Ein. Ziehen Glasmikropipetten Ausstattung: Feinpipettenziehvorrichtung, Microforge. Glass: Boroscillicate Glaskapillaren (~ 1,5 mm Außendurchmesser, ~ 1,4 mm Innendurchmesser). <ol><li> Mikropipetten gezogen werden über die gleichen grundlegenden Ansatz, der verwendet werden, um Glasmikroelektroden für die Elektrophysiologie Aufnahmen vorzubereiten. Kurz gesagt wird eine Glaskapillare in der Mitte erhitzt und wenn das Glas zu schmelzen beginnt die beiden Hälften der Kapillare auseinandergezogen Erzeugen zweier Mikropipetten. Mehrere kommerzielle Abzieher sind verfügbar, um diesen Vorgang im Bereich von relativ einfachen vertikalen Abzieher die Schwerkraft verwendet, um die zwei Pipetten auseinanderzuziehen, um hochentwickelte horizontalen Abzieher, der mehrere programmierbare Optionen, um die Geschwindigkeit und andere Parameter des Pull variieren bieten durchzuführen. Beide Arten von Abzieher wurden in unseren Experimenten verwendet. </li><li> Anforderungs für die Geometrie der Pipettenspitze: Die Spitzen der Pipetten in diesen Experimenten verwendet typischerweise im Bereich zwischen 2 bis 6 um Außendurchmesser in Abhängigkeit von der Größe der Zelle. Ein weiterer wichtiger Parameter ist die Form der Spitze, die sollte ungefähr ein zylindrisches Rohr (siehe Abbildung 1). Dies kann durch die Optimierung der Parameter der Pull und Verifizieren der Form der Spitze unter dem Mikroskop, bis die gewünschte Form erhalten wird erreicht werden. Die optimale Länge der Pipette Schaft hängt von der Menge der zu erwartenden Verformung: wenn die Deformationen klein &lt;10 um sind, ist es ausreichend, dass der zylinderartigen Teil der Pipette auch relativ kurze (der gleichen Größenordnung), für eine größere Verformungen entsprechend anpassen. Im allgemeinen Erhöhung der Wärme-und / oder Zunahme der &quot;Pull&quot; verringert sich der Durchmesser der Spitze. Die Erhöhung der &quot;Pull&quot; erzeugt auch eine Spitze mit einer längeren verjüngen. In unseren Experimenten unter Verwendung eines P-97 Sutter horizontalen Pipette Puller, war das Programmoptimiert, um die folgenden Parameter: Heat von 473; Pull 22; Velocity 22, Time 200; Druck 500. Es ist auch möglich, zylindrische Spitzen durch Ziehen eines sehr langem Schaft und dann Brechen und Polieren zu erzeugen. Detaillierte Anweisungen, wie die verschiedenen Arten von Pipetten Vorbereitung sind in der Sutter Handbuch. </li><li> Microforge: Es wird auch empfohlen, um Feuer-polieren die Spitze der Pipette auf eine glatte Glasoberfläche, die eine gute Abdichtung ist an der Plasmamembran zu generieren. Dies wird erreicht, indem die Spitze der Pipette in die Nähe einer erwärmten Glaskugel für eine sehr Bruchteil einer Sekunde unter Verwendung einer microforge getan. Ähnliche Technik wird routinemäßig zur Herstellung Mikroelektroden für elektrophysiologische Ableitungen verwendet. </li><li> Füllen der Mikropipette: Mikropipetten sollte mit einer physiologischen Kochsalzlösung, wie PBS oder nicht fluoreszierenden Wachstumsmedium gefüllt werden. Wichtig sollte die Lösung mit 30% Serum ergänzt werden, das Ihnen erlaubt die ZellmembranBrane für einen reibungslosen Übergang in die Pipette. Zwei Ansätze können verwendet werden, um loszuwerden Luftblasen in der Spitze der Pipette sind: (i) eine Spitze der Pipette in die Lösung eingetaucht werden erste, damit die Flüssigkeit um die Spitze durch die Kapillarkräfte durch die Verfüllung der Pipette gefolgt füllen vom anderen Ende oder (ii) die ganze Pipette kann vom hinteren Ende durch leichtes Klopfen auf den Schaft der Pipette, um die Blasen von der Spitze zu entfernen gefüllt werden. </li><li> Hinweis: Pipetten müssen am Tag des Experiments vorbereitet werden. </li></ol> 2. Herstellung von Zellen <ol><li> Aussäen der Zellen: Mikroaspiration wird an einzelnen Zellen, die entweder in Suspension gehalten werden oder auf das Substrat befestigt durchgeführt. Um Zellen in Suspension absaugen werden Zellen aus ihren Substraten angehoben und in eine flache pipettiert Längskammer, die auf dem umgekehrten Mikroskop rechts vor dem Experiment montiert ist. Um Substrat anhaftenden Zellen, Zellen absaugensind auf kleinen Deckel-Slips ausgesät (~ 10 mm Durchmesser), die ebenfalls in die Kammer kann Mikroaspiration vor dem Experiment abgegeben werden. Das Grundprinzip, um eine flache