1. Herstellung von Elektroden und Kochsalzlösung <ol><li> Bereiten physiologischer Kochsalzlösung und Elektroden, bevor das Tier seziert. Leech Ringer-Lösung besteht aus den folgenden: 115,3 mM NaCl, 1,8 mM CaCl 2, 4,0 mM KCl, 10 mM Tris / Maleinsäure oder HEPES. Den pH-Wert auf 7,4. </li><li> Bereiten Sie eine Ag-Cl Draht durch Eintauchen eines gereinigten Silberdraht in eine kleine Menge von Bleichmittel für 20 Minuten oder bis der Draht hat eine glatte dunkelgrauen Finish. Waschen, bevor Sie den Draht mit destilliertem Wasser. Dann legen Sie den Draht in einer Mikropipette Halter, der in den Verstärker angeschlossen wird. </li><li> Bereiten Sie eine scharfe Glaselektrode aus Borosilikatglas mit einer Pipette Magnet. Die Elektrode Widerstand sollte in der Größenordnung von 20 MOhm sein. </li><li> Hinterfüllen der Pipette mit 3 M Kaliumacetat-Lösung und stecke in in die Mikrohalter. </li><li> Für eine extrazelluläre Elektrode herzustellen eine scharfe Glaspipette, wie oben beschrieben, brechen Sie die Spitze zurückReiben andere scharfe Pipette in der Nähe der scharfen Kante. Dann feuern polieren die Spitze, so dass es nicht die Verknüpfungen zu reißen. Kunststoff extrazellulären Elektroden wird auch funktionieren, solange ein guter Kontakt zwischen der Elektrode und dem Nerv. </li><li> Legen Sie die extrazelluläre Aufnahme-Elektrode in eine Mikropipette Halter (mit Ag-Cl-Draht), die mit einem Gummischlauch und Spritze zum Absaugen wird. Mit der Spritze Kochsalzlösung in der Elektrode zumindest auf das Niveau der Silberdraht zu ziehen. </li><li> Richten Sie die Hardware (Verstärker und Stimulus Isolator) und Software-Aufzeichnungsparameter, indem Sie das Handbuch für Ihre speziellen Signalaufnahmeeinheit. Siehe Leksrisawat et al., Um Details über 22 Geräte in den nachfolgend beschriebenen Experimenten verwendet anzuzeigen. </li></ol> 2. Bauchganglion Dissection <ol><li> Präparieren Sie die Blutegel in einer großen Silikon-Elastomer ausgekleideten Schale mit Blutegel Ringer-Lösung. Wenn das Tier in Längsrichtung gestreckt wird esleichter sein, die Bauchmark (siehe Abbildung 1A) zu entfernen. </li><li> Mit # 10 oder # 11 Größe Skalpell einen Längsschnitt mit sehr flachen Schnitte in der ventralen Mittellinie. Um die Mitte 2/3rd ventralen Schnitt ist in Fig. 1B gezeigt. Versuchen Sie nicht, durch den schwarzen Strumpf (die ventrale Blutsinus) schneiden, bis das Tier vollständig geöffnet und ohne Knicke das Blut Sinus gestreckt wird. Dieses Blut Sinus läuft über die Länge des Tieres entlang der ventralen Mittellinie. Der VNC ist innerhalb dieses Blutgefäß enthalten ist. </li><li> Nachdem die Haut wurde über die volle Länge des Tieres geschnitten nutzen die feinen Iris Schere, um das Blut nick Höhle (Abbildung 2). Rutsch eine Klinge der feinen Iris Schere unter der Sinus und die Klinge, um sie vom Nervengewebe zu trennen leicht anzuheben. Schneiden Sie den Sinus die Länge des VNC unter Vermeidung der Nervenwurzeln, segmentale Nerven oder die Verknüpfungen zwischen den Ganglien. </li><li> Dann entfernen Sie Teil der Bauchmark vonSchneiden Sie die Wurzeln distal, wo das Blutgefäß verbindet die Wurzeln. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Ganglien entlang der Länge des Bauchmark. </li><li> Übertragen eines Segments aus einem oder zwei Ganglien zu einer kleineren Petrischale. Die Ganglien oder die einzelne Ganglien muss straff mit etwas locker festgesteckt zu werden. </li><li> Stecken Sie die Verknüpfungen und die Wurzeln, so dass die Ganglien Glia-Hülle wird leicht gedehnt, um die Neuronenzellkörper aus, um sich beim Aufspießen durch die Glia-Hülle und in das Neuron von Interesse zu verhindern. Die Stifte sollten durch die schwarze Sinus für die Wurzeln und in der Mitte der beiden Verknüpfungen zu einer Schädigung der Axone (Fig. 3) zu minimieren, angeordnet werden. </li><li> Legen Sie die Petrischale mit der Vorbereitung unter dem Mikroskop und sichern Sie sie mit Wachs an der Unterseite der Schale, um die Bewegung zu verhindern. </li><li> Sorgfältig fokussieren den Lichtstrahl mit einem Spiegel und Licht Kondensator, um die Neuronen wie in 4A sehen (schematisch in 4B gezeigt </strong&gt;). Beachten Sie die beiden großen Retzius Zellen in der Mitte des Ganglions. </li><li> Um eine intrazelluläre Aufnahme des Rz, T, P, und N-Neuronen zu machen, vorsichtig die Spitze der Elektrode über der Zelle von Interesse und senken Sie die Spitze, bis ein Grübchen in der Glia-Mantel gesehen. </li><li> Tippen Sie auf den Elektrodenhalter oder Manipulator (sehr vorsichtig), so dass die Elektrodenspitze &quot;Pops&quot; in die Zelle von Interesse. </li><li> Spritzen Sie kurze Impulse (30-40 ms) von positiven Strom (1-10 nA) in die Zelle, um Aktionspotentiale hervorzurufen. </li></ol> 3. Die Kultivierung von Neuronen der ventralen Ganglion Vorbereitung <ol><li> Pin der Ganglien ventralen Seite nach oben in eine