Ich bin dankbar, Ronald L. Calabrese, Dieter Jaeger (Emory University) und Ward Yuhas (Axon Instruments) für nützliche technische Diskussionen.

<ol><li> Hypothalamic Hirnschnitten bereit sind, inkubiert und die Aufnahme Kammer wie zuvor ausführlich (9) in Tieren, deren GnRH Neuronen exprimieren grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der Kontrolle des GnRH-Peptid-Promotor (10). Nach Entfernung des Gehirns aus dem Tier, ist das Gehirn blockiert mit einer Rasierklinge in Regionen, die nicht von Interesse sind zu beseitigen. Um die Regionen zu entfernen zu bestimmen, wird das Gehirn auf der dorsalen Fläche platziert, so dass der Hypothalamus visualisiert werden können. Sowohl für den koronalen und sagittalen Schicht Orientierungen, ist das Kleinhirn entfernt. Für koronare Schicht Vorbereitung, ist der rostralen Teil des Kortex entfernt. In diesem Stück Orientierung bieten die seitlichen Bereiche der Hirnrinde Unterstützung für das Schneiden des Gehirns und eine ausreichende Fläche des Gehirns für die Platzierung von Silberdraht an das Gehirn bei der Aufnahme Kammer zu sichern. Für die sagittalen Schicht Vorbereitung sind die seitlichen Regionen des Gehirns entfernt und die rostralen Teile der Hirnrinde bieten die Unterstützung für Gehirn Schneiden und für die Platzierung von Silber Drähte mit dem Gehirn in der Aufnahme gut zu sichern. Während der Sperrung Verfahren wird das Gehirn ständig befeuchtet mit kaltem künstlichen Liquor (ACSF) mit einer Glaspipette. </li><li> Eine kleine Menge Sekundenkleber ist auf dem neuesten Plattform gesetzt. Das Gehirn ist mit einem Spatel angehoben. Überschüssiges ACSF wird durch mitbringen Kimwipe an die Oberfläche der Spachtel und Zeichnung über ACSF Entfernung aus dem Gehirn entfernt. Das Gehirn ist leicht nach vorne geschoben auf den Leim. Es ist wichtig, nicht auf das Gehirn zu berühren oder drücken Sie auf es, um es zu sichern. Das Gewicht des Gehirns selbst ist in der Regel ausreichend, um sicherzustellen, dass es sicher ist. </li><li> Das Gehirn und das Schneidwerk wird dann an den vibrierenden Mikrotom gesichert und das Schneiden gut mit kaltem ACSF gefüllt. Die kalte Lösung beide Firmen das Gehirn und kann vor Beschädigungen während des Schneidens Verfahren zu schützen. Verschiedenen Hirnregionen unterschiedlich im Grad der Kälte, die Qualität Scheiben optimiert. Die Temperatur des ACSF für die Vorbereitung der Hypothalamus Scheiben ist in der Regel 0 ° C. </li><li> Scheiben sollte langsam geschnitten und jede Scheibe sollten frei weg schwimmen aus dem Gehirn. Wenn Scheiben beim Schneiden curl beginnen, sollten die Geschwindigkeit, mit der Klinge voran verlangsamt werden. Man kann mit einem kleinen Pinsel auf uncurl Scheiben aber das bedeutet Gefahr der Beschädigung der Scheiben und sollte daher vermieden werden. Langsam wird die Vorschubgeschwindigkeit der Klinge ist über mit einem Pinsel bevorzugt. </li><li> Da jede Scheibe aus dem Gehirn geschnitten wird, ist es aus der Trennkammer entnommen und in eine Scheibe Inkubationskammer in einem warmen Wasserbad (ca. 32 ° C). Die Scheibe Inkubator wird kontinuierlich mit Sauerstoff mit einer Mischung aus 95% O 2 und 5% CO 2 zugeführt. Generell Pre-Recording-Scheibe