Längskammer benutzen ist, damit eine Mikropipette, um die Zellen in einem sehr flachen Winkel und so nahe wie möglich an Horizontalen nähert. Dies geschieht, um die Membran in die Mikropipette zu sein auf einem einzigen Fokusebene visualisiert (siehe Abbildung 2) gezogen zu ermöglichen. </li><li> Visualisieren Zellmembran: Um die Membran Vorsprung in die Pipette zu beobachten, sind zelluläre Membranen mit einem lipophilen Fluoreszenzfarbstoff wie DII Verwendung eines Standard Färbeprotokoll angefärbt. <ol type="i"><li> Warm PBS Lösung. </li><li> Verdünnen Sie die Lager DII auf eine Arbeitskonzentration (5 uM) mit dem erwärmten PBS Lösung. </li><li> Beschallen für 5 min auf Farbstoffaggregaten brechen. </li><li> Spin-Down für 5 min und nehmen Überstand. </li><li> Waschen der Zellen in PBS 3 mal, jeweils 5 min. </li><li> Inkubieren von Zellen mit dem Farbstoff soLösung für 30 min in einem 37 ° C Inkubator. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit PBS 3 mal für jeweils 5 min. </li></ol></li><li> Anmerkung: Es ist möglich, DII Färbung der Membran mit Sichtbarmachen des Sub-Membran Zytoskeletts, die ebenfalls zusammen mit der Membran in die Pipette gezogen ersetzen. Es muss in die Rechnung getragen werden jedoch, dass eine Störung des Zytoskeletts kann die biomechanischen Eigenschaften der Zelle verändern. Wenn darüber hinaus Durchführen Mikroaspiration Experimenten mit Substrat anhaftenden Zellen, ist es empfehlenswert, 3D-Bildgebung zu verwenden, um die Länge der Membran Vorsprung in die Pipette, die in einem Winkel zur Brennebene der Zellen positioniert ist, zu schätzen. </li></ol> 3. Mikroaspiration und Image Acquisition Ausstattung: Inverted Fluoreszenzmikroskop, vorzugsweise mit 3D-Dekonvolution Fähigkeiten (Zeiss Axiovert 200M mit computergesteuerten Z-Achsen-Bewegung des objektives oder gleichwertig); Videokamera an einen Computer angeschlossen (AxioCam MRm oder gleichwertig), Pressure Transducer (BioTek oder gleichwertig), Vibration-free-Station (TMD oder gleichwertig), Mikromanipulator (Narishige, Sutter, Burleigh oder gleichwertig; Manipulatoren kann mechanisch, hydraulisch oder piezoelektrisch). Es ist auch wichtig zu betonen, dass Mikroaspiration durchgeführt werden unter Verwendung eines Mikroskops ohne 3D-Funktionen, um die Steifigkeit von Zellen in Suspension, wie rote Blutkörperchen oder Neutrophile 1,2 3, getrennt Organellen, wie Kerne 4 oder künstlichen Liposomen 5 abzuschätzen. Image Acquisition Software: Zeiss AxioVision oder ein Äquivalent. <ol><li> Montieren der Zellen in eine Mikroaspiration Kammer, wie oben beschrieben, auf einem inversen Fluoreszenzmikroskop. Positionieren Sie die Zellen der Auswahl eine Zelle für ein Experiment und legen Sie sie in der Mitte des Gesichtsfeldes. Es ist wichtig zu perform diese Experimente in einem vibrationsfreien Umwelt, insbesondere für die Experimente mit dem Substrat-attached Zellen, weil kleinste Vibrationen, die typischerweise auftreten, auf Bänken und Stammtischen wahrscheinlich komplett zu kompromittieren die Schaffung der Dichtung, brechen Sie die Spitze der Mikropipette oder zu stehen erhebliche Verschiebungen in der Position der Spitze, die wird skew die Analyse der Ergebnisse. </li><li> Platzieren einer Mikropipette mit PBS / Medien w / Serumlösung in einen Pipettenhalter an einer Steckerleiste Wandlers durch flexible Schläuche mit dem Durchmesser eingestellt werden, um den Stecker des Pipettenhalter für einen sicheren Halt gefüllt. Zu Beginn jedes Experiments der Druck in der Pipette ist, äquilibriert auf den Atmosphärendruck. Die Pipette wird auf einem Mikromanipulator, die Feinsteuerung der Pipette Bewegungen in einer Mikrometer-Bereich ermöglicht montiert. Positionieren einer Pipette in einem flachen Winkel auf die Unterseite der Kammer und bringen die Spitze der Pipette in die Mitte des Gesichtsfeldes. The Schaft der Pipette, einen zylindrischen Teil der Pipettenspitze in dem die Membran abgesaugt wird horizontal zur Fokalebene von (1) Positionieren der Pipette an der flachsten Winkel möglich (10-15 °) und (2) durch ausgerichtete Biegen der Schaft der Pipette gegen den Boden der Kammer. Weil der Schaft ist sehr dünn, dass sie flexibel genug ist, um auf dem Boden der Kammer zu gleiten, während sich einer Zelle, wie sie schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Langsam