Ich bedanke mich bei L Watanabe, M Gorczyca und andere Mitglieder der Yoshihara Labor für hilfreiche Kommentare und Diskussionen. Ich danke K. und L. Scott Looger für Fliegenfischer Aktien, S Yokoyama für den Nachweis der Experimente, Shinya Iguchi für technische Hilfe, und Nobuko Yoshihara für wesentliche Informationen. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Mental Health Grants MH85958, und der Worcester Foundation auf MY unterstützt

1. Der Bau der Fliegen <ol><li> Gestalten Sie eine Plattform aus dem Deckel von 35 mm Falcon Gericht durch Schmelzen der Seitenwand und Carving es, einen geeigneten Winkel und Dicke (Abbildung 1a, Abbildung 2) zu bilden. Ein Loch in der Plattform, die Fliege Kopf (1a, b), so dass die Mundwerkzeuge frei nach außen von der Kammer (1a) ausgesetzt zu akzeptieren. Schneiden Sie das Ende einer Pipetman Spitze, mit der Größe passend zur Fliege zu beachten. Kleben Sie die Spitze an der Plattform, wie in Abbildung 1a dargestellt, um die Fliegen (Abbildung 2) zu vervollständigen. </li></ol> 2. Vorbereiten des Fly for Observation <ol><li> Hungern einen erwachsenen Fliege für 24 Stunden bei 25 ° C vor dem Experiment, indem Sie es in einem Fläschchen mit nur einem feuchten Papiertuch, wenn Hunger ist notwendig. </li><li> Betäuben die Fliege, indem Sie es in einer 15ml Plastikröhrchen Stehen auf Eis. </li><li> Mit einer Pinzette, legen Sie eine Fliege in der Kammer desFliegt, und schieben Sie die Fliege, bis sie unfähig sich zu bewegen ist. Dann wird ein Pfropfen, die Fliege zu behalten. (Abb. 1a, b). </li><li> Versiegeln Sie die umliegenden Teile der proximalen Rüssel (Rostrum) bis zur Innenkante des Loches; Eine kleine Menge von lichthärtenden Klebstoff (Tetric EvoFlow) zu den Seiten und über dem Rednerpult von außen (Pfeile in Abb. 3). Auch den Leim von der Innenseite der Fliegen in den Raum zwischen den dorsalen Teil des Kopfes und dem inneren Rand des Loches (1b). Damit das Rednerpult frei zu bewegen, sollte darauf geachtet werden, keinen Leim von der Berührung der Tribüne mit der Wimper zu (oder etwas Vergleichbares), um den Kleber zu verbreiten verhindern. Schließlich heilen Sie den Kleber mit dem schwächsten Bestrahlung mit blauem Licht ausreichend für die Heilung nicht zu beschädigen die Fliege vor übermäßiger Hitze. Ziehen Sie den Netzstecker. </li><li> Ein Thread auf die Tribüne teilweise angehoben (Pfeil in Abbildung 3) halten kann, um die Fliege zu stabilisieren &quot;Kopf durch die Vermeidung des Bump-Rachen-Teil zu SOG und den ventralen Teil des SOG aussetzen, vor allem für die Bildgebung präsynaptischen Enden der Nervenzellen Gr5a 8, die durch einen Teil des Rachens, wenn der Rüssel vollständig eingefahren abgedeckt sind. </li><li> Füllen der Oberfläche der Plattform mit einer zuckerfreien Salzlösung, enthaltend (in mM): NaCl, 140; KCl, 2, MgCl 2, 4,5; CaCl 2, 1,5 und HEPES-NaOH, 5 mit einem pH-Wert von 7,1 10. Das Saccharose-freie Kochsalzlösung hat ähnliche Tonus zu denen häufig verwendete Saccharose-haltige Salines wie HL3.1 11. </li><li> Öffnen Sie den Kopf Kapsel mit einem Wolfram-Klinge und Pinzette mit scharfen Spitzen wie eine Schere, die eine Sonderanfertigung ist und ursprünglich von Dr. Kageyuki Yamaoka, Japan, entwickelt, um die Nagelhaut schneiden und in der Luftröhre, um die SOG (Abbildung 4) freizulegen. Die ventralen Rand des Kopfes Kutikula wurde als ventrale wie möglich geschnitten, während die dorsalen Kante geschnitten war nicht so kritisch. Erstens, stellen einen Einschnitt durch diehinteren Rand mit einem Wolfram-Klinge. Dann, in der Seite abgeschnitten und die vorderen Kanten mit Hilfe der Pinzette geschärft. Der Schnitt Nagelhaut Stück sollte mit der Pinzette angehoben und entfernt werden. Antennen und antennalen Nerven sollte von den geschärften Zange geschnitten werden. </li><li> Um Bewegungsartefakte während Aufnahmen zu vermeiden, muss das Gehirn durch die Beseitigung von bestimmten Teilen der Fliege stabilisiert werden. Erstens, selektiv