Inkubationszeit reicht von 30 Minuten bis 2 Stunden. </li><li> Glaspipetten (3-6 MOhm) hergestellt sind, wie zuvor beschrieben (9) mit einer vertikalen Abzieher. Die Temperatur und Dauer des Ziehens hängt von der Art der Pipette Abzieher benutzt man die Art von Glas verwendet man und die Lebensdauer der Heizfaden des puller basiert. Die Form der Pipettenspitze kann auch variieren je nach Präferenz des Nutzers. Wir haben gute Erfolge mit einer gleichmäßig konische Spitze mit einer Öffnung von 0,1 mm erreicht. Größere Öffnungen in der Pipette neigen dazu, die Neuronen beschädigen, während kleinere Öffnungen in langen Dauer Aufnahmen Ergebnis ausfallen. </li><li> Pipetten mit Sylgard beschichtet, um Kapazität zu reduzieren. Gezogen Pipettenspitzen sind leicht mit Sylgard 184 mit einer zweiten Pipette aufgetragen. Sylgarded Tipps sind dann thermisch gehärtet mit einer Heißluftpistole. Diese Pipetten sind dann mit dem Bad Perfusat gefüllt. Zur Erhöhung der Visualisierung der Pipettenspitzen, wird eine kleine Menge von Alexa-568, um den Teil des Bades als Pipettenlösung vor dem Befüllen der Pipetten verwendet werden aufgenommen. Wir wissen nicht wiegen die Alexa-568, sondern genug zu verwenden, um die Lösung pink von Auge drehen. Die Pipettenspitzen können dann unter dem Texas-Rot-Filter visualisiert. </li><li> Wir haben einen Ansatz zur Strom-Clamp Messungen zur Detektion von Aktionspotentialen mit geringem Widerstand Dichtungen (siehe Diskussion) zu erhalten entwickelt. Die Aufnahmen werden in der Zelle endogene Ruhepotential ohne angelegten Strom mit Axon Instruments 2B Axoclamp durchgeführt. Aufgrund des geringen Widerstandes Dichtung, konnte man nicht erkennen Aktionspotentiale nur mit dem 2B-Verstärker. Zur Erhöhung des Signals ist ein zweiter Verstärker (AM-Systeme 3000) in Serie mit dem Axoclamp 2B verwendet. Dieser Ansatz hat die Leichtigkeit von losen Dichtungen und Nutzen der Langzeit-Aufzeichnungen. Technisch kann man direkt zu messen Aktionspotentiale und damit die Umgehung der Probleme mit dem Ansatz in der Voltage-Clamp-Aufnahme-Modus (siehe Diskussion). </li><li> Man nimmt zwei Pipetten an der Oberfläche der beiden zuvor markierten Neuronen gleichzeitig, in ähnlicher Weise wie der Ansatz für die ganze Zelle Aufnahme-Konfiguration. Annäherung beider neurons zur gleichen Zeit wurde mehr Erfolg bei der Beschaffung der Dual-Aufnahmen, als zu versuchen jedes Neuron des Paares unabhängig. Während dieser Zeit werden die aktuellen Einspritzimpulse aus der 2B-Verstärker weitergegeben, wie während der Ansatz für Ganzzellableitungen getan wird. </li><li> Positiver Druck muss auf beiden Pipetten beibehalten werden, um Verstopfungen zu verhindern der Spitze. Positiver Druck für Dual-Aufnahmen ist am besten mit einem ungefüllten 3 ml leere Spritze an den Pipettenhalter von einer Länge von Rohrstück generiert. Mit Spritzen erlaubt es, Druck auf beide Pipetten aufrecht zu erhalten. Positiver Druck sollte so schnell wie der Pipette in die Badlösung der Aufnahme Kammer platziert wurde aufgetragen werden. Man nähert sich dem ausgewählten Neuronen mit den Pipetten der Reihe nach. Nach der Positionierung der ersten Pipette direkt auf die größte Fläche des Neurons, unterhält eine