saubere Schale mit L-15 mit fötalem Kälberserum (FCS) (Abbildung 3). Pin den Wurzeln, so dass die Ganglien sind leicht gestreckt, wie oben für intrazelluläre Ableitungen getan. Mit einer feinen Schere, nick die Gliazellen Kapsel an einem Ende, rutsch ein Scherenklinge unter der Kapsel, dann über die Glia-Kapsel geschnittenwie in Fig. 5A gezeigt. </li><li> 100 l Aliquot von Collagenase / Dispase in die Schale und auf einem Schüttler für 15 min. Untersuchen Zellen, indem die Kulturmedien um die freiliegenden Zellkörper. Bringen Sie die Zellen, die Schüttler für weitere 15 Minuten oder länger, bis die Zellen kommen mit minimalen Absaugung. </li><li> Verwenden Sie eine Pipette auf eine Spritze, um sanft zu extrahieren Zellen aus dem Ganglion angebracht. Feuer polieren die Pipettenspitze, so dass sie etwas größer als die Zellenkörperdurchmesser. Rz für Zellen in einem erwachsenen Blutegel sollte der Durchmesser etwa 50 &amp;mgr; m sein. </li><li> Bereiten Sie eine Vielzahl von Pipetten mit unterschiedlichen Durchmessern, ohne einen Faden, da dies verringert die Chancen der Zellen stecken im Inneren der Pipette. Bewahren Sie die Pipetten in eine Flasche mit 80% Ethanol (EtOH) mit einem Wattebausch auf der Unterseite, um die Spitzen von Chipping schützen. Denken Sie daran, die EtOH mit Medium vor Absaugen Zellen zu waschen aus der Pipette. </li><li> Nach der Enzymbehandlung, waschen Sie dieenzymhaltigen Medium mit L-15 (mit FCS) 2x. Identifizieren Sie die Zellen von Interesse und sanft ziehen sie in die Pipette, indem Sie die Spritze (6A). Entladen Sie die abgesaugt Zellen in ein anderes Gericht, das L-15 (mit FCS) enthält. </li><li> Bis jetzt waren alle Verfahren nicht steril. Führen Sie die folgenden Schritte in einer sterilen Haube. Platzieren 3-4 große Tropfen von sterilem L-15 (mit FCS) an verschiedenen Stellen in einer sterilen Petrischale. </li><li> Pipettieren Sie die Zellen in eine der vor genannten Tropfen, um bläst sie in der Drop, um sie zu waschen. Wiederholen Sie diesen Vorgang in Serie in 3 oder 4 Tropfen Medium. </li><li> Zeigen Zellen in einer Petrischale mit sauberen L-15 gefüllt (mit FCS). </li><li> Inkubieren der Zellen für 1-24 h bei Raumtemperatur. Danach können die Zellen sauber beschichtet werden. Nach dem Verlassen der Zellen für ein paar Stunden oder über Nacht die extrazelluläre Matrix löst sich leicht. Platte die Zellen sofort auf mehr Prozesse erzeugen. </li><li> Verwenden sterilen Substrat zu beschichten, eine Mikrowell-di<html> sh und lassen Sie es vollständig trocknen lassen (über Nacht), bevor die Kultivierung Experimenten. </li><li> Nachdem die Schale beschichtet worden ist, Waschen der Schale vorsichtig mit sterilem Wasser und dann mit einer kleinen Menge des L-15-Medium. Denken Sie daran, die L-15-Lösung ohne FCS verwenden hinzugefügt, damit die Zellen an der Schale haften. Das Medium kann leicht zu L-15 geändert werden mit FCS, nachdem die Zellen an dem Substrat haftet. Wenn die Zellen bis zu einigen Stunden nach dem Ausplattieren, wird das Schaltmedium, um L-15 mit FCS verwendet werden, sind nicht notwendig. </li><li> Positionieren der Zellen nebeneinander bei der Beschichtung um eine schnelle Synaptogenese (6B) zu induzieren. Nach 24 Stunden Maßnahme physiologische Aktivität in Paarungen von Neuronen. </li><li> Verwenden intrazelluläre elektrophysiologische Techniken, um RP oder synaptische Antworten in kultivierten Paare von Zellen aufzeichnen (stimulieren ein Neuron durch eine intrazelluläre Elektrode und Rekord Antworten vom gepaart Zelle unter Verwendung einer zweiten intrazellulären Elektrode). </li></ol>Titel &quot;&gt; 4. Ganglion Körper-Wand Vorbereitung <ol><li> Pin der Blutegel dorsalen Seite nach unten in ein Elastomer ausgekleideten Schale wie oben beschrieben. </li><li> Pin der Haut zu einer Seite mit Wurzeln auf der anderen Seite des abgetrennten Ganglion (7A, 7B in vergrößert) oder machen ein Fenster auf der ventralen Aspekt der Blutegel über ein Ganglion (7C) mit allen Wurzeln, um den Körper Wand intakt. </li><li> Nach dem Erhalt einer stabilen intrazelluläre Aufnahme in eine der Sinneszellen (T, P, N) mit einem kleinen Glasstab, die Feuer poliert wurde, um die Haut im gleichen Segment leicht berühren. Wenn das Neuron aus aufgezeichnet ist eine N Zelle dann mehr Druck muss auf die Haut aufgetragen werden. In den meisten Fällen wird der N Zelle nur zu reagieren, wenn die Haut mit einer Pinzette eingeklemmt wird. Aus diesem Grund sollten diese Zellen das letzte mal versucht wie man die Haut schädigen oder zu verdrängen, den intrazellulären Umkodierung von stören die Vorbereitung auf eine solche Weise werden. </li><li> Man sollte sichLage, schnell skizzieren die Haut und Ganglien mit Details ausreichend genug, dass eine Karte, wo man berührt verwendet werden, um die rezeptiven Feld für einen bestimmten Neuron zu bestimmen. Nach der Aufnahme von so vielen T-und