Finanzierung bereitgestellt von der National Science Foundation (IOS-1050701 an BAC), die National Institutes of Health (NS54174 auf SM und F30DC0111907 zu AML-W.), Der Uehara Memorial Foundation und dem Japan-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften (G2205 zu TK ). Wir danken Julian Meeks für seine Unterstützung und Beratung zum Thema extrazellulären axonal Aufnahmen. Wir danken Carl Hopkins zur Bereitstellung eines Prototypen Aufnahme Kammer.

<ol>
	<li>Meeks, J. P., Jiang, X., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potential+fidelity+during+normal+and+epileptiform+activity+in+paired+soma-axon+recordings+from+rat+hippocampus.">Action potential fidelity during normal and epileptiform activity in paired soma-axon recordings from rat hippocampus.</a> J. Physiol. 566, 425-441 (2005).</li><li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+single-cell+staining+procedure+performed+in+vivo+under+electrophysiological+control:+morpho-functional+features+of+juxtacellularly+labeled+thalamic+cells+and+other+central+neurons+with+biocytin+or+Neurobiotin.">A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin.</a> J. Neurosci. Methods. 65, 113-136 (1996).</li><li>Joshi, S., Hawken, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loose-patch-juxtacellular+recording+in+vivo--a+method+for+functional+characterization+and+labeling+of+neurons+in+macaque+V1.">Loose-patch-juxtacellular recording in vivo--a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1.</a> J. Neurosci. Methods. 156, 37-49 (2006).</li><li>Margrie, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+whole-cell+recordings+in+the+mammalian+brain+in+vivo.">Targeted whole-cell recordings in the mammalian brain in vivo.</a> Neuron. 39, 911-918 (2003).</li><li>Lima, S. Q., Hrom&#225;dka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINP:+A+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording.">PINP: A new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4, e6099 (2009).</li><li>Foust, A., Popovic, M., Zecevic, D., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+initiate+in+the+axon+initial+segment+and+propagate+through+axon+collaterals+reliably+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Action potentials initiate in the axon initial segment and propagate through axon collaterals reliably in cerebellar Purkinje neurons.</a> J. Neurosci. 30, 6891-6902 (2010).</li><li>Lehman, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+as+a+transneuronal+tracer.">Herpes simplex virus as a transneuronal tracer.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 22, 695-708 (1998).</li><li>Joris, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dogged+pursuit+of+coincidence.">A dogged pursuit of coincidence.</a> J. Neurophysiol. 96, 969-972 (2006).</li><li>Heiligenberg, W., Rose, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+and+amplitude+computations+in+the+midbrain+of+an+electric+fish:+Intracellular+studies+of+neurons+participating+in+the+jamming+avoidance+response+of+Eigenmannia.">Phase and amplitude computations in the midbrain of an electric fish: Intracellular studies of neurons participating in the jamming avoidance response of Eigenmannia.</a> J. Neurosci. 5, 515-531 (1985).</li><li>Morales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Releasing+the+peri-neuronal+net+to+patch-clamp+neurons+in+adult+CNS.">Releasing the peri-neuronal net to patch-clamp neurons in adult CNS.</a> Pfl&#252;gers Archiv European J. Physiol. 448, 248-258 (2004).</li><li>Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+for+species+recognition+in+the+time-coding+electrosensory+pathway+of+mormyrid+electric+fish.">Neural substrates for species recognition in the time-coding electrosensory pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Neurosci. 