positive, indem man die Spritze in Stelle und lässt die Pipette in dieser Position. Einer kehrt dann an die Spitze der Aufnahme Kammer und senkt die zweite Aufnahme Pipette in die richtige Position. Ausgewählte Neuronen sind oft auf verschiedenen Ebenen der Scheibe. Die erste Pipette sollte über die Neuron, das tiefste in der Scheibe und die Position der zweiten Pipette an der mehr oberflächlichen Neuron positioniert werden. Dies verhindert die Positionierung des zweiten Pipette aus Verschiebung der Positionierung des zweiten Pipette als die Scheibe etwas bewegen wird in der vertikalen Ebene wie Pipetten der Scheibe geben. </li><li> Lose Dichtungen (18-30 MQ) verwendet werden. Der Überdruck wird induzieren eine kleine Grübchen auf der Oberfläche jeder Zelle. Man versucht zum ersten Neuron durch die Freigabe positiver Druck und Anwendung sehr leichten Unterdruck zu versiegeln. Der Überdruck wird durch Entfernen der Spritze freigegeben. Saug-durch den Mund wird dann an das freie Ende des Schlauchs angewendet. Eine gesunde Neuronen-Membran wird schnell auf die Freisetzung von positiven Druck zu reagieren und sich an der Pipette. Leichten Sog bilden eine Dichtung mit entsprechenden Widerstand in einem gesunden Nervenzelle. </li> <li> Wenn man zu einem Neuron und scheitert Dichtung versucht, kann die Pipette nicht wieder verwendet werden, da Membranen nur Dichtung, sehr sauberes Glas. Stattdessen wirft man die Pipette (und Mikroskop-Objektiv) weg von der Oberfläche der Scheibe an die Spitze der Perfusion gut, entfernt die Pipette aus dem Bad, Änderungen an einer sauberen Pipette und kehrt dann in die Scheibe zu versuchen, eine andere Zelle Dichtung . Für diesen Gründen ist es wichtig, mehrere potenzielle Neuronen für Aufnahmen auszuwählen. Für Scheiben mit weniger als 4-6 Aufnahmequalität Neuronen, von denen wählen, ist der Erfolg bei der Beschaffung von Dual-Aufnahmen beschränkt. </li><li> Nach der Gründung einer losen Dichtung am Widerstand basiert, werden die aktuellen Einspritzimpulse aus der 2B-Verstärker beendet. Die 2B Verstärker ist in Serie mit dem 3000-Serie Verstärker gelegt. In dieser Konfiguration dient der Ausgabe des 2B Verstärker als Eingang für die 3000-Serie Verstärker. Letztere Verstärker liefert ein Signal für die Datenerfassung. </li><li> Die Dichtung (Schritt 4) und Rekonfiguration von Verstärkern (Schritt 5) wird dann für das zweite Neuron wiederholt. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1678/1678fig1tmb.jpg" alt="Abbildung 1" border="0" /> Abbildung 1. Ein Zeitraum von mehr schießen in zwei GnRH-Neurone mit dem losen Dichtung angebracht Aufnahme-Konfiguration in einer sagittalen Schicht Vorbereitung. Die Scheibe wurde von einem kastrierten männlichen abgeleitet. Jeder Ausschlag nach oben zeigt ein Aktionspotenzial. Beachten Sie, dass eine GnRH Neuron (top Spuren) fast Dauerfeuer Exponate während der zweite GnRH Neuron weist intermittierende platzt. Dieses Muster der Aktivität von einzelnen Neuronen GnRH ist ähnlich dem der einzelne Einheiten von Multi-Unit-Aufnahmen während der Sekretion in vivo (7) extrahiert. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1678/1678fig1.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen.