P-Zellen wie möglich auf beiden Seiten einer Ganglien versuchen die N Zellen. </li><li> Um zu untersuchen, ob die sensorischen Neuronen haben Prozesse, die durch die Verknüpfungen in einem rostralen oder kaudalen Weise und dann aus den Wurzeln in der angrenzenden Segment der Haut fahren, können die Verknüpfungen zwischen den Ganglien geschnitten werden und die rezeptiven Felder erneut untersucht in Bezug auf die Ausbreitung der Detektion. Grundsätzlich ist eine Prüfung, wenn es zu einem Verlust in dem Empfangsfeld. </li></ol> 5. Injizieren Fluoreszenzfarbstoffe <ol><li> Bereiten Sie einen Blutegel Ganglion wie oben beschrieben. </li><li> Füllen Sie eine Mikroelektrode mit einer Lösung von Lucifer Gelb-CH (3,0%) und Lithiumchlorid (300 mM). </li><li> Aufspießen einer der Sinneszellen oder Zellen Rz auf der Bauchseite des Ganglions, wie beschrieben,oben. </li><li> Injizieren Farbstoff in der Zelle, indem negative Strom (3nA) durch die Elektrode für 15 min. Stellen Sie die Impulsdauer auf 100 ms und die Frequenz 2 Hz. </li><li> Visualisierung der Farbstoff gefüllten Neuronen durch Anregung des Farbstoffs mit einer Quecksilberlampe und einem FITC / GFP-Filtersatz. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der Zweck dieser Versuchsreihe betrug 1) von identifizierbaren Neuronen lehren und zeigen die Grundprinzipien der intrazellulären Aufzeichnungen und 2), um die charakteristischen Formen der elektrischen Signale, die von diesen bestimmten neuronalen Typen mit adulten Blutegel entstehen erkennen. Es gibt eine reiche Geschichte von Untersuchungen mit Hilfe der Blutegel für die neurophysiologische Untersuchungen und Forschung ist im Gange in ein auf Fragen der neuronalen Schaltkreise und Gen-Regulation während der Entwicklung als auch bei der synaptischen Reparatur und Regeneration 10. Neuromodulation, insbesondere durch biogene Amin Wege, hat auch in der Blutegel eine erfolgreiche Forschungsrichtung. Durch die Zugabe von Dopamin und anderen pharmakologischen Mitteln des Nervensystems durch die Kochsalzlösung, hat sich gezeigt, dass Dopamin moduliert neuronale Netzwerke in Entscheidungs ​​23 und Bewegungsmuster für das Crawlen 24,25 Verhalten beteiligt. Dieser experimentelle Ansatz ist ein einfle (und kostengünstige) Weg, um Modulation in die Lehre zu integrieren Labor und Einstellen der ionischen Zusammensetzung der Salzlösung ist ein effektiver Weg, um die Nernst und Goldman-Hodgkin-Katz-Gleichungen zu lehren. Um erfolgreich mit den Ganglien Vorbereitungen sein, ist es wichtig, dass vor dem Versuch, eine Soma mit einem intrazellulären Elektrode stecken das Ganglion straff. Ansonsten wird das Soma zu bewegen, wenn Drücken des Glia-Paket. Darüber hinaus, wenn das Ganglion desheathing zum Entfernen von Neuronen für Kultur, vermeiden Sie die Region von Interesse, wenn quer durch das Ganglion so Somen nicht beschädigt werden, da sie entfernt werden. Auch kann eine übermäßige Inkubation der Enzyme in die Neuronen als zu zerbrechlich zu entfernen führen. Es erfordert einige Versuch und Irrtum, um eine ideale Inkubationszeit zu erreichen, weil jede Reihe von Enzymen ist in ihren Handlungen etwas anders. Weitere Untersuchungen zu Kulturmedien zu optimieren könnte diese Technik zu verbessern. Varischiedenen Faktoren, wie die Anwesenheit von Insulin, Zucker oder Wachstumsfaktoren könnte für längere Aufrechterhaltung der Kulturen untersucht werden. Um festzustellen, wenn die Zellen ihre Fähigkeit, Sender, wie zB Serotonin-Synthese in Rz Zellen synthetisieren zu halten, können neutral-Rot-Färbung angewendet werden, um serotonerge Prozesse kennzeichnen. Auch Mikroglia-Invasion, um verletzte und regenerierende Gewebe kann durch Kern Flecken Tage nach einer Verletzung quantifiziert werden. Obwohl dieser Zubereitung hat viele Vorteile für die bei der Prüfung der Regeneration und Reparatur sowie neuronalen Schaltkreise zu bieten, die pharmakologische und molekulare Identifizierung der verschiedenen Rezeptor-Subtypen an Synapsen wurden nicht vollständig charakterisiert. Ein exprimierten Sequenz-Tag-Bibliothek ist 26 und der medizinische Blutegel Genom wird derzeit montiert 27, aber die Hauptbegrenzung im Blutegel-Modell im Vergleich zu einigen Präparaten ist die Fähigkeit, das Genom zur selektiven Genen in bestimmten Zelltypen zu ändern. In Embryonen tseine Einschränkung wurde durch die Injektion von DNA oder dsRNA, die Genexpression regulieren 28 angesprochen. Die Gen-Kanone Technik wurde kürzlich verwendet, um wirbellosen Connexin (innexin)-Proteine ​​in Nervenzellen Blutegel auszudrücken. Die Expression eines innexin aus Hirudo verbana (HVE-inx6) ist ausreichend für die Bildung einer Eileiter gap junctions in der medizinischen Blutegel 29. Die Blutegel-oder H. Eisenkraut, wie es ist, 30 waren sicher, unser Verständnis der Physiologie und Entwicklung von elektrischen Synapsen in den nächsten Jahren voranzutreiben.