18, 1171-1185 (1998).</li><li>Hitschfeld, &. #. 2. 0. 1. ;. M., Stamper, S. A., Vonderschen, K., Fortune, E. S., Chacron, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+restraint+and+immobilization+on+electrosensory+behaviors+of+weakly+electric+fish.">Effects of restraint and immobilization on electrosensory behaviors of weakly electric fish.</a> ILAR. J. 50, 361-372 (2009).</li><li>Xu-Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+mechanisms+of+temporal+analysis+in+the+knollenorgan+pathway+of+mormyrid+electric+fish.">Central mechanisms of temporal analysis in the knollenorgan pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Exp. Biol. 202, 1311-1318 (1999).</li><li>Amagai, S., Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+coding+in+the+midbrain+of+mormyrid+electric+fish.+I.+Physiology+and+anatomy+of+cells+in+the+nucleus+exterolateralis+pars+anterior.">Time coding in the midbrain of mormyrid electric fish. I. Physiology and anatomy of cells in the nucleus exterolateralis pars anterior.</a> J. Comp. Physiol. A: Neuroethol Sens Neural. Behav. Physiol. 182, 115-130 (1998).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bull World Health Organ. 2, 143-144 (1965).</li><li>Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-pattern+recognition+by+single+neurons+in+a+sensory+pathway+devoted+to+social+communication+behavior.">Temporal-pattern recognition by single neurons in a sensory pathway devoted to social communication behavior.</a> J. Neurosci. 29, 9417-9428 (2009).</li><li>Mugnaini, E., Maler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytology+and+immunocytochemistry+of+the+nucleus+extrolateralis+anterior+of+the+mormyrid+brain:+possible+role+of+GABAergic+synapses+in+temporal+analysis.">Cytology and immunocytochemistry of the nucleus extrolateralis anterior of the mormyrid brain: possible role of GABAergic synapses in temporal analysis.</a> Anat Embryol. (Berl). 176, 313-336 (1987).</li><li>Kohashi, T., Lyons-Warren, A. M., Mennerick, S., Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+submillisecond+spike+timing+differences+based+on+delay-line+anticoincidence+detection.">Detection of submillisecond spike timing differences based on delay-line anticoincidence detection.</a> J. Neurophysiol. 110, 2295-2311 (2013).</li><li>Colin, W., Donoff, R. B., Foote, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+tracer+in+the+peripheral+nervous+system.">Fluorescent latex microspheres as a retrograde tracer in the peripheral nervous system.</a> Brain Res. 486, 334-339 (1989).</li><li>Katz, L. C., Burkhalter, A., Dreyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+neuronal+marker+for+in+vivo+and+in+vitro+studies+of+visual+cortex.">Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex.</a> Nature. 310, 498-500 (1984).</li><li>Brown, S. P., Hestrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracortical+circuits+of+pyramidal+neurons+reflect+their+long-range+axonal+targets.">Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets.</a> Nature. 457, 1133-1136 (2009).</li><li>Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+recording+from+identifiable+neurons+of+the+locomotor+network+in+the+developing+zebrafish.">In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).</li><li>Pollak, G. D., Burger, R. M., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+circuitry+of+the+auditory+system.">Dissecting the circuitry of the auditory system.</a> Trends Neurosci. 26, 33-39 (2003).</li><li>Wurtz, R. H., Albano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual-motor+function+of+the+primate+superior+colliculus.">Visual-motor function of the primate superior colliculus.</a> Annu. Rev. Neurosci. 3, 189-226 (1980).