50 nM. </li><li> In einen aliquoten Teil des verdünnten Lösung (2 ul), um Zellen auf PLGA Scaffolds kultiviert. </li><li> Inkubieren der Zellen mit LysoTracker Red 1 h (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Nach der Inkubationsperiode entfernen Medien und wasche die Zellen zweimal mit PBS (pH 7,4) vor dem Wechsel der Medien zu PBS (pH 7,4) (2 ml) in Vorbereitung für die Anzeige mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Hinweis: Phenolrot freien Medien könnte anstelle von PBS verwendet werden. </li><li> Fügen Sie die Kernfärbung Draq5 zum PBS so die Endkonzentration 5 &amp;mgr; M und Inkubation mit den Zellen für 3 min (37 ° C 5% CO 2). Es ist nicht notwendig, um die Medien nach der Inkubationszeit mit DRAQ5 ändern. </li><li> Verwenden Sie einen 488-nm-Argon-Laser, um die FAM nur Nanosensoren anzuregen, eine 568 nm Krypton-Laser, um die LysoTracker Rote und 633 nm Helium / Neon-Laser zu erregen, um die DRAQ5 Chromophor begeistern und zu beobachten Fluoreszenz bei 500-530 nm, 580 bis 600 nm, 650 -750 Nm (Abbildung 3). Verwenden sequentielle Scannen Sammlung von Anregungswellenlängen zu vermeiden. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Tissue Engineering strebt biologischen Ersatz zu schaffen, die sowohl in vivo wie in vitro Gewebemodellen und in Gewebeersatztherapie verwendet werden können, um zu reparieren, zu ersetzen, aufrecht zu erhalten oder zu verbessern die Funktion eines bestimmten Gewebe oder Organ. Synthetische Ersatzstoffe verwendet wurden, für viele Jahre zu Hilfe Reparatur von Gewebe zu ersetzen oder aber diese oft nicht aufgrund der schlechten Integration in das Wirtsgewebe und / oder Infektion, die letztlich zu Able...