Der Blutegel Zubereitung nützlich für die Untersuchung der Funktion von identifizierbaren (sensorischen, motorischen und Interneuronen innerhalb des Tieres zentralen Nervensystems (ZNS). Das nützliche Eigenschaft Blutegel Neuronen ist, dass die Form ihrer Aktionspotentiale und biophysikalischen Eigenschaften charakteristisch für a sind gegebenen Zelltyp (dh P, N, T, Rz). Außerdem Neuronen aus dem Tier und kultiviert in einem geeigneten Medium, in dem die Zellen behalten ihre elektrischen Eigenschaften so lange wie 45 Tage 1,2 entfernt werden. Ein deutlicher Vorteil des Blutegels Ganglion zum Erlernen elektrophysiologischen Ableitungen machen, ist, dass die Zellen charakteristisch und zuverlässig im Ganglion in einem Muster angeordnet, das ermöglicht Identifizierung von unterschiedlichen Zelltypen aus Ganglion Ganglion und von Tier zu Tier. Die einzigartige Lage und die Morphologie von Neuronen im Blutegel Ganglien wurden von Retzius so früh wie 1891 3 notiert haben. Kenntnisse über the Identität und Funktion eines Neurons für die Untersuchung neuronaler Schaltkreise und für die Herstellung von Versuchen mit einem bestimmten Zelltyp vorteilhaft. Aufgrund der relativ großen Zellkörper der Neuronen innerhalb einer Ganglien sie mit einem Binokular sichtbar sind, und die Zellkörper selektiv mit Mikroelektroden zur Aufzeichnung ihrer elektrischen Eigenschaften aufgespießt werden. Farbstoffe und große Moleküle in einzelne Zellen und Kanaleigenschaften studierte von Patch-Clamp-injiziert werden. Ionenströme, die Anlass zu den verschiedenen Formen der charakteristischen Aktionspotentiale in den verschiedenen Neuronen identifiziert worden 4-7. Aus Untersuchungen in dem Muster der Innervation und Verzweigungen von individuellen Neuronen im ZNS sind die synaptischen Verbindungen in der Kultur mit 2,8 Neuronen identifiziert reproduziert. Studien in den Ganglien Blutegel haben Einblick in die Entwicklung von Funktionskreise, die mit der Elektrophysiologie als auch mit Gr gemessen werden können, zur Verfügung gestelltE tierischen Verhaltensforschung. Der Blutegel CNS hat auch als wertvolle Vorbereitung für die Untersuchung von Mechanismen der neuronalen Reparatur und Regeneration in der gesamten Tier-und in der Kultur 4-6,9-12 beteiligt serviert. In Säugetier Gehirn es ist eine gewaltige Aufgabe, das Verhalten in Bezug auf die Eigenschaften und Verbindungen einzelner Neuronen identifiziert erklären. Im Prinzip kann man hoffen, dass die Studie von weniger komplexen Systemen wie der Blutegel könnte helfen, grundlegende Mechanismen bei höheren Tieren verwendet definieren. Die Verbindungen, die verwendet werden, die ein Bad-Muster 13,14 und Rhythmik des Herzens 15 zugrunde liegen, wurden auch in der Blutegel aus. Die Fähigkeit einiger Blutegel Neuronen sowohl elektrische und chemische Kommunikation bilden, ist verblüffend. Einige Verbindungen sind bidirektional, während andere unidirektionale chemisch, sondern bidirektionale elektrisch 7. Das Verständnis der synaptischen Verbindungen im Tier sowie Neuerstellung der gleichen type von Verbindungen in einer Kulturschale sind leistungsfähige Werkzeuge für die Untersuchung Synaptogenese 16-18 sowie pharmakologischer Profilierung der Synapsen 19. Die hier beschriebenen intrazellulären Aufnahme-und Stimulationstechniken bieten eine Grundlage für pharmakologische Tests und Forschung in neuroethology und Entwicklung. Darüber hinaus kann die Segmentbauchmark mit einem Patch von innervierten Haut seziert werden. Mit der Fähigkeit, einen Patch von Haut und die Nervenzellen am Leben zu halten, können sensorische rezeptiven Felder durch Aufzeichnung elektrischer Signale aus dem Zellkörper (dh Soma) von sensorischen Neuronen innerhalb der jeweiligen Abdominalganglion im ZNS untersucht werden. Dadurch kann man die Empfindlichkeit der sensorischen Endungen indem unterschiedliche Grade der Kraft auf die Haut beurteilen und Karte rezeptiven Felder: leichte Berührung, Druck, und schädliche (schmerzhafte) Reize 20,21. Ein Vorteil dieser Blutegel Ganglien Vorbereitung der Haut ist, dass man ca.n ziehen anatomisch das rezeptive Feld Karte und Spuren die neuronalen Prozesse, die der identifizierten Neuron, sobald die elektrischen Antworten aufgezeichnet werden. Die im Folgenden beschriebenen drei Blutegel Experimente können alle mehrfach mit einem einzigen Exemplar, das diese eine kostengünstige Lehrmodul für wissenschaftliche Laboratorien macht abgeschlossen sein.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="256">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">Sylgard</td>
			<td style="width:64px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:64px;">&#160;182 silicone kit</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;P9333&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C5670&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tris/maleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Bleach&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>To chloride silver wire</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;221465&#160;</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;H1758</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">CULTURING MATERIALS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Collagenase/Dispase</td>
			<td>Boehringer Mannheim&#160;</td>
			<td>&#160;269-638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Leibovitz L-15 with L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>041-01415H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;">Fetal calf serum</td>
			<td>Ready Systems Ag&#160;</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">04-001</td>
		</tr>
		<tr height="102">
			<td height="102" style="height:102px;">D-Glucose-Monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gentamycin sulfate&#160;</td>
			<td>any&#160; supplier</td>
			<td></td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>043-0503H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3375</td>
			<td>Free acid, crystalline</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Concanavalin A Type IV</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C 2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Poly-L-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P 7890</td>
			<td>MW 15-30,000</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">&#160;Microwell plate, 60 x 10 &#956;l</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3034</td>
			<td>Flat bottom, 10 in a bag</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dissecting tools</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;assortment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Intracellular electrode probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc</td>
			<td>&#160;26001-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dissecting microscope (100X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fiber optic lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Small adjustable mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To direct light beam toward the preparation.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass electrodes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;CLS7095B5X</td>
			<td>Box of 200, Suction electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;MD4-M3-R</td>
			<td>&#160;Can fix for base or on a metal rod</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Raised preparation stand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Silver wire (10/1,000 inch)</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>&#160;782500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Computer</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AC/DC differential amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">PowerLab 26T</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>&#160;27T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Head stage</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Comes with AC/DC amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">LabChart7</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Electrical leads</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass tools&#160;</td>
			<td>make yourself</td>
			<td></td>
			<td>For manipulating nerves</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Cable and connectors</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Pipettes with bulbs&#160;</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;13-711-7</td>
			<td>Box of 500</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Beakers</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Wax or modeling clay</td>
			<td>any company or local stores</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Stimulator</td>
			<td>Grass Instruments</td>
			<td>SD9 or S88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;">Plastic tip for suction electrode</td>
			<td rowspan="2">local hardware store (Watt&#8217;s brand)</td>
			<td rowspan="2">&#188; inch OD x 0.170 inch ID</td>
			<td>Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intracellular recording, sensory field mapping, and culturing identified neurons in the leech, hirudo medicinalis