</li><li>O'Malley, D. M., Zhou, Q., Gahtan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+neural+circuits+in+the+zebrafish:+a+suite+of+optical+techniques.">Probing neural circuits in the zebrafish: a suite of optical techniques.</a> Methods. 30, 49-63 (2003).</li><li>Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+techniques+for+tracing+pathways+in+the+central+nervous+system+of+developing+and+adult+mammals.">Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals.</a> Brain Res. Bull. 51, 11-28 (2000).</li><li>Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+with+cellular+resolution+reveals+precise+micro-architecture+in+visual+cortex.">Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex.</a> Nature. 433, 597-603 (2005).</li><li>Gahtan, E., O'Malley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lesioning+of+large+numbers+of+identified+vertebrate+neurons:+applications+in+zebrafish.">Rapid lesioning of large numbers of identified vertebrate neurons: applications in zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 108, 97-110 (2001).</li><li>Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lucifer+Yellow+slows+voltage-gated+Na++current+inactivation+in+a+light-dependent+manner+in+mice.">Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice.</a> J. Physiol. 550, 159-167 (2003).</li><li>Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function.">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> J. Neurosc. 30, 2871-2879 (2010).</li><li>Oxford, G. S., Pooler, J. P., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+and+external+application+of+photodynamic+sensitizers+on+squid+giant+axons.">Internal and external application of photodynamic sensitizers on squid giant axons.</a> J. Membr. Biol. 36, 159-173 (1977).</li><li>Roberts, T. F., Tschida, K. A., Klein, M. E., Mooney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spine+stabilization+and+synaptic+enhancement+at+the+onset+of+behavioural+learning.">Rapid spine stabilization and synaptic enhancement at the onset of behavioural learning.</a> Nature. 463, 948-952 (2010).</li><li>Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+nonlinear+optical+imaging:+beyond+fluorescence+microscopy.">Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).</li><li>Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+three-dimensional+fluorescence+imaging+of+activity+in+neural+populations+by+objective-coupled+planar+illumination+microscopy.">Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy.</a> Neuron. 57, 661-672 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Sobald beherrschen, wird diese Technik erlauben es, identifizierten Neuronen, einschließlich einzelner Axone, für die in vivo-Aufnahmen in vielen Modell Zielsysteme. Darüber hinaus ermöglicht diese Technik eine zuverlässig aufzeichnen Spike Ausgabe von Neuronen mit einzigartigen anatomischen Merkmale, die traditionell in vivo Aufnahme Methoden schwierig zu machen. Wir haben diese Technik genutzt werden, um aus ELa &quot;kleinen Zellen&quot; in mormyrid schwach elektrischen Fischen aufzunehmen. Frühere Versuche, die Stimmung Eigenschaften der &quot;kleinen Zellen&quot; zu studieren, waren erfolglos durch anspruchsvolle Aufnahmebedingungen 11, 14. Ähnliche anatomische Merkmale schaffen Hindernisse für den Erhalt von Single-Unit-Aufnahmen aus vielen verschiedenen Wirbeltieren auditorischen Neuronen und elektrosensorischen 8-10. Um diese Herausforderungen in unserem System zu überwinden, nutzten wir die Tatsache, dass &quot;kleine Zellen&quot; sind die einzigen Zellen in ELa dass Projekt ELP. Somit begrenzt retrograden Transport des Farbstoffes in ELP platziert Kennzeichnung in ELa zu &quot;kleinencell &quot;somas und Axonen. Fluoreszenzmarkierung der Axone erlaubt präzise Platzierung der Elektroden neben markierten Axone, so dass Single-Unit-Aufnahmen von identifizierten Zellen möglich