Die Autoren bedanken sich bei Elena Lomakina, Richard Bauserman, Margaret Youngman, Shay Vaknin, Jessica Snyder, Chris Striemer, Nakul Nataraj, Hung Li Chung, Tejas Khire und Eric Lam für ihre Unterstützung bei diesem Projekt danken. Dieses Projekt wurde durch die NIH # PO1 HL 018208 finanziert.

Ein. Methoden 1,1 Zelle Flusskammer Ein Strömungskammer, in Abbildung 1 dargestellt, wurde so konstruiert, dass Zellen unter einer Scherung von 1,0 Pa (10 dyn / cm 2) angebaut werden könnten und dann direkt mit einer Asylum MFP3D AFM (Santa Barbara, CA) transferiert. <ol><li> Für 15 min und dann Waschen mit destilliertem Wasser: Die Strömungskammer wurde für den Versuch durch erste Reinigung der Glasträger in Piranhalösung (H 2 O 2 03.01 H 2 SO 4) hergestellt. Sie wurden dann zu backenden trockenen und beschichtet mit Aminopropyltriethoxysilan (APTES) in einem Vakuum-Abscheidungskammer. </li><li> Eine Silikondichtung geschnitten wurde mit einer Silhouette SD Schneidwerkzeug. Dies erlaubte uns, fein steuern die Strömungskammer Dimensionen zur Steuerung der Durchflussmenge und Scherbeanspruchung während des Zellwachstums. Typischerweise wurde eine 6,4 mm breite Kanal von 19 mm Länge aus einem Blech von 0,4 mm geschnitten Silikon. Der Durchfluss erforderlich Gattungente eine Schubspannung von 1,0 Pa (10 dyn / cm 2) wird unter der Annahme berechnet laminare Strömung in einem rechteckigen Kanal mit der Gleichung: </li></ol><img alt="Gleichung 1" fo:content-width="0.737in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1.jpg" /> wobei Q die Strömungsrate ist, τ die Scherspannung, μ die Viskosität des Mediums, hier angenommenen bis 1,0 mPa (0,01 dyn * sec / cm 2) ist, h die Höhe und w die Breite der Strömungskammer . <ol start="3"><li> Das obere Stück der Strömungskammer wurde mit der Dichtung in der Zellkulturschale ausgerichtet und befestigt mit einem Magnetring. Die Anordnung wurde mit Isopropylalkohol (IPA) für die Sterilisation gefüllt. </li><li> Der vollständige Flow-System montiert wurde. Die Strömungsöffnungen in der Zellkulturschale wurden Dreiwegeventile verbunden. Die Ventile wurden mit 30 ml Spritze öffnens. IPA wurde durch das System, das dann mit 30 ml McCoy-Medium mit 4% fötales Kälberserum (FCS) gewaschen wurde gespült. Das System wurde dann mit 20 ml der Vec Technologies Zellwachstumsmedium gefüllt. Covers wurden auf den Gipfeln der Spritzen gesetzt. Der Auffangbehälter Spritzenkappe hatte eine Nadel im Ort bis mittlere zurück an den Vorratsraum. Sterile 0,2 um Filter wurden auf den Lufteinlässen in den Deckeln angebracht, um eine Kontamination des Systems zu verhindern. Die Flusskammer war dann bereit für die Zell-Aussaat. </li></ol> 1,2 Cell Culture <ol><li> Menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVEC&#39;S) und Wachstumsmedium wurden aus Vec Technologies gekauft (Rensselaer, NY) und bis zur Konfluenz in einer T25-Flasche. </li><li> Das Wachstumsmedium wurde aus dem Kolben und der Monoschicht der Zellen mit 2 ml 2,5% Trypsin entfernt freigesetzt. Sobald die Zellen in Lösung waren, wurde die Trypsinierung durch Zugabe von 10 ml Zellkulturmedium in den Kolben gequencht. </li><li> The Zellsuspension wurde 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. Die Zellen wurden in 1 ml Zellkulturmedium (mit Serum) zur Injektion in die Strömungskammer resuspendiert. </li><li> Die Zellsuspension (0,5 ml, ~ 50.000 Zellen) wurde in eine Spritze gefüllt und in die Strömungskammer durch eine Drei-Wege-Ventil. </li><li> Die Zellen konnten sich absetzen und sich an dem Glassubstrat für 2 Stunden vor dem Flow wurde gestartet. Die Zellen wurden unter Strömungsbedingungen in einem Inkubator bei 37 ° C für 1 bis 5 Tage bis zur Konfluenz. </li></ol> 1,3 Cantilever Vorbereitung und Cell Einzug <ol><li> Spitzenlose AFM Kragarme (NanoWorld, Schweiz) wurden in Salpetersäure für 5 min gereinigt und funktionalisiert mit Aminopropyltriethoxysilan (APTES) in einer Dampfabscheidungskammer. </li><li> Eine Lösung von 5 mg / ml NHS Gew.