Der Süßwasser Blutegel, Hirudo medicinalis, ist eine vielseitige Modellorganismus, die verwendet wurde, um wissenschaftliche Fragen in den Bereichen der Neurophysiologie, neuroethology und Entwicklungsbiologie befassen. Das Ziel dieses Berichtes ist es, experimentelle Techniken aus dem Blutegel-System in einem einzigen Artikel die von Nutzen für Physiologen mit Know-how in das Zentrale Nervensystem Zubereitungen oder Biologie-Studenten mit wenig oder keiner Erfahrung sein Elektrophysiologie wird sich konsolidieren. Wir zeigen, wie man die Blutegel für die Aufnahme von intrazellulär identifiziert neuronalen Schaltkreise im Ganglion sezieren. Weiter zeigen wir, wie einzelne Zellen von bekannten Funktion kann von der Ganglien in einer Petrischale kultiviert werden, und wie man von diesen Neuronen in Kultur aufzeichnen entfernt werden. Dann zeigen wir, wie man einen Patch von innerviert Haut zur Abbildung sensorische oder motorische Felder verwendet werden vorzubereiten. Diese Blutegel Vorbereitungen sind immer noch weit verbreitet, um die grundlegenden elektrischen Eigenschaften der neuronalen Vernetzung Adresseks, Verhalten, Synaptogenese und Entwicklung. Sie sind auch eine entsprechende Ausbildungsmodul für Neurophysiologie oder Lehrlabors.