trotz unzugänglich somas. Wir versuchten somatischen Aufnahmen, waren aber erfolglos, wahrscheinlich aufgrund der umliegenden verschlingenden Synapsen 11 , 17. war jedoch somatische Kennzeichnung deutlich sichtbar darauf hindeutet, dass diese Technik verwendet werden, um somatische Aufnahmen in anderen Zelltypen und andere Schaltungen abzuzielen. Fluoreszenzmarkierung von Neuronen durch retrograden Transport in vivo zur Führung gezielte Aufnahmen in vitro 19-21 verwendet wurde, . Eine ähnliche Technik wurde für die gezielte in vivo Aufnahmen von Motoneuronen im Rückenmark Zebrafisch 22 verwendet. Unsere Arbeit stellt eine neuartige Erweiterung dieses Ansatzes, in dem sowohl die Kennzeichnung und die Aufnahme in vivo im Gehirn sind fertig. Unsere Methode zeigt, dass in vivo Kennzeichnung von CNS Bereiche mit einer retrograden tRennfahrer können auf das Studium der anderen intakten Kreise mit ähnlich selektive Projektion Neuronen erweitert werden. Zum Beispiel in Säugetier-auditiven Verarbeitung dient der Colliculus inferior (IC) als wichtiger Weitergabezentrum für Eingänge von mehreren rhombencephalic Strukturen 23. Dye Injektion in den IC würde selektive Markierung der Zellen Vorsprung von jeder dieser Kerne. Der Colliculus superior (SC) bietet eine ähnliche Funktion für Vision 24. Rückenmark Zubereitungen eignen sich besonders gut für diese Technik geeignet, da das Rückenmark leicht zugänglich ist, Farbstoff-Injektion vom Aufnahmeort auftreten, und es kann mit intrazellulären Aufnahme und Füllen von ausgewählten Neuronen zu erwerben genauere anatomische Information 25 kombiniert werden. Schließlich ist Trakt-Tracing eine gut etablierte Technik in der zentralen Nervensystems verwendet werden, um komplexe Schaltung 26 zugeordnet. Unsere Methode kann genutzt werden, um funktionelle Informationen zu diesen Studien hinzufügen, wie hat w getan worden seinit Kalzium-sensitive Indikatoren in cat Sehrinde 27. Die Operation, die gut etabliert ist, zuverlässig und regelmäßig für Blinde in vivo Aufnahmen 16 verwendet wird, muss mit minimalen Blutungen und keine Schäden an der Oberfläche des Gehirns, das Tier und das Gewebe zu überleben erlauben abgeschlossen sein. Mit etwas Übung kann die Chirurgie und Farbauftrag in 30-45 Minuten abgeschlossen sein. Wir haben erfolgreich &quot;kleine Zelle&quot; Axone in 67% der Präparate bezeichnet. Die meisten Präparate haben nur 1 oder 2 sichtbar markierte Axone, aber einige haben so viele wie 8. Von den 119 markierten Einheiten versuchten, erhielten wir Single-Unit-Aufnahmen aus 26 Einheiten über 12 Zubereitungen (Tabelle 2) verteilt. So wurden die Daten von 41% der Präparate mit markierten Axone für eine Erfolgsquote von 28% erhoben. Der kritische Aspekt Farbauftrag wird die Kennzeichnung der Tiefe. Shallow Einsetzen der Wolframdraht in der Farbstoff gewaschen aw führenay. Wenn jedoch die Penetration zu tief, wird markiert Axone nicht sichtbar für das Targeting. Ferner muss eine mechanische Schädigung der Zelle für den Farbstoff ausreichend bis 25, 28 gemacht werden auftreten. Allerdings wird zu viel Schaden töten die Zellen. Wir haben versucht, die Markierung mit anderen Farbstoffen und andere Methoden (Tabelle 2), einschließlich anterograden Kennzeichnung durch Farbstoff Injektion in ELA mit Aufnahme von markierten Axone in ELP (Tabelle 3) gepaart. Wir vermuten, dass anterograden Kennzeichnung nicht erfolgreich war, weil Kennzeichnung wurde, um Zellen mit somatischen Schaden begrenzt, so dass sie nicht mehr reagiert. Zusätzlich kann präsynaptischen Terminals gestört worden. Dagegen minimiert retrograde Markierung beide dieser Probleme. Die Menge und Lage der Farbauftrag kann gemäß der speziellen Schaltung untersucht modifiziert werden. Maximal Kennzeichnung erfolgt mit dem größten Farbstoffkonzentration, die wir durch