Senkung der Mikropipette an der Seite einer einzelnen Zelle unter Verwendung des natürlich Manipulators bis nahe der Fokusebene für die Zelle. Dann wird unter Verwendung eines feinen Manipulator bewegt die Mikropipette zum Rand der Zelle, bis die Spitze der Pipette vorsichtig berührt die Membran. Nehmen Sie ein Bild, um die Position der Pipette zu beobachten. Gute Abdichtungen werden erzeugt, wenn die ganze Spitze der Pipette in vollständigem Kontakt mit der Zelloberfläche und der Kontakt ist stabil. Es gibt keine starken objektives Kriterium, aber darüber, wie gut die Dichtung except für die visuelle Prüfung. </li><li> Tragen Sie einen Schritt von Unterdruck mit dem Wandler und pflegen sie, bis Membran Projektion wird stabilisiert. Die Höhe der Druck erforderlich, um die Membran in die Pipette absaugen variiert je nach Zelltyp und spezifischen experimentellen Bedingungen. In unseren Experimenten wird Anfangsdeformation typischerweise beobachtet, wenn Druck im Bereich zwischen -2 und-15mm Hg beträgt. Wenn der Druck angelegt wird, wird die Membran in die Pipette allmählich verformt wird, bis es an einem bestimmten Länge, ein Prozess, der dauert typischerweise 2-3 Minuten stabilisiert wird. Während dieser Zeit werden die Bilder der Membranverformung alle 30 sec erworben, um das Fortschreiten der Membran, die in die Pipette gezogen wird verfolgen. </li><li> Erhöhen Sie den Druck auf die nächste Stufe in 2-5 mm Hg Schritte und wiederholen Sie den gesamten Vorgang, bis Membran Projektion löst sich von der Zelle und bewegt sich in die Pipette, an welcher Stelle das Experiment gestoppt. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Analyse Um den Grad der Membranverformung quantifizieren, wird die angesaugte Länge (L) von der Spitze der Pipette auf den Scheitelpunkt des Umfangs der Membran Vorsprungs gemessen. Es ist wichtig, zu beachten ist jedoch, dass eine größere Pipette wird mehr Kraft auf die Zellmembran auf dem gleichen Niveau von Druck anzuwenden. Um die Variabilität zwischen den Durchmessern der Pipetten zu berücksichtigen, wird daher der angesaugten Länge für die Pipette Durchmesser (D) für jedes Experiment gemessen normalisiert. Die Daten können weiter analysiert werden unter Verwendung eines Standard-Linear viskoelastische Halbraum Modell der Endothelzelle, wie in den früheren Studien 6,7 beschrieben. Speziell wurde der Elastizitätsmodul der Zellen unter Verwendung der Gleichung: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/3886/3886eq1.jpg" /> wobei E der Elastizitätsmodul ist, a die innerenRadius der Pipette, Ap die Druckdifferenz ist, L die entsprechende angesaugten Länge, und φ (η) eine Wand funktionieren errechnet Kraft Modells, wie durch Theret et al 7 beschrieben. Es ist wichtig anzumerken, dass mehrere Modelle wurden verwendet, um die Grunddaten eine Mikroaspiration Finite-Elemente-Modell, dass eine Zelle eine verformbare Kugel mit isotropen und homogenen Materialeigenschaften und Flüssigkeitstropfen-Modelle, die das Zellen eine Kugelform annehmen bilden ist annimmt analysieren, kontinuierlich verformen, und wieder bei der Freisetzung, wie in mehreren ausgezeichneten Bewertungen beschrieben: 8-10. Mikroaspiration kann auch verwendet werden, um anderen biomechanischen Parameter von Zellen und Geweben, wie zelluläre viskoelastischen Eigenschaften, kortikale Spannung und der Beitrag der verschiedenen strukturellen Elemente Zell-und Gewebekulturen Biomechanik (siehe die Bewertungen oben für weitere Informationen aufgeführt) zu untersuchen. 5. VertreterErgebnisse In früheren Studien wurde Mikropipette Aspiration entweder auf Liposomen 5 oder auf Zellen, die nicht an dem Substrat befestigt 2,11-13 wurden durchgeführt. In unseren Studien, jedoch werden die Zellen typischerweise auf das Substrat aufrechterhalten angebracht, um Änderungen in der Zytoskelett-Struktur, die wahrscheinlich auftreten, wenn die Zellen abzulösen 14-16 sind zu vermeiden. Um die Verwendung von Mikroaspiration Technik für Substrat-anhaftenden Zellen zu überprüfen, untersuchten wir, ob Störungen des F-Aktin-Ergebnisse in der Abnahme in der Zelle Steifigkeit von Rindern Endothelzellen (BAECs), geändert durch dieses Ansatzes geschätzt. Abbildung 3 zeigt, dass, wie erwartet , ist dies tatsächlich der Fall ist. Insbesondere zeigt 3A eine typische Folge von Bildern eines fluoreszierenden Endothelmembran unterziehen progressive Verformung in Reaktion auf negativen Druck durch eine Mikropipette aufgebracht. Wie erwartet, wird die Membran stufenweise in die Pipette angesaugt und dem aspirated Länge erhöht als eine Funktion der angelegten Druck. Die Zeit-Verläufe der Verformung zeigen, dass Störungen der F-Actin erhöht deutlich die angesaugte Längen der Vorsprünge unter allen Druckbedingungen (3B) 14. Unter Verwendung dieses Ansatzes entdeckten wir, dass Zelle Steifigkeit erhöht, wenn die Zellmembranen von Cholesterin aufgebraucht Erwägung Cholesterin Anreicherung hatte keine Wirkung 14. 