Intrazelluläre Aufnahmen von sensorischen Neuronen im Blutegel Ganglion sich durch ihre in 4C gezeigt unterschiedlichen Spannungs-Zeit-Spuren aus. Die Ruhezellmembranpotential bei gesunden Blutegel Ganglienzellen ist -45 bis -60 mV. Wenn Potenziale sind kleiner (weniger negativ) sollte man die Glaselektrode zu ändern, oder wenn das Potenzial ist immer noch niedrig ist, gehen Sie zu einem anderen Segment des Nervenstrang. Spontanen Aktionspotentiale mit kleiner Amplitude kann anzeigen, dass die Elektrode in einem Motor Neuron. Wenn dies geschieht in der Ganglienkörperwand eine Strominjektion kann verwendet werden, um festzustellen, ob das Neuron innerviert alle Muskeln, noch auf der Haut befestigt werden. Der Ringraum erector Motor Neuron (AE) ist auf der Bauchseite des Ganglions (4B) und es führt dazu, dass die Ringe (Rippen oder Segmente), um durch die Aktivierung der Ringmuskel Rückens steigen. Einspeisen von Strom in den Sinneszellen sollten Aktionspotential hervorzurufens mit den in Fig. 4C gezeigten charakteristischen Kurven. Wenn die Wellenformen anders aussehen es aufgrund einer Verstimmung der Brücke oder Offset-Kapazität Entschädigung sein könnte. Man sollte das Handbuch, die die Signalerfassungseinheit für Details, wie die Brücke in einer Zelle auszugleichen begleitet konsultieren. Beachten Sie die Stimulus-Artefakte am Anfang und Ende der Stromimpulse in 4C. Dies ist, wie die Artefakte zu suchen, wenn die Brücke abgeglichen ist. Primärkulturen von Neuronen aus dem Blutegel Ganglion bilden elektrische und chemische Synapsen im Gericht. Zunächst werden die elektrischen Eigenschaften der kultivierten Zellen sind nicht genau die gleichen wie sie in vivo sind. Doch nach ein paar Tagen die Impulse sind fast nicht zu unterscheiden von den in den Ganglien aufgezeichnet. Dies ist in Fig. 6C mit einem Paar von Rz Zellen gezeigt. Nach 7 h in Kultur die Amplitude der synaptischen Potentiale war 1-2 mV. Nach 56 h in Kultur synaptic Potentiale waren größer als 10 mV (Spitze Spuren in 6C). Die Form des Aktionspotentials ändert sich auch nach 56hr in Kultur. Unter den beschriebenen Bedingungen sind diese Zellen für mehrere Tage lebensfähig. Die interzelluläre Kommunikation kann durch die Stimulierung der Nervenwurzeln oder Verknüpfungen und der Aufnahme von Neuronen im Ganglion nachgewiesen werden. Stimulation dieser Nerven erzeugt robuste synaptische Potenziale und Aktionspotentiale in den verschiedenen Ganglienzellen. Spuren in 8B wurden aus einer Retzius Zelle in einem Ganglion, die aus dem Tier entfernt und in eine Schüssel fixiert worden war, aufgezeichnet. Die schwarze Kurve wurde von einem unterschwelligen Reiz mit einer extrazellulären Elektrode mit der Binde angewendet hervorgerufen. Die Erhöhung der Reizspannung verursacht die Zelle, um ein Aktionspotential (rote Kurve) zu feuern. Fluoreszierende Farbstoffe oder Meerrettich-Peroxidase in diese Zellen eingespritzt, um ihre Morphologie zu untersuchen. Lucifer Gelb wurde in einem Rz injiziertNeuron, indem ein negativer Strom durch die Elektrode. Eine Alternative ist, den Farbstoff zu injizieren mit Druckluftstößen. 9A zeigt den Farbstoff kurz nach der Injektion begann. Dreißig Minuten später war der Farbstoff bereits in die Nervenwurzeln (9B) gestreut. Die Art der Farbstoff hängt von der Anwendung, z. B. niedermolekulare Farbstoffe, die durch gap junctions passieren können, werden verwendet, um elektrische Synapsen zu identifizieren. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig1.jpg" width="600px" /> Fig. 1 ist. . Ventralen Blutegel Dissektion (A) Das Tier wird gründlich in einem Elastomer ausgekleideten Schale mit Kochsalzlösung gefüllt Blutegel merken Bauchseite nach oben (B) Eine flache Einschnitt überspannt den vorderen:. Hintere Achse wird nur lateral der Mittellinie, um eine Beschädigung der Nerven Mark. Das schwarze Blut Sinus (die Contains das Bauchmark) kann leicht gesehen werden. Beachten Sie das eine freiliegende Ganglien, die verglichen mit dem Mantel ist weiß. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig2.jpg" width="600px" /> Abbildung 2. Dissektion der schwarz Höhle. Das Blutgefäß (Pfeil) sollten sorgfältig auf einer Seite geschnitten, um das Bauchmark (Doppelpfeil) freizulegen. Lassen Segmente des Blutgefäßes intakt rund um die Segment Wurzeln für den Einsatz als Handgriff zu manipulieren das Bauchmark bei der Übertragung zwischen Präparation und Aufnahme Gerichte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 3"fo: content-width = &quot;3in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50631/50631fig3.jpg&quot; width = &quot;400px&quot; /&gt; Abbildung 3. Isolated Abschnitt der Bauchmark. Abstecken Bauchmark von den übrigen auf den Segment Wurzeln Blutgefäßfragmente und an den Enden der Segment Verknüpfungen macht die Ganglien für die