Eine Schlüsselstrategie im Tissue Engineering ist die Verwendung von biokompatiblen Materialien, um Gerüste, deren Morphologie ähnelt das Gewebe, es geht zu ersetzen und ist auch in der Lage ist das Zellwachstum und Funktion 1,2 herzustellen. Das Gerüst mechanischen Halt, indem die Zellhaftung und Proliferation ermöglicht Zellmigration noch in den Zwischenräumen eines 3D-Zellkonstrukt. Das Gerüst muss auch für den Massentransport von Zelle Nährstoffe zu ermöglichen und Abtransport von Stoffwechsel 3 nicht hemmen. Elektro wurde als vielversprechendes Verfahren zur Herstellung von polymeren Gerüsten in der Lage ist das Zellwachstum 4-6 entstanden. Die hergestellten Vlieselektrogesponnenen Fasern sind für das Zellwachstum, wie sie sind oft porös und ermöglichen Zell-Zell-Wechselwirkung als auch die Zellmigration in den Zwischenräumen eines 3D-Zellkonstrukt 7. Es ist wichtig, die Lebensfähigkeit der Zellen während t überwachener Kulturperiode und diese Zelllebensfähigkeit zu gewährleisten ist in der gesamten 3D-Konstrukt erhalten. Beispielsweise Kulturbedingungen, wie beispielsweise Sauerstoff und pH erfordern eine sorgfältige Kontrolle, wie Gradienten in Analytkonzentration innerhalb des 3D-Konstrukt vorhanden sind. Bioreaktoren oder Perfusions-Systeme eingesetzt werden, um in vivo-Bedingungen der interstitiellen Fluss und als Ergebnis Anstieg Nährstofftransfer und Stoffwechselabfallbeseitigung 8 imitieren. Die Frage, ob solche Systeme eine konstante Mikroumgebungsbedingungen, kann durch die Beurteilung der zellulären Mikroumgebung in Echtzeit behandelt werden. Schlüssel Mikro Metriken, die in Echtzeit überwacht werden könnten, umfassen: Temperatur, chemische Zusammensetzung der Zellmedien, die Konzentration von gelöstem Sauerstoff und Kohlendioxid, pH-Wert und Feuchtigkeit. Von diesen Messdaten kann die Temperatur am leichtesten überwacht werden unter Verwendung von in situ-Sonden. Methoden für die Überwachung der übrigen aufgeführten Kennzahlen häufig involve Entfernung eines aliquoten für die Probenahme und deshalb stören die Zellkultur und das Kontaminationsrisiko zu erhöhen. Kontinuierliche Echtzeit-Methoden werden gesucht. Aktuelle Überwachungsmethoden der Regel verlassen sich auf Instrumente, die körperlich untersuchen die zelluläre Konstrukt wie einem pH-Monitor oder Sauerstoffsonde. Allerdings können diese invasiven Methoden der zellulären Konstrukt schädigen und stören den laufenden Experiments. Nichtinvasive Überwachung des Analyt-Konzentrationen in der 3D-Konstrukt konnte die Echtzeitüberwachung von verschiedenen Umweltaspekte wie Nährstoffverarmung 9 zu ermöglichen. Dies würde Beurteilung der Nährstoffzufuhr in tiefere Regionen innerhalb der Struktur zu ermöglichen und zu bestimmen, ob Stoffwechselschlacken wurde effektiv 10,11 entfernt. Systeme, die mit der Frage der Invasivität ehen versuchen im allgemeinen die Verwendung eines Durchblutung Kammer, die Kulturmedium sowohl durch das Kulturgefäß und an externe Sensoren geht auf pH-Wert, Sauerstoff-und Glukose-Monitor 12. DieRe ist ein zunehmendes Interesse an der Entwicklung Sensoren, die direkt in das Kulturgefäß, das keine Entfernung eines Aliquots zum Abtasten erfordern und als solche in-situ-Überwachung vorsehen würde integriert werden können. Um solche Mängel zu adressieren in situ und nichtinvasive Überwachung des Mikroumgebungsbedingungen haben wir Analyten reagiert Nanosensoren in die elektro Gerüste eingebaut, um Selbst-Berichterstattung Gerüste 13 zu produzieren. Leitschienen, die als Sensoren wirken durch Überwachen Fluoreszenzaktivität vorher hergestellt worden ist, wobei die Erfassungsvorrichtung entweder die tatsächlichen Polymergerüst die durch Elektrospinnen oder durch den Einsatz eines Analyten ansprechenden Farbstoff, der in das Polymer vor der Gerüstbildung 14,15 aufgenommen wird . Allerdings haben diese Messvorrichtungen das Potenzial, fehlerhafte optische Ausgänge durch mögliche Störungen von anderen Analyten verursacht zu geben. Die Verwendung eines ratiometrischen Erfassungseinrichtung such wie in dem beschriebenen Protokoll hergestellt hält das Potential, diese mögliche Nebenwirkungen zu beseitigen und eine Antwort für den Analyten spezifisch in Frage. Die hier vorgestellten elektro Gerüste wurden aus dem synthetischen Copolymers Poly (milch-co-Glykolsäure) (PLGA) erstellt wurde, durch ausgewählte, die Food and Drug Administration (FDA) die Genehmigung, die aufgrund ihrer biologischen Abbaubarkeit und Biokompatibilität und eine Spur Rekord, das Wachstum und die Funktion der verschiedenen Zelltypen 16-18. Die vorbereiteten ratiometrischen Analyt reagiert Nanosensoren reagieren auf pH-Wert. Die Nanosensoren sind mit zwei Fluoreszenzfarbstoffe in ein Sol-Gel biokompatiblen Matrix, einen Farbstoff, FAM ist in Reaktion auf pH-Wert und die andere wirkt TAMRA als interner Standard, da es nicht in Reaktion auf pH-Wert. Ferner die Fluoreszenz sowohl des FAM und TAMRA separat analysiert, da sie nicht wesentlich überlappen. Bestimmung des Verhältnisses der Fluoreszenz EMISsion beider Farbstoffe bei bestimmten Wellenlängen einen pH-Antwort unabhängig von anderen Umgebungsbedingungen. Die selbst Berichterstattung Gerüste könnten Wiederholungs Beurteilung der pH-Wert in situ und in Echtzeit ermöglichen, ohne dass der entwickelte 3D-Modell. Wir haben gezeigt, dass diese Gerüste sind in der Lage ist die Zellhaftung und-proliferation und weiterhin in Reaktion auf den Analyten in Frage. Die Kinetik der sauren Nebenprodukte in Konstrukte bleibt under und als solche mit den pH anspricht Gerüste könnte erheblich erleichtert diese Untersuchungen 19. Darüber hinaus stellt die Verwendung der Selbstberichts Gerüste für Tissue-Engineering-Anwendungen die Möglichkeit, vollständig zu verstehen, zu überwachen und optimieren das Wachstum von 3D-Modell in vitro Gewebekonstrukte, nicht-invasiv und in Echtzeit. Die