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Die Aktivität von Interesse in einigen Neuronen auch GnRH-Neurone (basierend auf Hormonsekretion) tritt auf Zeitskalen von Stunden (5-7). Daher ist die ganze Zelle Konfiguration nicht die beste Wahl für einige experimentelle Ziele durch die Dialyse von intrazellulären Botenstoffen in der ganzen Zelle Aufnahmemodus. In zweiter Linie sind Ganzzellableitungen allgemein Tiere weniger als etwa 120 Tage alt begrenzt. Mit zunehmendem Alter scheinen neuronalen Membranen zu versteifen, so dass eine hohe Beständigkeit Dichtungen nur schwer zu erreichen. Darüber hinaus erhält, wenn man eine hohe Dichtung, Reißen der Patch stört das Siegel, so dass ein Loch zwischen der Pipette und der Membran. Dies führt zu einem unbrauchbaren Aufnahmen und ein Neuron, das schnell sterben wird durch ionische Ungleichgewichte. Regelmäßige Eierstock-Zyklen und damit stabile Aktivität des GnRH-Puls-Generators nicht erst später im Leben auftreten (7-10 Monate alt in C57BL6 Frauen; 11, 12), über das Alter, wenn man vernünftigerweise erwarten, erhalten Ganzzellableitungen zuverlässig. Schließlich zerstören Ganzzellableitungen der endogenen Verhältnisse von internen und externen Ionenkonzentrationen. Mit ganzen Zelle Aufnahmen, entspricht die interne Konzentration von Ionen die Konzentration der Ionen in der Pipette Lösung. Dies liegt daran, Pipettenlösung der relativ großen Volumen schnell ein Gleichgewicht erreicht mit / ersetzt die relativ kleine endogene Volumen der Zelle. Die lose Zelle angebracht Ansatz umgeht viele der Einschränkungen der whole-cell-Aufnahmen. Erstens kann ein niedriger Widerstand Dichtung (15-30 MQ) verwendet werden. Diese sind relativ einfach, auch in Neuronen von älteren Tieren zu bilden. Zweitens muss man nicht Ruptur der versiegelten Patch der Membran. Daher sind lose Zelle angebracht Aufnahmen technisch viel einfacher als Ganzzellableitungen. Zusätzlich wird, da die Zellmembran intakt ist, ist Dialyse von intrazellulären Komponenten nicht auftreten und endogenen ionischen Verhältnisse erhalten bleiben. Man kann nicht mit dem losen Zelle angebracht Ansatz zur Untersuchung synaptischer Ströme, aber es ist ideal für Langzeit-Aufzeichnungen von Neuronen in einem relativ nicht-invasive Art und Weise. Die Zelle-Attached-Aufnahmen können auch mit jedem Standard intrazelluläre Lösung in der Pipette werden. Dies bietet den zusätzlichen Vorteil, daß dadurch die Membran-Patch, wenn langfristig die Aufnahme abgeschlossen ist und die Kennzeichnung des Neurons mit einem intrazellulären Marker. Die lose Zelle angebracht Ansatz hat in der Voltage-Clamp-Aufnahme-Modus verwendet. Allerdings hat Voltage-Clamp-Aufnahme in das lose Zelle Attached-Konfiguration mehrere methodische Probleme. Zuerst wird das aufgenommene Signal ein indirektes Maß der Aktivität. Das Signal, das gemessen (die so genannte Aktion Strom) ist der kapazitive Strom, dass die Membran (13) Gebühren. Dies ist eine äußerst wichtige methodische Frage. Die Kapazität und Widerstand einer Aufnahme Pipette filtern das aufgezeichnete Signal. Es ist sehr wahrscheinlich, dass die kleine Aktion Strömungen in Aufladen der Kapazität der Pipette, die nicht richtig mit den meisten Verstärkern, aufgrund der hohen Widerstandsfähigkeit der headstage kompensiert werden, gehen verloren. Wenn diese Signale unentdeckt bleiben, ist die scheinbare Brennen Muster des Neurons nicht den tatsächlichen Feuern Muster. Ebenso führen unkompensierte Pipette und Abdichtwiderstande erhebliche Fehler bei der Messung während Veränderungen wie bei der Aktion Strömungen zum Ausdruck kommen (13). Einige Verstärker sorgen für Kapazität und Widerstand &quot;Entschädigung&quot; für die Pipette und Siegel, welches Signal Loss-Limite, aber hohe Kopf Stufen der meisten Verstärker behindern optimalen Ausgleich. Zweitens ist eine künstliche Situation auf die Zelle eingeführt. In Voltage-Clamp-Modus, ist die Gegend um die Zellmembran zu einem festen Potential gehalten wird, in diesen Studien, 0 mV. Dies bedeutet nicht, es gibt keine Bestromung der Zellmembran. Das Signal in Voltage-Clamp gemessen wird tatsächlich die Menge des angelegten Stroms an die Membran zu dem festen Potential aufrecht zu erhalten. Daher kann diese angelegten Strom verändern die Zellaktivität. Dual-Aufnahmen in der GnRH-System sind eine besondere Herausforderung aufgrund der begrenzten Anzahl der GnRH-Neurone und deren diffuse Verteilung. Für Dual-Aufnahmen um erfolgreich zu sein, muss der Manipulator als überaus stabil. Auch leichte Bewegung der Elektrode kann die Pipette zu rutschen das Neuron und die Aufnahme zu beenden. Darüber hinaus kann die Bewegung der Pipette auf die Zelle (zB Re-Positionierung, um die Bewegung zu kompensieren) verändern Brennen Muster. Einige Ionenkanäle wie N-Typ-Kalziumkanäle sind mechanisch empfindlich: Membran Strecke führt repetitive Aktivität sowohl Ganzkörper-Zell-und Zell-attached Aufnahme-Konfigurationen (14). Schließlich muss der Manipulator System in der Lage sein überaus feine und gleichmäßige Bewegung. Wie oben, mit zwei Aufnahmen bemerkt, nimmt man zwei Pipetten an der Oberfläche der beiden zuvor markierten Neuronen gleichzeitig und versucht, Dichtungeinem Neuron. Wenn dies gelingt, dann versucht man Siegel der zweiten Zelle. Generell kann man nicht erwarten, zu versiegeln und haben eine hohe Qualität der Aufnahme bei jedem Versuch. Dies erzeugt jedoch ein besonderes Problem mit Dual-Aufnahmen. Wenn man erfolgreich mit dem ersten Neuron ist aber nicht mit dem zweiten, muss man ändern Sie die Pipette und versuchen Sie eine andere Zelle. Deshalb muss man in der Lage sein, sowohl die Tauch-Objektiv des Mikroskops und die Pipette an die Spitze der Perfusion gut (um die Pipette zu ändern) zu bewegen, ohne dass der Erfolg besiegelt Neurons. Unsere Entwicklung und den Einsatz der losen Zelle-Attached-Ansatz für Dual-Aufnahmen ist ein großer technischer Fortschritt im Studium GnRH Neuronen. Es ist wahrscheinlich, zu brauchbaren Ergebnissen, die dazu beitragen, die Feld, die im Kontext der kritischen Frage, welche Mechanismen zu Grunde liegen die koordinierte Aktivität, die Ergebnisse in pulsatile Hormonsekretion. Produzieren