4 zeigt eine angereicherte Cholesterol-Zelle, eine Steuerzelle, und eines Cholesterin-depletierten Zellen nach Erreichen maximaler Längen an Aspiration -15 mm Hg (4A). Die Vorsprünge typischerweise begonnen at-10mmHg entwickeln und die Zeit-Kursen Membranverformung könnte für die negative Drücke von -10, -15 und -20 mm Hg (4B) gemessen werden. Anwendung von Drücken oberhalb 25mmHg-Folge Ablösen der angesaugten Vorsprung Bilden einer separaten Vesikels. Das Druckniveau in der Membran Ablösung führte, war similar unter verschiedenen Cholesterin-Bedingungen. Diese Beobachtung war sehr unerwartet, weil frühere Studien zeigten, dass in der Membran Lipiddoppelschichten eine Erhöhung Membrancholesterin die Steifigkeit der Membran 5,17 erhöht. Unsere weiteren Studien bestätigt diese Beobachtungen mit mehreren unabhängigen Ansätzen, einschließlich Atomic Force Microscopy 18,19 und Force Microscopy Traction 20. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Seitenansicht einer Aufnahme Pipette. Die Pipette gezogen wird, um einen zylindrischen Schaft an der Spitze (Seitenansicht) zu erzeugen. Mikropipette Parameter: D = 2a = Innendurchmesser und ED = 2b = Außendurchmesser. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig2.jpg" /> Abbildung 2. Mikropipette Annäherung an ein Substrat-attached Zelle (A) Schematische Seitenansicht;. (B) Bright kontrastreiches Bild einer Mikropipette shank Berühren eines typisch geformten Zelle in Aspiration Experimenten verwendet, (C) Fluoreszenzbild von der gleichen Zelle mit DiIC 18 bezeichnet. Die Mikropipette ist noch vorhanden, aber nicht sichtbar ist (von 14). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig3.jpg" /> Abbildung 3. Validierung der Messzelle Steifheit in Substrat-anhaftenden Zellen mit Mikroaspiration. A: Die Bilder von progressiven Membranverformung BAECs unter Kontrollbedingungen und nach der Einwirkung Latrunculin Die Pipette ist unsichtbar auf die Bilder, weil es nicht fluoreszieren.. Die Zellen wurden auf 2 uM Latrunculin A für 10 min, die drastisch reduzierte die Menge an F-Aktin, wie Rhodamin-Phalloidin Fluoreszenz gemessen (nicht dargestellt) belichtet, jedoch hatte keine signifikante Wirkung auf die Zelle aufweist. In einer behandelten Latrunculin Zelle gibt es eine Ausdünnung der Membran in der Mitte der angesaugten Vorsprung aber der Vorsprung noch mit dem c angehängtEllen. B. Wirkung Latrunculin A auf den zeitlichen Verlauf der Membranverformung wobei L Länge der Membran Vorsprung und D angesaugt wird, ist der Durchmesser der Pipette für Kontrollzellen (n = 14) und Zellen, die 2 uM Latrunculin A für 10 Minuten (n = 5). Die Zellen wurden mit -10 mm Hg (Rauten), -15 mm Hg (Quadrate) und -20 mm Hg (Dreiecke) abgesaugt. (Ab 14). <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig4.jpg" /> Abbildung 4. Wirkung von zellulären Cholesterinspiegel auf Membran Verformung BAECs. . Ein typisches Bild für Membranverformung von Cholesterin angereicherten, Cholesterin-abgereicherte und Kontrollzellen (Kontrollzellen wurden MßCD ausgesetzt: MßCD-Cholesterin Gemisch im Verhältnis 1:1, die keine Auswirkung auf die Menge an freiem Cholesterin in den Zellen hatten (siehe Einschub). Die gezeigten Bilder zeigen die maximale Verformung bei -15 mm Hg ist. Der Pfeil zeigt die Position des Vorsprungs aspirierten. Die Bar ist 30 um. B. Durchschnittliche Zeit-Kurse der angesaugten Längen für die drei experimentellen Zellpopulationen. C. Maximalen Längen aspirierten dargestellt als eine Funktion des angelegten Druck. Die maximale normierte Länge in Zellen verarmt war signifikant niedriger als die von Kontrollzellen für Drücke -15 mm Hg und 20 mm Hg (P &lt;0,05). (Ab 14).