pH-Nanosensoren reagieren auch auf die intrazelluläre Umgebung von Fibroblasten auf PLGA elektro Gerüsten kultiviert geliefert wordends. Das Verhältnis der Fluoreszenzemission von der Farbstoffe wurden verwendet, um pHi überwachen und im Vergleich zu einem Selbst-Berichterstattung Gerüst Einarbeiten pH Nanosensoren. Die Lieferung von Nano Zellen in einer 3D Umgebung kultiviert konnte Überwachung Analytkonzentration tief innerhalb des Konstrukts in einer zerstörungsfreien Art und Weise zu ermöglichen. Daher Nanosensoren kann eine tragfähige Imaging-Tool, um zerstörungsfrei beurteilen Zellverhalten im gesamten 3D-Konstrukte ermöglicht langfristige Analyse sein. Screening der Analytkonzentration von einzelnen Zellen in einer 3D-Konstrukt könnte sicherstellen, dass sie ausreichend mit Nährstoff-und Sauerstoffkonzentrationen. Überwachungsverfahrensparameter konnte bei der Entwicklung von standardisierten Techniken zur effektiven Massentransport von Sauerstoff und Nährstoffen zu unterstützen. Die Lieferung von Nanosensoren auf die intrazelluläre Umgebung und Einbau von Nanosensoren in polymere Gerüste könnten kombiniert werden, die Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen sowie Gerüst Leistung in 3D const ermöglichenructs während der Gewebewachstumsprozess. Dies kann zu mehr Wissen dieser Konstrukte führen und Fortschritte die Herstellung von biologisch relevanten Gewebeersatz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="481">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">32221</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Anhydrous dimethylformamide (DMF)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">270547</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution</td>
			<td style="width:71px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:137px;">35574</td>
			<td style="width:79px;">diluted to 30% (v/v) with pure water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">TEOS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">13190-3</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">A3648</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">C1311</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">C1171</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Sodium phosphate monobasic (0.2 M)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S-9638</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Sodium phosphate dibasic (0.2 M)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S-0876</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">NaOH</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S8045</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T4174</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">P0781</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D8537</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D6046</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Source Bioscience</td>
			<td style="width:137px;">Batch-213-101992</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G7513</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">11668-019</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Optimem</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">11058-021</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">LysoTracker Red</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">L-7528</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Draq5</td>
			<td style="width:71px;">Biostatus Ltd</td>
			<td style="width:137px;">DR50050</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Nitrogen gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">DCM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">320269</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">TFA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T6508</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="211">
			<td height="211" style="height:211px;width:195px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica TCS-SP</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;">equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">UV light</td>
			<td style="width:71px;">UVLS28 UVP, USA</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Stirrer plate</td>
			<td style="width:71px;">SB161-3 Jencons-PLS</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">pH meter</td>
			<td style="width:71px;">Jenway model 3510</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Rotary Evaporator</td>
			<td style="width:71px;">Buchi Rotary Evaporator R200</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Centrifuge (nanosensors)</td>
			<td style="width:71px;">Hermle Z300</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:195px;">Centrifuge (cell culture)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Vortex</td>
			<td style="width:71px;">Whirlimixer Fisherbrand</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Ultrasonicator</td>
			<td style="width:71px;">FB11021 Fisherbrand</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Aluminum sheet</td>
			<td style="width:71px;">Nottingham University</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">35mm cell culture plate</td>
			<td style="width:71px;">Iwaki</td>
			<td style="width:137px;">3000035</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:71px;">Becton Dickenson</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">3T3 Fibroblast cells</td>
			<td style="width:71px;">European Collection of Cell Cultures</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">PLGA</td>
			<td style="width:71px;">Lakeshore Biomaterials</td>
			<td>7525 DLG 7E</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Pyridinium formate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P8535</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-reporting scaffolds for 3-dimensional cell culture