-Sulfo-LC-Biotin in gepufferte Salz Hanks-Lösung (HBSS) wurde hergestellt. Die Ausleger wurden in die Lösung für 15 min bis konjugierte untergetauchtenTor das Silan mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) Chemie. </li><li> Eine Lösung von Biotin freiem Medium wurde durch Inkubation 20 ml Vec Technologies Zellkulturmedium (einschließlich Serum) mit 200 ul Streptavadin Perlen für 12 Stunden hergestellt. Die Perlen wurden vom Medium mit einem Magnet entfernt und das Medium wurde durch einen 0,22 um Sterilfilter filtriert. </li><li> Die Strömungskammer wurde aus der Zellkulturschale entnommen und die Zellen wurden in 37 ° C Biotin-freien Medium gewaschen. </li><li> Eine Stammlösung von 1 ul 2,4 um Perlen mit Streptavidin in 1 ml Biotin Medium beschichtet war bereit, und 100 ul der Aktie wurde auf der Zellkulturschale aufgenommen. </li><li> Streptavidin-Beads wurden mit dem Ausleger von der Landung die Spitze auf der Glasoberfläche neben einer Sicke, Zurückziehen, Positionieren der Spitze des Auslegers über den Wulst und dann Drücken des Auslegers nach unten auf die Sicke und ruhenden für mehrere Sekunden aufgenommen. </li><li> Die Empfindlichkeit des Auslegers war Maßnahmed durch Einrücken auf einen Bereich aus blankem Glas und unter Verwendung der Steigung der Kurve, um die Auslenkung der Spitze als eine Funktion der Spannung eingestellt. </li><li> Die Federkonstante des freitragenden wurde dann aus einem thermischen Kalibrierung im MFP3D Software berechnet. </li><li> Der kalibrierte Cantilever wurde dann verwendet, um Gedankenstrich der Proben, wie in Abbildung 2 dargestellt. Diese 2,4 um Perlen bieten eine größere Kontaktfläche mit der Zelloberfläche so dass die mechanischen Eigenschaften der weichmagnetischen Schicht Glykocalix detektiert werden kann. Der Cantilever wurde über eine Zelle nahe dem Zellkern und einem weichen Ansatz der Spitze auf der Zelle wurde verwendet, um den Cantilever Höhe etwa 3 um oberhalb der Zelloberfläche gesetzt positioniert. Die Software wurde für 20 wiederholt Vertiefungen mit einer Rate von 1 um / sec auf eine maximale Kraft von 7 nN eingestellt. Ungefähr 6 Sekunden zwischen den aufeinanderfolgenden Kontakten vergangen. Es ist möglich, unterschiedliche Raten der Einbuchtung verwenden, um für zeitabhängigen Eigenschaften der Glykocalix testen, obwohl in diesen anfänglichen<html> Versuche, lediglich eine einzige Einbuchtung Rate (1 um / sec) wurde verwendet. </li></ol> 2. Einrückung Theory Einbuchtung in einen elastischen Halbraum mit einer Kugel mit dem Radius R kann unter Verwendung Hertz Theorie wo die Kraft der Einbuchtung, F, durch die Gleichung gegeben ist: <img alt="Gleichung 2" fo:content-width="1.157in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2.jpg" /> Wobei δ die Eindringtiefe und E * die reduzierte Modul des Materials unter Test (Abbildung 3). Im Falle einer unendlich steif Eindringkörper Aufprallen eines einheitlichen elastischen Halbraum wird E * nach folgender Formel berechnet: 3/50163eq3.jpg &quot;/&gt; wobei E der Elastizitätsmodul und ν ist die Poisson-Verhältnis des Materials. Neuere Arbeiten mit Polymerfilmen wurde die Entwicklung einer zweischichtigen Modell zur Bestimmung des Moduls und der Dicke von dünnen Filmen 1 angeregt. Wir wenden dieses Modell auf Zellbiologie durch Behandeln der Glykocalix als einheitliche dünne weiche Folie auf der Oberfläche der Zelle Körper. Mit diesem Modell wird der reduzierte Elastizitätsmodul des Systems: <img alt="Gleichung 4" fo:content-width="2.85in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4.jpg" /> Wobei E GC der Modul des Glykokalyx ist, E Zelle der Modul des Zellkörpers ist, P, Q und n Konstanten sind, der empirisch aus dem Polymer passt bestimmt, und z durch die folgende Gleichung gegeben: <p class="jove_content" fo:keep-Together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Gleichung 5" fo:content-width="1.257in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5.jpg" /> Wobei t die Dicke der Schicht Glykocalix. Eine schematische Darstellung dieser Parameter wird in 3 gezeigt. Das Modell wurde gezeigt, dass eine genaue Methode zur Bestimmung des Moduls und der Dicke eines dünnen Films auf Substrat 1 steifer sein. Diese Gleichung kann verwendet werden, um die Kurven aus Einbuchtung in Zellen erhalten passen, um den Modul und die Dicke des endothelialen Glycocalyx zu bestimmen, wie in Abbildung 4 dargestellt.