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C., Agah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cancer+progression+on+the+viscoelasticity+of+ovarian+cell+cytoskeleton+structures.">The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. , (2011).</li><li>Kole, T. P., Tseng, Y., Huang, L., Katz, J. L., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+kinase+regulates+the+intracellular+micromechanical+response+of+adherent+cells+to+rho+activation.">Rho kinase regulates the intracellular micromechanical response of adherent cells to rho activation.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 3475-3484 (2004).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+and+the+Actin+Cytoskeleton.">Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton.</a> Science. 279, 509-514 (1998).</li><li>Okajima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+for+the+Examination+of+Single+Cell+Rheology.+In.">Atomic Force Microscopy for the Examination of Single Cell Rheology. In.</a> Methods Mol. Biol. 736, 303-329 (2011).</li><li>Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+across+the+cell+surface+and+through+the+cytoskeleton.">Mechanotransduction across the cell surface and through the cytoskeleton.</a> Science. 260, 1124-1127 (1993).</li><li>Fabry, B., Maksym, G. N., Butler, J. P., Glogauer, M., Navajas, D., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+the+microrheology+of+living+cells.">Scaling the microrheology of living cells.</a> Physical Review Letters. 87, 148102 (2001).</li><li>Park, C. Y., Tambe, D., Alencar, A. M., Trepat, X., Zhou, E. H., Millet, E., Butler, J. P., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+cytoskeletal+prestress.">Mapping the cytoskeletal prestress.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 298, C1245-C1252 (2010).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts.">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophys. J. 80, 1744-1757 (2001).</li><li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-tracking+microrheology+of+living+cells:+principles+and+applications.">Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 301-326 (2009).</li><li>Shin, D., Athanasiou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoindentation+for+obtaining+cell+biomechanical+properties.">Cytoindentation for obtaining cell biomechanical properties.</a> J. Orthop. Res. 17, 880-890 (1999).</li><li>Ou-Yang, H. D., Wei, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+fluids:+probing+mechanical+properties+of+biological+systems+with+optical+tweezers.">Complex fluids: probing mechanical properties of biological systems with optical tweezers.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 61, 421-440 (2010).</li><li>Hosu, B. G., Sun, M., Marga, F., Grandbois, M., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+membrane+tethers+revisited+using+magnetic+tweezers.">Eukaryotic membrane tethers revisited using magnetic tweezers.</a> Phys. Biol. 4, 67-78 (2007).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Mikroaspiration stellt eine einfache und hoch reproduzierbares Verfahren zur Zelle Steifigkeit / Verformbarkeit durch Anlegen von Unterdruck an eine Zellmembran und Meßmembran Verformbarkeit in Reaktion auf wohldefinierte Druck schätzen. Es wurde zuerst von Mitchison und Swann (1954) entwickelt, um die elastischen Eigenschaften von Seeigel-Eiern zu charakterisieren Einblicke in die Mechanismen der Zellteilung 21 und dann auf die mechanischen Eigenschaften der roten Blutkörperchen 1 aussehen gebe...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog / Modellnummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Sutter Pipette puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Microforge </td><td> Narishige </td><td> MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> Inverted Fluoreszenzmikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert 200M </td><td> Das Mikroskop sollte vorzugsweise mit 3D/deconvolution Fähigkeiten ausgestattet werden. </td></tr><tr><td> Videocamera </td><td> Zeiss </td><td> AxioCam MRm </td><td></td></tr><tr><td> Image Acquisition sotware </td><td> Zeiss </td><td> AxioVision </td><td></td></tr><tr><td> Pneumatische Druck-Messumformer </td><td> BioTek </td><td> DPM-1B </td><td> DPM1B Pneumatische Transducer Tester können nun durch FLUKE gefunden werden. </td></tr><tr><td> Pipette aus Glas </td&gt; <td> Richland </td><td> Customized Glas </td><td> Pipetten wurden mit einer 1,2 Innendurchmesser und 1,6 Außendurchmesser angepasst. </td></tr><tr><td> DiI Dye </td><td> Invitrogen </td><td> D282 </td><td> Löst sich gut in DMSO </td></tr></tbody></table>