elektrophysiologischen Ableitungen. Ein straff Dehnung der Ganglien ermöglicht es, die identifizierbare Zellkörper zu sehen und wird ein leichteres Eindringen der Glia-Hülle mit einem scharfen Glaselektrode ermöglichen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig4.jpg" width="600px" /> 4. Zelluläre Anatomie des Blutegels Ganglion. (A) Idealerweise werden die Retzius-Zellen (R) und andere große Zellkörper (P-Presseure, T-Touch, N-nozizeptiven, AE-Ring erector) wird Schematische Darstellung von Zellen in der Ganglien deutlich sichtbar sein, wenn das Mikroskop und Lichtkondensor richtig eingerichtet sind. (B). Leichte Unterschiede in der Lage der Somen wird in jedem Ganglion durch, wie die Ganglien gestreckt und fixiert straff auftreten. (C) Aktionspotentiale aus der Soma dieser Neurone aufgezeichnet haben charakteristische Wellenformen. Diese Spitzen wurden durch Injektion positiver Strom in die Zelle (Rechteckimpuls überlagert die Spannungs-Zeit-Spuren) hervorgerufen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig5.jpg" width="600px" /> Abbildung 5. Desheathing das Ganglion, einzelne Zellkörper zu entfernen. (A) Die Glia-Mantelsollte sorgfältig über die Ganglien geschnitten werden, um schädliche Zellen von Interesse zu vermeiden. Die rote Linie zeigt einen Schnitt trifft das Soma der Rz Neuronen zu vermeiden. Das Öffnen der Hülle gibt den Verdauungsenzymen Zugriff auf das Bindegewebe Matrix. (B) Gesunde Zellkörper aus dem prall Ganglion nach der Glia-Hülle geöffnet wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig5highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig6.jpg" width="600px" /> Abbildung 6. Kultivierung Neuronen aus dem Blutegel Ganglion. (A) Zellen werden aus der Ganglien abgesaugt mit einer Mikropipette und eine Schale mit Kulturmedium überführt. (B) Anzeige mehrere Zellen nebeneinander wird die Rate der Synaptogenese zwischen identifizierbaren Neuronen zu erhöhen. Hier ist die stumps von zwei Neuronen haben eine Synapse in Kultur zeigen leicht unterschiedliche elektrische Eigenschaften gebildet. (C) Neuronen. Die Top-Spuren zeigen synaptischen Potentiale durch die Stimulierung der benachbarten Zelle 7 Stunden und 56 Stunden, nachdem die Zellen wurden plattiert hervorgerufen. Die unteren Spuren wurden durch Injizieren von Strom direkt in einen der Rz-Zellen hervorgerufen. Beachten Sie die Erhöhung der synaptischen Potentialamplitude und ändern Sie in der Aktionspotentialwellenform nach 56 h in Kultur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig6highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig7.jpg" width="600px" /> Abbildung 7. Der Blutegel Ganglienkörperwand Vorbereitung für die Zuordnung rezeptiven Felder. (A) Ein Ansatz ist, einen ganzen Abschnitt der Körperwand zusammen mit 1-3 Ganglien zu entfernen. Hier werden die Wurzeln auf der einen Seite haben been Schnitt und die Ganglien wurde zur Seite merken. (B) A out merken Ganglion bei höherer Vergrößerung. (C) Ein weiterer Ansatz ist ein kleines Fenster in der Körperwand und Aufnahme von der intakten Ganglien zu schaffen, während die Zuordnung eines rezeptiven Feldes . (DG) Jedes der sensorischen Neuronen eine charakteristische Antwort auf eine mechanische Reiz. (d) eine leichte Berührung hervorruft Aktivität in T-Zellen, aber nicht in P-oder N-Zellen. (E) Die T-Zell-Antwort schaltet in Reaktion auf stärkere Stimuli, weicht Aktivierung des P-Zelle. Als der Reiz stärker die N-Zellen bekommt wird aktiviert (FG). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig7highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig8.jpg" width="600px" /> Figure 8. evozierte Aktivität in der Blutegel Ganglion. Extrazelluläre Stimulation der Verknüpfungen kann zur synaptischen Übertragung im Nervenstrang zu fahren. (A) Dies wird durch die Anbringung eines Saug-Elektrode zu einer der Verknüpfungen und Anlegen einer kleinen Spannung getan. Die scharfe Glaselektrode (Pfeil) zu sehen spießte eine Retzius Zelle in der Ganglien werden. (B) Spannungszeit-Spuren, die die Reizartefakt, gefolgt von einer synaptischen Potential (schwarz) und ein Aktionspotential (rot). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig8highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um zu vergrößern Bild</a> . <img alt="Fig. 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig9.jpg" width="600px" /> Abbildung 9. Injizieren Farbstoff in Blutegel Neuronen. (A) Lucifer Gelb können, indem Strom thro in die Soma injiziert werdenugh die Aufnahme Mikroelektroden. Eine Quecksilberlampe und FITC-Filtersatz kann dann verwendet werden, um die Fluoreszenz zu visualisieren. (B) Dye hat in den Rz diffuses Axone etwa 30 Minuten nach der Injektion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig9highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