<ol>
	<li>Clifford, C., Seah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoindentation+measurement+of+young's+modulus+for+compliant+layers+on+stiffer+substrates+including+the+effect+of+poisson's+ratios.">Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios.</a> Nanotechnology. , (2009).</li><li>Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+stimulates+incorporation+of+hyaluronan+into+endothelial+cell+glycocalyx.">Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).</li><li>Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecule+distribution+relative+to+neutrophil+surface+topography+assessed+by+tirfm.">Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm.</a> Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).</li><li>Lipowski, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+as+a+barrier+to+leukocyte+adhesion+and+its+mediation+by+extracellular+proteases.">The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases.</a> Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).</li><li>Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+actin+stress+fibers+in+living+cells.">Mechanical properties of actin stress fibers in living cells.</a> Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).</li><li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+surface+layer.">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).</li><li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force.">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).</li><li>vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+protects+against+myocardial+edema.">The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema.</a> Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).</li><li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity.">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).</li><li>Vink, H., Duling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules,+Erythrocytes,+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries.">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circulation Research. 79, 581-589 (1996).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir verwendeten Werte aus dem Zwei-Schichten-Modells und Hertz Theorie, um die Wechselwirkung eines Leukozyten im Blut zirkulierenden Endothelzellen mit der Wand Modell berechnet. Wir haben errechnet, daß eine auf der Mikrovillus Leukozyten mit einem Durchmesser von 50 nm unter einer 10 pN Last würde Gedankenstrich etwa 150 nm in die Glykocalix, nur einen Bruchteil der Gesamtdicke. Dies zeigt an, dass der Glykocalix, mit Eigenschaften wie in diesem Experiment gemessen, eine erhebliche Barriere für Zell-Zell-Wechselwi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> McCoy-Medium </td><td> Gibco </td><td> 16600-082 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Calf Serum </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td> Endothelial Cell Growth Medium </td><td> Vec Technologies </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> Gepoolten menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen </td><td> Vec Technologies </td><td> PHUVEC/T-25 </td><td></td></tr><tr><td> Schwefelsäure </td><td> JT Baker </td><td> 9681-02 </td><td></td></tr><tr><td> Wasserstoffperoxid </td><td> VWR </td><td> BDH3742-1 </td><td></td></tr><tr><td> (3-Aminopropyl) triethoxysilan </td><td> Aldrich </td><td> 440.140-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Isopropylalkohol </td><td> VWR </td><td> BDH8999-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Cellgro </td><td> 25-054-C1 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Buffered Salt Solution </td><td> Gibco </td><td> 14175-095 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfo-NHS-LC-Biotin </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21335 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavadin Perlen </td><td> Dynabeads </td><td> 112.06D </td><td></td></tr><tr><td> MFP-3D AFM </td><td> Asylum Research </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Spitzenlose Cantilevers </td><td> Nanowelt </td><td> ARROW-TL1-50 </td><td></td></tr><tr><td> Silhouette SD </td><td> Quickutz </td><td> Silhouette-SD </td><td></td></tr><tr><td> Silicone Rubber </td><td> Stockwell Elastomerics </td><td> SE50-RS </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml Spritzen </td&gt; <td> Benton Dickinson </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 18 Gauge-Nadeln </td><td> Benton Dickinson </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> Erweiterung Sets </td><td> Hospira </td><td> 4429-48 </td><td></td></tr><tr><td> 4-Wege-Ventile </td><td> Teleflex </td><td> W21372 </td><td></td></tr><tr><td> Male / Female Hafen Caps </td><td> Smiths Medical </td><td> MX491B </td><td></td></tr><tr><td> Schlauchpumpen </td><td> Watson-Marlow </td><td> 401U / D </td><td></td></tr><tr><td> Schlauchpumpen Tubing </td><td> Watson-Marlow </td><td> 903.0016.016 </td><td></td></tr><tr><td> Sterilfilter </td><td> Pall Life Science </td><td> 4652 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying the mechanical properties of the endothelial glycocalyx with atomic force microscopy