micropipette aspiration of substrate-attached cells to estimate cell stiffness

Wachsende Zahl von Studien zeigen, dass biomechanischen Eigenschaften einzelner Zellen wichtige Rollen spielen an einer Vielzahl zellulärer Funktionen, einschließlich der Zellproliferation, Differenzierung, Migration und Zell-Zell-Interaktionen. Die beiden wichtigsten Parameter der zellulären Biomechanik sind zelluläre Verformbarkeit oder Steifigkeit und die Fähigkeit der Zellen, sich zusammenzuziehen und Kraft erzeugen. Hier beschreiben wir ein schnelles und einfaches Verfahren zu Zelle Steifigkeit durch Messen des Grades der Membranverformung in Reaktion auf negativen Druck mit einem Glas-Mikropipette zur Zelloberfläche, eine Technik, die Mikropipette oder Aspiration Mikroaspiration genannt aufgebracht abzuschätzen. Mikroaspiration wird durch Ziehen einer Glaskapillare, eine Mikropipette mit einem sehr kleinen Spitze (2-50 Mikrometer Durchmesser in Abhängigkeit von der Größe einer Zelle oder einer Gewebeprobe), der dann an eine pneumatische Druckwandler verbunden ist und auf eine enge erstellen durchgeführt Nähe einer Zelle unter einem Mikroskop. Wenn derPipettenspitze berührt eine Zelle, ein Schritt der Unterdruck an der Pipette durch die pneumatische Druckwandler Erzeugen gut definierten Druck auf der Zellmembran aufgebracht. In Reaktion auf den Druck wird die Membran in die Pipette und progressive Membranverformung oder &quot;-Membran Projektion&quot; in die Pipette wird als Funktion der Zeit gemessen wird abgesaugt. Das Grundprinzip dieses experimentellen Ansatzes ist, dass der Grad der Verformung Membran als Reaktion auf eine definierte mechanische Kraft eine Funktion der Membran Steifigkeit ist. Je steifer die Membran ist, desto langsamer ist die Rate der Membranverformung und je kürzer die Steady-State-Aspiration length.The Technik kann auf isolierte Zellen, sowohl in Suspension und Substrat-verknüpften, große Organellen durchgeführt werden, und Liposomen. Analyse durch Vergleichen maximalen Membran Verformungen unter einem vorgegebenen Druck für unterschiedliche Zellpopulationen oder experimentellen Bedingungen erreicht durchgeführt. A &quot;Steifigkeitskoeffizienten&quot; ist estimated durch Auftragen der angesaugten Länge Membranverformung als Funktion der angelegten Druck. Weiterhin können die Daten weiter analysiert werden, um den Elastizitätsmodul der Zellen (E), die häufigste Parameter Steifigkeit Materialien charakterisieren abzuschätzen. Es ist wichtig anzumerken, dass Plasmamembranen von eukaryotischen Zellen als Zweikomponenten-System, bei dem Lipiddoppelschicht-Membran von der Sub-Membran Zytoskeletts und dass es das Zytoskelett, die das mechanische Gerüst der Membran bildet und dominiert die Verformbarkeit underlied wird eingesehen werden des zellularen Umschlag. Dieser Ansatz ermöglicht daher Sondieren die biomechanischen Eigenschaften der Untergruppe Membran Zytoskelett.