die Verwendung beschichteter Wolframdrähte. Allerdings, zur Beschriftung von Axonen mit deep Projektionen kann Farbstoff kommen aus einer Wolfram-Nadel, wie es fortgeschritten ist. In diesen Fällen würde Einspritzung besser geeignet. Dye Aufnahme und der Transport sind schnell, mit markierten Axone in unserer Vorbereitung sichtbar bereits 2 Stunden nach der Injektion und zusätzliche markierte Axone erscheinen so spät zu 6 Stunden nach der Injektion. Somit kann die Kennzeichnung und die Aufnahme an einem einzigen Tag durchgeführt werden, die Beseitigung technischer Schwierigkeiten mit dem Überleben Chirurgie. Die Zeitnahme erfolgt für jede Anwendung in Abhängigkeit vom Abstand zur Farbstofftransport erforderlich variieren. Ein weiterer kritischer Aspekt ist die Platzierung der Elektroden. Es ist wichtig, um das Gewebe in der Nähe der Stelle des markierten Axon verhindern das Verstopfen der Spitze ein. Bei dichtem Gewebe wie in ELa minimiert ein langer, dünner Schaft auf der Aufzeichnungselektrode über Bewegung des umgebenden Gewebes. Wenn eine erfolgreiche Aufnahme nicht beim ersten Versuch wiederholen mit frischen Elektroden erreicht, bis eine Aufnahme erhalten oder die tissUE bis zu dem Punkt, an dem das Axon nicht mehr sichtbar beeinträchtigt. Es ist jedoch auch wichtig, schnell die Elektrode neben dem Axon, die Menge des fluoreszierenden Belichtung, die Phototoxizität verursachen können, zu minimieren und Bleichen können physiologische Eigenschaften der Zelle 29-31 beeinflussen. Sobald ein Segment Axon erfolgreich in die Aufnahme-Elektrode abgesaugt, kann Aufnahmen für mehrere Stunden erhalten werden. Wenn Einheiten konsequent in weniger als 1 Stunde verloren gegangen sind, erwägen, kleinere Elektrode Tipps, um das Axon Herausrutschen zu verhindern. Auf der anderen Seite kann ein zu kleiner Spitze in Verstopfung, niedrigen Signal-zu-Rausch-, oder Schäden an der Axon führen. Ein stetiger Rückgang der Spitze Amplitude und der &quot;Rückkehr&quot; einer Einheit mit zusätzlicher Ansaug ist ein Indiz dafür, dass die Spitze zu groß ist. Zu viel Saug kann zu irreparablen Schäden an der Axon. Eine Lösung ist, ein kleines Leck in der Luftleitung ermöglicht so der Druck langsam auf Null zurück. Schnell Ausgleich the Druck wird in einem Übergangszustand relativ-außen &quot;Push&quot;, die das Axon zu vertreiben führen kann. Obwohl diese Technik, ein großer Vorteil für den Erhalt gezielte Aufnahmen von Projektion Neuronen identifiziert, wird es nicht zur Unterscheidung Interneuronen nützlich, als Farbstoff würde von allen Zelltypen an der Injektionsstelle entnommen werden. Theoretisch kann die Verwendung von mehreren Fluorophoren mit getrennten Injektionsstellen ermöglichen diese Verfahren erweitert werden. Zum Beispiel könnte Vergleich einzelner-versus Doppel-Markierung verwendet, um interneurons von Projektionsneurone nach Dual-Injektionen an zwei Punkten in der Schaltung 32 zu unterscheiden. Ebenso können retrograde Tracer mit anderen fortschrittlichen bildgebenden Verfahren, wie z. B. Zwei-Photonen-Imaging, wie kürzlich in Zebrafinken Hohe Vocal Center (HVC) 32 getan kombiniert werden. Außerdem sind die Aufnahme Regionen jenen nahe der Oberfläche begrenzt, wenn mit Epifluoreszenz Mikroskope, wie wir nur konnten 1 &amp; lösenmu; m Strukturen innerhalb der ersten 30 um von Gewebe. Jedoch könnte diese Tiefe durch die Verwendung von anderen Mikroskopieverfahren wie Zweiphotonenmikroskopie 33 oder Ziel-gekoppelten planaren Beleuchtung Mikroskopie 34 verlängert werden. Insgesamt stellt diese Technik einen wichtigen Fortschritt bei der Untersuchung der neuronalen Schaltkreise in vivo, da sie verwendet werden, um von einzelnen Neuronen in vielen verschiedenen Schaltungen in einer Vielzahl von Modellsystemen aufnehmen - auch diejenigen, die schwer zugänglich sind.