Unser Verständnis der Wechselwirkung von Leukozyten und der Gefäßwand während Leukozyten-Abscheidung wird durch eine unvollständige Verständnis der mechanischen Eigenschaften des endothelialen Oberflächenschicht begrenzt. Es ist bekannt, dass Adhäsionsmolekülen auf Leukozyten ungleichmäßig relativ Oberflächentopographie 3 verteilt, begrenzt, dass Topographie Klebeverbindung Formation mit anderen Oberflächen 9, und dass physiologische Anpresskräfte (≈ 5,0 bis 10,0 pN pro Mikrovillus) können die Mikrovilli als komprimieren weniger als ein Drittel ihrer Ruhelänge, Erhöhung der Zugänglichkeit von Molekülen an die Gegenfläche 3, 7. Wir betrachten das Endothel als Zwei-Schichtstruktur, der relativ starren Zellkörper, plus der Glykocalix, eine weiche Schutzschicht Zuckerdragierung auf der luminalen Oberfläche 6. Es hat sich gezeigt, dass die Glykocalix kann als eine Barriere, um die Adhäsion von Leukozyten an das Endothel Oberfläche 4 zu reduzieren handeln.In diesem Bericht werden wir damit beginnen, die Verformbarkeit der endothelialen Oberflächen behandeln zu verstehen, wie die endotheliale mechanische Steifigkeit könnte Bindung beeinflussen. Endothelzellen in statischer Kultur gezüchtet nicht Ausdruck eines robusten Glykokalyx, aber Zellen unter physiologischen Strömungsverhältnisse gewachsen beginnen ungefähre dem Glykokalyx in vivo 2 beobachtet. Der Modul der Endothelzelle Körpers gemessen wurde mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) auf etwa 5 bis 20 kPa 5 sein. Die Dicke und Struktur der Glykocalix wurden mittels Elektronenmikroskopie untersucht 8, und der Modulus der Glykocalix wurde approximiert durch indirekte Methoden, aber nach unserem Wissen gibt es keine veröffentlichten Berichten einer direkten Messung der Glykocalix Modulus in lebenden Zellen . In dieser Studie zeigen wir Experimente Einbuchtung mit einem neuartigen AFM-Sonde auf Zellen, die unter Bedingungen kultiviert wurden, um ihre Expression zu ma Glycocalyx zu maximierenke direkte Messungen der Elastizitätsmodul und die Dicke des endothelialen Glykocalix.