dual somatic recordings from gonadotropin-releasing hormone (gnrh) neurons identified by green fluorescent protein (gfp) in hypothalamic slices

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) ist ein kleines Neuropeptid, das Hypophysen-Version von luteinisierendes Hormon (LH) und Follikel-stimulierendes Hormon (FSH) reguliert. Diese Gonadotropine sind essentiell für die Regulierung der reproduktiven Funktion. Die GnRH-haltigen Neuronen sind diffus über den Hypothalamus und Projekt der Median Eminenz verteilt, wo sie GnRH aus ihren Axonterminalen Freisetzung in die hypophysiotropic Portal-System (1). In dem Portal Kapillaren, reist GnRH die Hirnanhangdrüse die Freisetzung von Gonadotropinen in den systemischen Kreislauf zu stimulieren. GnRH Release ist nicht kontinuierlich, sondern tritt in episodischen Impulse. Es ist bekannt, dass die intermittierende Weise von GnRH Freisetzung notwendig für die Fortpflanzung (2, 3). Koordination der Tätigkeit mehrerer GnRH Neuronen wahrscheinlich zugrunde GnRH-Pulse. Insgesamt Peptid-Gehalt in GnRH-Neurone ist etwa 1,0 pg / Zelle (4), von denen 30% Wahrscheinlichkeit besteht die lösbare Pool. Levels von GnRH während eines Pulses (5, 6), deuten mehrere GnRH Neuronen sind wahrscheinlich in Neurosekretion beteiligt. Ebenso Einheit Aktivität von Hypothalamus Multi-Unit-Aufnahmen während der LH-Freisetzung extrahiert zeigt Veränderungen der Aktivität mehrerer Neurone (7). Die Elektroden mit aufgezeichneten Aktivität während der LH Impulse werden entweder mit GnRH Somata oder Fasern (8) verbunden sind. Daher kann zumindest einige dieser Aktivitäten ergibt sich aus GnRH Neuronen. Die Mechanismen, die dazu führen, dass synchronisiert feuern in hypothalamischen GnRH-Neurone sind unbekannt. Die Aufklärung der Mechanismen, Brennen in GnRH-Neurone zu koordinieren ist ein komplexes Problem. Zunächst werden die GnRH-Neurone relativ wenige. In Nagetiere, gibt es 800-2500 GnRH Neuronen. Es ist nicht klar, dass alle GnRH-Neurone in episodische GnRH Freisetzung beteiligt sind. Darüber hinaus sind GnRH-Neurone diffus verteilt (1). Dies hat unser Verständnis der Koordinierung des Brand kompliziert und hat viele technische Ansätze unlösbar. Wir haben lose Zellen befestigt Aufnahmen in Current-Clamp-Modus zum direkten Nachweis von Aktionspotentialen optimiert und entwickelt eine Aufnahme Ansatz, der für die gleichzeitige Aufnahmen von Paaren von GnRH-Neurone können.