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Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode, um Zellen Steifigkeit zu messen. Das allgemeine Prinzip dieser Methode besteht darin, Membranverformung in Reaktion auf wohldefinierte negativen Druck durch eine Mikropipette an die Zelloberfläche aufgebracht messen. Diese Methode bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur biomechanischen Eigenschaften von Substrat-anhaftenden Zellen zu studieren.

Mikropipette Aspiration von Substrat-attached Cells zu schätzen Zelle Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

micropipette-aspiration-substrate-attached-cells-to-estimate-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.8K Aufrufe.  University of Illinois. Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode, um Zellen Steifigkeit zu messen. Das allgemeine Prinzip dieser Methode besteht darin, Membranverformung in Reaktion auf wohldefinierte negativen Druck durch eine Mikropipette an die Zelloberfläche aufgebracht messen. Diese Methode bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur biomechanischen Eigenschaften von Substrat-anhaftenden Zellen zu studieren.

Serie: Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Forschung

Biotechnik

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular functions and events1, 2. Their spatiotemporally dynamic nature has been revealed by visualization of their activity and localization in real time3. In order to gain deeper understanding of their roles in diverse cellular functions at the molecular level, the next step should be perturbation of protein activities at a precise subcellular location and timing. 
To achieve this goal, we have developed a method for light-induced, spatio-temporally controlled activation of small GTPases by combining two techniques: (1) rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and (2) a photo-caging method of rapamycin. With the use of rapamycin-mediated FKBP-FRB heterodimerization, we have developed a method for rapidly inducible activation or inactivation of small GTPases including Rac4, Cdc424, RhoA4 and Ras5, in which rapamycin induces translocation of FKBP-fused GTPases, or their activators, to the plasma membrane where FRB is anchored. For coupling with this heterodimerization system, we have also developed a photo-caging system of rapamycin analogs. A photo-caged compound is a small molecule whose activity is suppressed with a photocleavable protecting group known as a caging group. To suppress heterodimerization activity completely, we designed a caged rapamycin that is tethered to a macromolecule such that the resulting large complex cannot cross the plasma membrane, leading to virtually no background activity as a chemical dimerizer inside cells6. Figure 1 illustrates a scheme of our system. With the combination of these two systems, we locally recruited a Rac activator to the plasma membrane on a timescale of seconds and achieved light-induced Rac activation at the subcellular level6.

A method for spatio-temporal control of small GTPase activity by light is described. This method is based on rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and photo-caging systems. Optimization of light-irradiation enables the spatio-temporally controlled activation of small GTPases at the subcellular level.

Räumlich-zeitliche Manipulation kleiner GTPase-Aktivität in subzellulären Ebene und auf Zeitskala von Sekunden in lebenden Zellen

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Entwicklung, Erweiterung und<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Bestellen Einzelzellen und Einzel Embryos in 3D Confinement: Ein neues Gerät für High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 &#8211; 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn&#8217;t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Einfache Polyacrylamid-basierten Multiwell Steifigkeit Assay für das Studium der Steifigkeit abhängige Zell-Antworten

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

A Method to Estimate Cadaveric Femur Cortical Strains During Fracture Testing Using Digital Image Correlation