zu entfernen Luftsäcke zwischen der SOG und Nagelhaut. Schneiden der Speiseröhre am Ende in Richtung des Rachens und am Ende gehen in die SOG, um die Verbindung zwischen dem Pharynx und dem Gehirn zu entfernen. Dann ziehen Sie Muscle 16 12, und schließlich lösen keine Luftröhre verbindet das Gehirn und die Nagelhaut. </li><li> Wir setzen unsere Fliegen auf der Bühne einer Olympus BX51WI Mikroskop verbunden mit einem Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop-System (Improvision in PerkinElmer) (Abbildung 5). Ein Wasser-Immersionslinse, zB 40X/0.8 NA, wurde in das Bad (6 eingetaucht </strong&gt;). </li></ol> 3. Ca 2 +-Imaging of the Brain <ol><li> Ca 2 +-Imaging unter Verwendung GCaMP3.0 1, 9 wurde durch das Verfahren Marella et al errichtet wird. 8 (Abbildung 6). Mit einem Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop (Improvision), nehmen Sie einen einzelnen optischen Schnitt bei 4 Hz mit einer Belichtungszeit von 122ms mit 491nm Anregungslasers, wobei der Schwerpunkt auf der Region of Interest (eine Zelle Körper eines motorischen Neurons, oder ein Interneuron oder präsynaptischen von Geschmacks-sensorischen Neuronen) mit Velocity Software, Ver. 4,3 (Improvision). </li></ol> 4. Stimulierung der Proboscis <ol><li> Aspirieren 100 mM wässrige Saccharoselösung in einer Injektionsnadel mit einem kleinen Docht (aus Japanpapier, siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien), die von der Spitze (Abbildung 7). </li><li> Entladen Sie einen kleinen Tropfen Zuckerlösung auf den Docht, dann absaugen es, unmittelbar vor deme Anwendung des getränkten Docht Washi-Papier an der Spitze des Rüssels. Die Washi-Papier Docht sollte nur für einen Augenblick bis zur Sättigung (Abbildung 8) zu vermeiden, angewendet werden. Überwachen Sie die Proboscis extension response (PER) Verhalten mit einer CCD-Kamera, die an einem Dissektionsmikroskop (Abbildung 5) gleichzeitig mit Ca 2 +-Imaging. Die Daten müssen innerhalb einer Stunde nach Beginn der Dissektion, weil die pro Antwort wird nicht mehr als eine Stunde unter diesen Bedingungen gehalten genommen werden. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Motoneuronen des Rostrum Winkelmesser, ein Paar wichtigen Muskeln verantwortlich für die Aufhebung der Tribüne für Proboscis Extension, wurde berichtet, dass robuste Reaktionen auf Reize süßen 13 zeigen. Abbildung 9 zeigt, Ca 2 +-Signale durch GCaMP3.0 1, 9, ausgedrückt durch ein Gal 4-Treiber, E49 13, aus einem Zellkörper der Motoneuronen. Wie im Video, ein Robu gezeigtRunde PRO wurde synchron mit einem Anstieg der Ca 2 +-Signal beobachtet. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des Gehirns Fly Live-Imaging und Elektrophysiologie Stage (Fliegen). A: Der FLIEGEN so gebaut, dass der Winkel der Wand für die Fliege den Kopf zu kommen geraden ermöglicht. Drei Segmente der Fliege Rüssel sind farblich gekennzeichnet, die Tribüne ist Magenta. Die Fliege in der Kammer wird mit einer Pinzette eingelegt, und ein Stück vom Ende einer Pipetman Spitze abgeschnitten ist an der Rückseite der Kammer, die Fliege an der Flucht zu blockieren. B, wird das Loch gebohrt, um an der Fliege Kopf entsprechen. Die verbleibenden Lücken werden mit einem lichthärtenden Klebstoff abgedichtet wie angegeben um sicherzustellen, dass keine Lecks vorhanden sind. Nachdem der Kleber ausgehärtet ist, wird die Spitze Pipetman als Plug entfernt. Salzlösung wird in die FLIEGEN, dass die Oberfläche des Gehirns vollständig bedeckt gegossen. Es sollte sichergestellt werden, dass es keine Leckage Salzlösung werdenÝng hinaus auf das vordere Ende der Fliege Kopf. Der schraffierte Bereich durch die gestrichelte Linie im Diagramm b umgeben ist der Teil, um sich zu präparieren. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig2.jpg" /> Abbildung 2. Foto der Fliegen. Die halbmondförmigen Wand Klebstoff (von einer Klebepistole) wird um den Strom von Kochsalzlösung während der Perfusion zu steuern, und die Menge an Salzlösung, zu verringern. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig3.jpg" /> Abbildung 3. Frontansicht einer Fliege montiert in the Flies. Dieses Bild zeigt, wie eine Fliege in den Fliegen eingestellt ist, und wie die lichthärtende Kleber um den Kopf der Fliege (Pfeile), um eine Kochsalzlösung-Abdichtung schaffen wird. Wenn irgendwelche Lecks Kochsalzlösung durch den Rüssel der Fliege, dann das Experiment schlägt fehl. Das Gewinde (Pfeilspitzen) angebunden an der Bühne ist, um den Rüssel in Position zu halten, so dass es nicht vollständig Retraktion<html> Ted. Sonst wäre es behindern die mehr ventralen Teil des SOG und verursachen Bewegungsartefakte. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig4.jpg" /> Abbildung 4. Top-view of the Flies mit einer Fliege seziert. Dieses Bild zeigt den exponierten SOG einer Fliege folgenden Nagelhaut entfernen. Die Speiseröhre, Muskel 16 und Tracheen mit dem Gehirn verbunden, sowie ausgewählte Luft-Säcken wurden ebenfalls entfernt, um sie von Störung des Gehirns, die, um Artefakte in den Calcium-Signale führen kann verhindern. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig5.jpg" /> Abbildung 5. Die Vorrichtung zur Überwachung. Dieses Gerät wird von einem Olympus Mikroskop BX51WI an einem Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop-System (Improvision) montiert, und eine Nikon SMZ800 Mikroskop seitlich montierten. Dieser Aufbau ermöglicht die Live-Bildgebung von Hirnaktivität während PER Verhalten. 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg &quot;/&gt; Abbildung 6. Fotos, um die Seitenansicht der Fliegen zu zeigen. Die dünne Schicht von Kochsalzlösung wird zwischen dem Wasser-40X Immersionslinse und der Fliege eingeklemmt. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig7.jpg" /> Abbildung 7. Schematische zur Herstellung des Washi-Papier Docht. Gampi-Washi-Papier ist ein traditionelles japanisches Pergament, die extrem dünn und glatt (Haibara, Japan) ist. Es ist auch sehr stark und kann eine große Menge an Flüssigkeit zu halten. Die Washi-Papier muss in ein Trapez mit sehr spezifischen Abmessungen geschnitten werden; 0,3 mm und 0,7 mm in der Breite und 5.4 mm in der Länge (a). Diese trapezförmige wird dann von der Seite 0,7 mm in die Spitze einer subkutanen Nadel 23 G eingesetzt und kann auch durch die Einfügung eines Insekts Stift, der mit einer V-Form (b) gebogen ist, stabilisiert werden. C wird das Papier Washi transparent nach Expositionzu einer Flüssigkeit, wodurch es ideal für dieses Experiment. <img alt="8" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig8.jpg" /> 8. Die Stimulation des Rüssels an den Fliegen mit dem Docht-Washi. Die Washi Papier Docht an der Spitze einer subkutanen Nadel für einen Augenblick mit dem Joystick Manipulator mit einer Hand aufgebracht. Die Nadel wird durch einen Schlauch mit einem Injektor mit der anderen Hand manipuliert verbunden ist, zum Ansaugen und Abgeben Saccharoselösung. <img alt="Abbildung 9" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig9.jpg" /> Abbildung 9. Repräsentative Ergebnisse. ein, PER Verhalten durch die CCD-Kamera auf dem Stereomikroskop installiert aufgezeichnet. Frontalansicht eines verhungerten Fliege mit einem erweiterten Rüssel (Pfeile) vor der Stimulation, bei der Stimulation und nach der Stimulation mit einem Docht, der 100 mM Saccharose wässrigen Lösung (Pfeilspitze). Die Beleuchtung wird von einem 491-nm-Laser verwendet, erreichtfür GCaMP Fluoreszenz. b, 3,0 GCaMP Reaktion im motorischen Neurons für den Winkelmesser der Tribüne Muskel im ausgehungerten Zustand Saccharose-induziert. Die obere Platte, vor der Stimulation, die Bodenplatte, unmittelbar nach der Stimulation. Scale-Bar, 10 um. C, Quantifizierung des Saccharose-induzierte 3,0 GCaMP Antwort. Der Motor Neuron reagiert auf einen Saccharose-Stimulus von einem starken Anstieg in der Fluoreszenz durch eine Restaurierung Phase von mehreren Sekunden bis zur Grundlinie folgte.