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Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Aktivität in neuronalen Systemen erfordert oft synchrone Aktionspotential Entladungen von Neuronen innerhalb einer bestimmten Population. Zum Beispiel, Impulse von Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) wahrscheinlich erfordern deshalb eine koordinierte Aktivität zwischen GnRH-Neurone. Wir präsentieren unsere methodische Ansatz für die zuverlässige Beschaffung gleichzeitige elektrophysiologischen Ableitungen aus dem diffus verteilt GnRH Neuronen.

Dual-Somatische Recordings von Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neuronen von Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamus Slices Identified

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

dual-somatic-recordings-from-gonadotropin-releasing-hormone-gnrh

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

22.1K Aufrufe.  University of Texas San Antonio - UTSA. Aktivität in neuronalen Systemen erfordert oft synchrone Aktionspotential Entladungen von Neuronen innerhalb einer bestimmten Population. Zum Beispiel, Impulse von Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) wahrscheinlich erfordern deshalb eine koordinierte Aktivität zwischen GnRH-Neurone. Wir präsentieren unsere methodische Ansatz für die zuverlässige Beschaffung gleichzeitige elektrophysiologischen Ableitungen aus dem diffus verteilt GnRH Neuronen.

Serie: Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

Gleichzeitige Aufnahme von Calcium-Signale von identifizierten Neuronen und Fressverhalten von Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Imaging Calcium Antworten in GFP-markierten Neuronen des Hypothalamus Maus Hirnschnitten

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von identifizierten Neuronen im intakten Gehirn von transgenen Fischen

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subzellulärer Patch-Clamp-Aufnahmen aus der somatodendritische Domain nigraler Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...