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral surface obtained from mechanical testing. This optical method requires a texture of many contrasting fiduciary marks on a solid white background for accurate tracking of surface deformation as loading is applied to the specimen. Immediately prior to testing, the surface of interest in the camera view is painted with a water-based white primer and allowed to dry for several minutes. Then, a black paint is speckled carefully over the white background with special consideration for the even size and shape of the droplets. Illumination is carefully designed and set such that there is optimal contrast of these marks while minimizing reflections through the use of filters. Images were obtained through high speed video capture at up to 12,000 frames/s. The key images prior to and including the fracture event are extracted and deformations are estimated between successive frames in carefully sized interrogation windows over a specified region of interest. These deformations are then used to compute surface strain temporally during the fracture test. The strain data is very useful for identifying fracture initiation within the femur, and for eventual validation of proximal femur fracture strength models derived from Quantitative Computed Tomography-based Finite Element Analysis (QCT/FEA).

In this protocol, the femur surface strains are estimated during fracture testing using the digital image correlation technique. The novelty of the method involves application of a high-contrast stochastic speckle pattern on the femur surface, carefully specified illumination, high speed video capture, and digital image correlation analysis for strain calculations.

Eine Methode, um Cadaveric Femur kortikalen Stämme während Fraktur Tests mit digitaler Bildkorrelation schätzen

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by several researchers. However, most of these investigators have used polyacrylamide hydrogels for stem cell culture in their studies. Therefore, their results are controversial because those results might originate from the specific characteristics of the polyacrylamide and not from the physical cue (stiffness) of the biomaterials. Here, we describe a protocol for preparing hydrogels, which are not based on polyacrylamide, where various stem, cells including human embryonic stem (ES) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells, can be cultured. Hydrogels with varying stiffness were prepared from bioinert polyvinyl alcohol-co-itaconic acid (P-IA), with stiffness controlled by crosslinking degree by changing crosslinking time. The P-IA hydrogels grafted with and without oligopeptides derived from extracellular matrix were investigated as a future platform for stem cell culture and differentiation. The culture and passage of amniotic fluid stem cells, adipose-derived stem cells, human ES cells, and human iPS cells is described in detail here. The oligopeptide P-IA hydrogels showed superior performances, which were induced by their stiffness properties. This protocol reports the synthesis of the biomaterial, their surface manipulation, along with controlling the stiffness properties and finally, their impact on stem cell fate using xeno-free culture conditions. Based on recent studies, such modified substrates can act as future platforms to support and direct the fate of various stem cells line to different linkages; and further, regenerate and restore the functions of the lost organ or tissue.

A protocol is presented to prepare polyvinyl alcohol-co-itaconic acid hydrogels with varying stiffness, which were grafted with and without oligopeptides, to investigate the effect of the stiffness of biomaterials on the differentiation and proliferation of stem cells. The stiffness of the hydrogels was controlled by the crosslinking time.

Menschlichen pluripotenten Stammzelle-Kultur auf Polyvinyl Alkohol-Co-Itaconic Säure Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit Xeno-freien Bedingungen

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been proven to be useful substrates for culturing cells in a physical microenvironment that partially mimics in vivo conditions. Here, we present a simple protocol for characterizing the Young's moduli of isotropic linear elastic substrates typically used for mechanobiology studies. The protocol consists of preparing a soft silicone substrate on a Petri dish or stiff silicone, coating the top surface of the silicone substrate with fluorescent beads, using a millimeter-scale sphere to indent the top surface (by gravity), imaging the fluorescent beads on the indented silicone surface using a fluorescence microscope, and analyzing the resultant images to calculate the Young's modulus of the silicone substrate. Coupling the substrate's top surface with a moduli extracellular matrix protein (in addition to the fluorescent beads) allows the silicone substrate to be readily used for cell plating and subsequent studies using traction force microscopy experiments. The use of stiff silicone, instead of a Petri dish, as the base of the soft silicone, enables the use of mechanobiology studies involving external stretch. A specific advantage of this protocol is that a widefield fluorescence microscope, which is commonly available in many labs, is the major equipment necessary for this procedure. We demonstrate this protocol by measuring the Young's modulus of soft silicone substrates of different elastic moduli.

Substrates with stiffness in the kilopascal-range are useful to study the response of cells to physiologically relevant micro-environment stiffness. Using just a widefield fluorescence microscope, the Young's modulus of soft silicone gels can be determined using an indentation with a suitable sphere.

Messung der Steifigkeit weichem Silikon Substrate für Mechanobiology Studien mit einem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...