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<p class="jove_content"&gt; Ich habe nichts zu offenbaren.</p

Die Fliegen ermöglicht die gleichzeitige Aufnahme von Ca 2 +-Signale und PRO Verhalten. Auch mit dem Gehirn ausgesetzt Kochsalzlösung normalen PRO wurde beobachtet. Verwenden des Gampi-Washi Docht anstelle von einem Kimwipe Docht in der ursprünglichen Kapillare verwendet method7 ermöglicht eine hoch reproduzierbare und stabile PRO Verhalten und vermeidet die Notwendigkeit, sich bei der Gestaltung und der Auswahl einer Kimwipe Docht Fachmann. Die experimentellen Spitzen oben erwähnt erlaubt es uns, erfolgreich zu vermeiden Störungen durch die Bewegung des Rüssels, was zu einer sehr stabilen Aufnahme von Ca 2 +-Signale mit geringer Geräuschentwicklung. Gelegentlich wurde Gewebeentfernung nicht ausreicht, um Zellen zu exponieren oder zu unterdrücken Bewegung ausreichend, was zu schlechten Ergebnissen. Allerdings, wenn wir qualifizierte waren, produzierte mehr als 80% der Präparate gute Ergebnisse. Diese Methode ist nicht nur für Ca 2 +-Imaging, kann aber auch zu jedem Live-Bildgebung angepasst werden unter Beachtung PRO Verhalten. Zum Beispiel können wir auf eine beliebige Zelle durch dieVerwendung einer Elektrode zur direkten Aufzeichnung Aktivität. Kombiniert mit zwei-Photonen-Anregung Mikroskopie, sind wir in der Lage, Zeitraffer-Aufnahme von synaptischen Struktur, die zu Verhaltensänderungen in den Bereichen durchführen können. Daher ist diese Methode der Bildgebung des Gehirns mit Verhaltensbeobachtung nicht nur wertvoll für die funktionale Zerlegung des neuronalen Netzes, könnten aber als ein mächtiges Werkzeug, um synaptische Plastizität 14 zu den Mechanismen, die hinter Speicher korrelieren verwendet werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name der Anlage / Reagent </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Tetric EvoFlow </td><td> Ivoclar Vivadent </td><td> M04115 </td><td> Lichthärtendes Leim </td></tr><tr><td> BX51WI Mikroskop </td><td> Olymp </td><td> BX51WI </td><td> Mit 40x (NA 0,8) Wasser Immersionsobjektivlinse </td></tr><tr><td> Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop-System </td><td> Improvision in PerkinElmer </td><td></td><td> Mit 491 nm Laser </td></tr><tr><td> Stereomikroskop </td><td> Nikon </td><td> SMZ-800 </td><td> An einem Schwenkarm. Stereo-Sicht ist noch verfügbar mit Videoaufzeichnung </td></tr><tr><td> Gampi-Washi-Papier </td><td> Haibara, Japan </td><td></td><td> Eine besondere Art der traditionellen japanischen Papier </td></tr><tr><td> CCD-Kamera </td><td> Imaging Source </td><td> DFK41AU02 </td><td> 1/2 &quot;1080 × 960 Pixel SONY CCD </td></tr><tr><td> Joystick Manipulator </td><td> Narishige </td><td> MN-151 </td><td></td></tr><tr><td> Injector </td><td> Narishige </td><td> IM-5B </td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of drosophila melanogaster