Kultivieren von Zellen in 3D auf entsprechenden Gerüsten wird gedacht, um besser imitieren die In-vivo-Mikroumgebung und erhöhen die Zell-Zell-Interaktionen. Das resultierende 3D-Zellkonstrukt kann oft mehr relevant für die Untersuchung der molekularen Ereignisse und Zell-Zell-Interaktionen als vergleichbare Experimente untersucht in 2D. Um wirksam zu 3D-Kulturen mit hoher Zelllebensfähigkeit in der gesamten Gerüst erstellen die Kulturbedingungen, wie Sauerstoff und pH-Wert müssen sorgfältig wie Gradienten in Analyt-Konzentration gesteuert werden kann in der gesamten 3D-Konstrukt existieren. Hier beschreiben wir das Verfahren zur Herstellung von biokompatiblen pH anspricht Sol-Gel-Nanosensoren und deren Einbau in Poly (milchsäure-co-Glykolsäure) (PLGA) elektro Gerüste sowie deren anschließende Herstellung für die Kultur von Säugetierzellen. Die pH anspricht Gerüste können als Werkzeuge zur pH der Mikroumgebung innerhalb eines 3D-Zellkonstrukt bestimmen werden. Darüber hinaus haben wir ausführlich die Lieferung der pH-Wert reagieren nanosensors auf die intrazelluläre Umgebung von Säugerzellen, deren Wachstum durch elektro PLGA Gerüste unterstützt. Die zytoplasmatische Lokalisierung der pH anspricht Nanosensoren können verwendet werden, um intrazellulären pH (pHi) im laufenden Experimenten überwachen.