In einem typischen Experiment wurden 20 Kraft-gegen-Entfernungskurven aus einem gegebenen Bereich der Zelle erhalten wird, typischerweise in der perinukleären Region, in der Nähe, aber nicht auf, den Kern (innerhalb ~ 2 um). Die Kurven wurden zur Berücksichtigung eines Probe Drift über die Dauer der Messung ausgerichtet und dann gemittelt, um Geräusche zu entfernen Cantilever, wie in Abbildung 4 dargestellt. Die Kurven wurden analysiert und passen mit den zwei Schichten-Modell, das zur Bestimmung d...

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Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Die mechanischen Eigenschaften von Endothelzellen Glykokalyx wurden durch Einrückung mit Mikrometer große Kugeln auf AFM Cantilever gemessen. Endothelzellen wurden in einem benutzerdefinierten Kammer unter physiologischen Bedingungen kultiviert, um die Strömung Glykocalix Expression zu induzieren. Daten wurden unter Verwendung eines Dünnfilm-Modell, um die Dicke und Elastizitätsmodul Glykocalix bestimmen.

Die Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften des Endothelial Glykokalyx mit Atomic Force Microscopy

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.1K Aufrufe.  University of Rochester. Die mechanischen Eigenschaften von Endothelzellen Glykokalyx wurden durch Einrückung mit Mikrometer große Kugeln auf AFM Cantilever gemessen. Endothelzellen wurden in einem benutzerdefinierten Kammer unter physiologischen Bedingungen kultiviert, um die Strömung Glykocalix Expression zu induzieren. Daten wurden unter Verwendung eines Dünnfilm-Modell, um die Dicke und Elastizitätsmodul Glykocalix bestimmen.

Serie: Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Bakterielle Immobilisierung für Imaging von Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Forschung

Biotechnik

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Visualisierung von rekombinanten DNA-und Protein-Komplexe mit Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Eine neue Methode zur Lokalisierung Reporter fluoreszierende Kügelchen In der Nähe der Zellkulturoberfläche für Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

In-situ-Mapping der mechanischen Eigenschaften von Biofilmen durch Partikel-Tracking Mikrorheologie

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

Synthese von Hydrogelen mit Antifouling-Eigenschaften als Membranen für die Wasserreinigung

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

Ein Millimeter Skala Biege-Prüfsystem zur Messung der mechanischen Eigenschaften von marinen Schwamm Knochensplitter

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive models, which provide a mathematical representation of the mechanical function of those structures. This presented biaxial mechanical testing protocol involves (i) tissue acquisition, (ii) the preparation of tissue specimens, (iii) biaxial mechanical testing, and (iv) postprocessing of the acquired data. First, tissue acquisition requires obtaining porcine or ovine hearts from a local Food and Drug Administration-approved abattoir for later dissection to retrieve the valve leaflets. Second, tissue preparation requires using tissue specimen cutters on the leaflet tissue to extract a clear zone for testing. Third, biaxial mechanical testing of the leaflet specimen requires the use of a commercial biaxial mechanical tester, which consists of force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation testing protocols to characterize the leaflet tissue&#39;s mechanical properties. Finally, post-processing requires the use of data image correlation techniques and force and displacement readings to summarize the tissue&#39;s mechanical behaviors in response to external loading. In general, results from biaxial testing demonstrate that the leaflet tissues yield a nonlinear, anisotropic mechanical response. The presented biaxial testing procedure is advantageous to other methods since the method presented here allows for a more comprehensive characterization of the valve leaflet tissue under one unified testing scheme, as opposed to separate testing protocols on different tissue specimens. The proposed testing method has its limitations in that shear stress is potentially present in the tissue sample. However, any potential shear is presumed negligible.

This protocol involves characterizations of atrioventricular valve leaflets with force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation biaxial mechanical testing procedures. Results acquired with this protocol can be used for constitutive model development to simulate the mechanical behavior of functioning valves under a finite element simulation framework.

Biaxiale mechanische Charakterisierung von ventrikulären Herzklappen

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Anwendung der Atomkraftmikroskopie zur Erkennung früher Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...