<table border="1" cellspacing="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tricaine Methanesulfonate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E10521</td>
 <td>MS-222</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gallamine Triethiodide </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8134</td>
 <td>Flaxedil</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lidocaine Hydrochloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>L5647</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hickman's Ringer Solution </td>
 <td>NA</td>
 <td>NA</td>
 <td>NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl2&bull;2H20 (0.29 g/l), MgSO4 (0.12 g/l), NaHCO3 (0.084 g/l), NaH2PO4 (0.06 g/l)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic Pump</td>
 <td>Gilson or Rainin</td>
 <td>Minipulse 3 Model 312; RP-1</td>
 <td>10.0 &plusmn; 1.0 rpm, Alternatively, a gravity-fed line with a flow-meter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection Microscope </td>
 <td>Nikon</td>
 <td>SM2645</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super Glue</td>
 <td>Super Glue Corporation</td>
 <td>SGH2</td>
 <td>2g tube</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Omni Drill 35</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>503-598</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ball Mill Carbide Drill Bit #1/4</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501860</td>
 <td>0.19 DIA (bit diameter = 0.48 mm) </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low Temp Cautery Kit</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>500391</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manual Micromanipulator</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>M3301R</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran Conjugated Alexa Fluor 568</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>D-22912</td>
 <td>2mM concentration; 10,000MW The choice of dye wavelength should be selected to match the microscope filter settings</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epifluorescent Microscope</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>E600 FN</td>
 <td>A remote focus accessory is helpful for fine focus TRITC filter - or appropriate filter to match focal planes for different dye wavelengths</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low Power Objective</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>93182</td>
 <td>CFI Plan Achromat Series, 4X N.A. 0.1, W.D. 30mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High Power Objective</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>93148</td>
 <td>CFI Fluor Series, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2.0 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>White Light Source</td>
 <td>Dolan-Jenner</td>
 <td>Model 190</td>
 <td>Fiber Optic Illuminator</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent Light Source </td>
 <td>Lumen Dynamics</td>
 <td>X-Cite 120Q</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low-light Level Camera</td>
 <td>Photometrics</td>
 <td>CoolSnap ES</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digital Manometer</td>
 <td>Omega Engineering</td>
 <td>HHP-201</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized Micromanipulator</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>MP-285</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Headstage</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>CV-7B</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>MultiClamp 700B</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data Acquisition System</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>Digidata 1322A</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isolated Pulse Stimulator</td>
 <td>A-M Systems</td>
 <td>2100</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P-97</td>
 <td>Program settings for our application: Heat: ramp + 1, Pull: '0', Velocity: 60, Time: 90 Box filament</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipette Glass</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1B100F-4</td>
 <td>Borosilicate capillary glass with filament (1 mm OD, 0.58 mm ID) </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

retrograde fluorescent labeling allows for targeted extracellular single-unit recording from identified neurons in vivo