Die Größenverteilung der hergestellten pH-Wert reagieren Nanosensoren wurde mit SEM, wo die Bevölkerung von Nanosensoren abgebildet wurden gemessen und mit Nanometer-Dimensionen im Bereich von 240 bis 470 nm (Abbildung 1A) gekennzeichnet haben. Das Erreichen einer engen und relativ kleinen Durchmesser ist konsistent mit der Verwendung der Stöber-Methode, um Nanopartikel herzustellen. Es wurde festgestellt, dass mit einem basischen pH-Umgebung während der Synthese von Nanopartikeln, dh Nano...

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Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Biokompatiblen pH anspricht Sol-Gel-Nanosensoren können in Poly (milchsäure-co-Glykolsäure) (PLGA) elektro Gerüste eingebracht werden. Die hergestellten Selbstberichts Gerüste können für die in situ Überwachung von Mikroumgebungsbedingungen, während die Kultivierung von Zellen auf dem Gerüst verwendet werden. Dies ist vorteilhaft, da die 3D-Zellkonstrukt kann in Echtzeit, ohne den Versuch zu stören überwacht werden.

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

self-reporting-scaffolds-for-3-dimensional-cell-culture

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.1K Aufrufe.  University of Nottingham.  Biokompatiblen pH anspricht Sol-Gel-Nanosensoren können in Poly (milchsäure-co-Glykolsäure) (PLGA) elektro Gerüste eingebracht werden. Die hergestellten Selbstberichts Gerüste können für die in situ Überwachung von Mikroumgebungsbedingungen, während die Kultivierung von Zellen auf dem Gerüst verwendet werden. Dies ist vorteilhaft, da die 3D-Zellkonstrukt kann in Echtzeit, ohne den Versuch zu stören überwacht werden. 

Serie: Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

Elastomer-PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Forschung

Biotechnik

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Eine Methode zur Ovarialfollikel Encapsulation und Kultur in einem Proteolytisch Degradable 3 Dimensional-System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent shape upon the application of a stimulus such as heat1-5. In a typical shape memory cycle, the SMP is first deformed at an elevated temperature that is higher than its transition temperature, Ttrans [either the melting temperature (Tm) or the glass transition temperature (Tg)]. The deformation is elastic in nature and mainly leads to a reduction in conformational entropy of the constituent network chains (following the rubber elasticity theory). The deformed SMP is then cooled to a temperature below its Ttrans while maintaining the external strain or stress constant. During cooling, the material transitions to a more rigid state (semi-crystalline or glassy), which kinetically traps or "freezes" the material in this low-entropy state leading to macroscopic shape fixing. Shape recovery is triggered by continuously heating the material through Ttrans under a stress-free (unconstrained) condition. By allowing the network chains (with regained mobility) to relax to their thermodynamically favored, maximal-entropy state, the material changes from the temporary shape to the permanent shape.
Cells are capable of surveying the mechanical properties of their surrounding environment6. The mechanisms through which mechanical interactions between cells and their physical environment control cell behavior are areas of active research. Substrates of defined topography have emerged as powerful tools in the investigation of these mechanisms. Mesoscale, microscale, and nanoscale patterns of substrate topography have been shown to direct cell alignment, cell adhesion, and cell traction forces7-14. These findings have underscored the potential for substrate topography to control and assay the mechanical interactions between cells and their physical environment during cell culture, but the substrates used to date have generally been passive and could not be programmed to change significantly during culture. This physical stasis has limited the potential of topographic substrates to control cells in culture.
Here, active cell culture (ACC) SMP substrates are introduced that employ surface shape memory to provide programmed control of substrate topography and deformation. These substrates demonstrate the ability to transition from a temporary grooved topography to a second, nearly flat memorized topography. This change in topography can be used to control cell behavior under standard cell culture conditions.

A method for developing cell culture substrates with the ability to change topography during culture is described. The method makes use of smart materials known as shape memory polymers that have the ability to memorize a permanent shape. This concept is adaptable to a wide range of materials and applications.

Formgedächtnis-Polymere für Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotypische Collagen I Assay: A Temperguss Platform to Cell Verhalten in 3-Dimensional Kontext beurteilen

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

Rotierende Cell Culture Systems für Human Cell Culture: Human Trophoblastzellen als Modell

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

Erstellung von 3D-Fibrin-Gerüste für Stem Cell Culture Anwendungen

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

Kultivierung humaner neuronaler Vorläuferzellen in einer 3-dimensionalen Self-Montage Peptide Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

3D-Hydrogel Scaffolds für Articular Chondrozyten-Kultur und Knorpel-Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

Epithelialen Zellwiederbevölkerung und Herstellung von Nagetier extrazellulären Matrix Scaffolds für Nierengewebe Entwicklung

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

Synthese von biokompatiblen Liquid Crystal Elastomerschäume als Zellgerüste für 3D Spatial Zellkulturen

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...