Um neuronale Netze im Hinblick auf ihre Funktion im Verhalten zu studieren, müssen wir analysieren, wie Neuronen, wenn jedes Verhaltensmuster erzeugt betreiben. Damit sind simultane Aufnahmen von neuronaler Aktivität und Verhalten wesentlich für die Hirnaktivität, um das Verhalten korrelieren. Für solche Verhaltens-Analysen, ermöglicht die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, uns genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren wie GCaMP 1 integrieren, um neuronale Aktivität zu überwachen und zu anspruchsvoll für genetische Manipulationen oder optogenetische thermogenetisch Techniken verwenden, um speziell Neuronen identifiziert 5.2 aktivieren. Die Verwendung eines thermogenetisch Technik hat uns dazu veranlasst, kritisch Neuronen für Fressverhalten (Flood et al., In Überarbeitung) zu finden. Als Hauptteil des Fressverhalten, erstreckt sich ein Erwachsener Drosophila ihrem Rüssel für die Zuführung 6 (Proboscis Extension Response; PER), der einem süßen Reiz aus Sinneszellen auf ihrem Rüssel oder Tarsen. Combining das Protokoll für PRO 7 mit einem Kalzium-Imaging-Technik mit 8 GCaMP3.0 1, 9, habe ich ein experimentelles System, in dem wir Aktivität von Neuronen im Ernährungszentrum überwachen können etabliert - die Subösophagealen Ganglion (SOG), gleichzeitig mit Verhaltensbeobachtung des Rüssels. Ich habe ein Gerät (&quot;Fly Gehirn Live-Imaging und Elektrophysiologie Stage&quot;: &quot;fliegt&quot;) entwickelt, um eine Drosophila Erwachsenen unterbringen, so dass ihrem Rüssel, sich frei zu bewegen, während sein Gehirn ist mit dem Bad für die Ca 2 +-Imaging ausgesetzt durch ein Wasserbad Immersionslinse . Die Fliegen ist auch geeignet für viele Arten von Live-Experimente auf Fliegenhirn wie elektrophysiologische Ableitung oder Zeitraffer-Aufnahme von synaptischen Morphologie. Da die Ergebnisse von Live-Bildgebung kann direkt mit der gleichzeitigen PRO Verhalten korreliert werden, kann diese Methode eine ausgezeichnete experimentelles System zur Verarbeitung von Informationen in neuronalen Netzwerken zu untersuchen, und wie diese cextrazelluläres Tätigkeit sich auf Kunststoff-Prozesse und Speicher gekoppelt.

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Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Die Fruchtfliege,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;, Erweitert sein Rüssel für die Zuführung, der einem Zucker Reiz aus ihrem Rüssel oder Tarsus. Ich habe Beobachtungen der Rüssel Ausweitung Antwort (PER) mit einem Calcium-Imaging-Technik kombiniert, so dass wir die Aktivität von Nervenzellen im Gehirn zu überwachen, gleichzeitig mit Verhaltensbeobachtung.

Gleichzeitige Aufnahme von Calcium-Signale von identifizierten Neuronen und Fressverhalten von Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

simultaneous-recording-calcium-signals-from-identified-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

15.5K Aufrufe.  University of Massachusetts Medical School. Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, Erweitert sein Rüssel für die Zuführung, der einem Zucker Reiz aus ihrem Rüssel oder Tarsus. Ich habe Beobachtungen der Rüssel Ausweitung Antwort (PER) mit einem Calcium-Imaging-Technik kombiniert, so dass wir die Aktivität von Nervenzellen im Gehirn zu überwachen, gleichzeitig mit Verhaltensbeobachtung.

Serie: Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Einzel Sensillum Recordings in der Insekten Drosophila melanogaster Und Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Forschung

Neurowissenschaften

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenetische Stimulation von Escape Verhalten in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von identifizierten Neuronen im intakten Gehirn von transgenen Fischen

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

Die intrazelluläre Aufnahme, Sinnes Field Mapping und Kultivierung identifizierten Neuronen in der Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Membrane Potential Dye Imaging von Ventromedial Hypothalamus Neuronen aus erwachsenen Mäusen zu Glucose Sensing Studieren

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Elektrophysiologische Aufnahme der zentralen Nervensystems Tätigkeit der dritte Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

In Vivo Optische Calcium-Bildgebung der lerninduzierten synaptischen Plastizität bei Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

Vorbereitung von Adult Drosophila melanogaster für die Bildgebung des gesamten Gehirns während des Verhaltens und der Stimuli-Reaktionen

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...