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, Single-Unit-Antworten von einem identifizierten Population von Neuronen aufzuzeichnen. In vivo elektrophysiologischen Ableitungen von einzelnen Neuronen sind entscheidend für das Verständnis, wie neuronale Schaltkreise unter natürlichen Bedingungen funktionieren. Traditionell sind diese Aufnahmen durchgeführt &quot;blind&quot;, dh die Identität des aufgenommenen Zelle am Anfang der Aufzeichnung bekannt. Cellular Identität kann nachträglich über intrazelluläre 1, 2 oder juxtacellular loose-Patch 3 Iontophorese des Farbstoffs bestimmt werden, aber diese Aufnahmen können nicht auf bestimmte Neuronen in Regionen mit funktionell heterogenen Zelltypen gezielt vorbehandelt werden. Fluoreszierende Proteine ​​können in einer Zelltyp-spezifischen Weise ermöglicht visuell geführten einzelligen Elektrophysiologie 4-6 ausgedrückt. Es gibt jedoch viele Modellsysteme für die diese genetischen Werkzeuge sind nicht verfügbar. Auch in genetisch zugänglich Modellsysteme, die gewünschte PROmoter unbekannt sein oder genetisch homogenen Neuronen haben unterschiedliche Muster Projektion. In ähnlicher Weise wurden virale Vektoren verwendet, um bestimmte Untergruppen von Projektionsneurone 7 bezeichnen, aber die Verwendung dieses Verfahrens ist durch die Toxizität und das Fehlen von trans-synaptischen Spezifität begrenzt. So werden zusätzliche Techniken, die spezifische Pre-Visualisierung bieten, um von einzelnen Neuronen identifiziert in vivo Aufnahme benötigt. Pre-Visualisierung der Zielneuron ist besonders für anspruchsvolle Aufnahmebedingungen für die klassischen Single-Cell-Aufnahmen sind oft prohibitiv schwierig 8-11. Die neue Technik in dieser Veröffentlichung beschrieben wird, verwendet retrograden Transport von einem fluoreszierenden Farbstoff aufgetragen wurde, mit Wolframnadeln schnell und selektive Markierung eine bestimmte Untergruppe von Zellen in einer bestimmten Region des Gehirns auf ihrer einzigartigen axonalen Prognosen, wodurch ein visueller Hinweis gezielt elektrophysiologischen erhalten von identifizierten Neuronen in einer intakten Schaltkreis withina Wirbeltiere CNS. Der bedeutendste neue Entwicklung unserer Methode ist die Verwendung von Fluoreszenz-Markierung auf bestimmte Zelltypen nicht genetisch zugänglich Modell Zielsystem. Schwach elektrische Fische sind ein hervorragendes Modellsystem für die Untersuchung neuronaler Schaltkreise in wach, sich verhaltenden Tier 12. Wir nutzten diese Technik, um sensorische Verarbeitung von &quot;kleinen Zellen&quot; in der vorderen exterolateral Kern (ELA) von schwach-elektrischen Fischen mormyrid studieren. &quot;Kleine Zellen&quot; sind die Hypothese zu Zeit Komparator Neuronen wichtig zum Erfassen submillisekundenschnelle Unterschiede in den Ankunftszeiten der präsynaptischen Spikes 13 sein. Allerdings haben anatomischen Merkmalen wie dichten Myelin Verschlingen Synapsen und kleine Zellkörper es extrem schwierig, aus diesen Zellen mit Hilfe von herkömmlichen Verfahren 11, 14 aufzunehmen. Hier zeigen wir, dass unser neues Verfahren selektiv markiert diese Zellen in 28% der Vorbereitungen, so dass für eine zuverlässige, robuste und Aufnahmen characterisierung der Antworten auf elektrosensorischen Stimulation.

Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo at JoVE.com

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograden Transport von Fluoreszenzfarbstoff markiert eine Subpopulation von Neuronen auf anatomische Projektion basiert. Beschriftet Axone kann visuell ausgerichtet werden<em&gt; In vivo</em&gt; Und ermöglicht die Aufnahme von extrazellulären identifiziert Axone. Diese Technik ermöglicht die Aufnahme, wenn Neuronen kann nicht durch genetische Manipulation bezeichnet werden oder sind schwer zu isolieren mit &quot;blind&quot;<em&gt; In vivo</em&gt; Ansätze.

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

retrograde-fluorescent-labeling-allows-for-targeted-extracellular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

19.8K Aufrufe.  Washington University in St. Louis. Retrograden Transport von Fluoreszenzfarbstoff markiert eine Subpopulation von Neuronen auf anatomische Projektion basiert. Beschriftet Axone kann visuell ausgerichtet werden In vivo Und ermöglicht die Aufnahme von extrazellulären identifiziert Axone. Diese Technik ermöglicht die Aufnahme, wenn Neuronen kann nicht durch genetische Manipulation bezeichnet werden oder sind schwer zu isolieren mit "blind" In vivo Ansätze.