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Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Dieser Artikel beschreibt drei Nervensystem Präparate mit Blutegeln: intrazelluläre Aufnahme von Neuronen im ventralen Ganglien, die Kultivierung von Neuronen ventralen Ganglien, und der Aufnahme von einem Patch von innerviert Haut Sinnesfelder abzubilden.

Die intrazelluläre Aufnahme, Sinnes Field Mapping und Kultivierung identifizierten Neuronen in der Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

intracellular-recording-sensory-field-mapping-culturing-identified

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

19.5K Aufrufe.  University of Kentucky.  Dieser Artikel beschreibt drei Nervensystem Präparate mit Blutegeln: intrazelluläre Aufnahme von Neuronen im ventralen Ganglien, die Kultivierung von Neuronen ventralen Ganglien, und der Aufnahme von einem Patch von innerviert Haut Sinnesfelder abzubilden. 

Serie: Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Analysieren Antworten der Maus Riechzellen Mit der Air-Phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

Live-Darstellung von PKC-Translokation in Sf9-Zellen und in Aplysia sensorischen Neuronen

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Flash-Photolyse von Caged Compounds in den Zilien der Riechzellen

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

Gleichzeitige Aufnahme von Calcium-Signale von identifizierten Neuronen und Fressverhalten von Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von identifizierten Neuronen im intakten Gehirn von transgenen Fischen

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

Ein Leitfaden zur<em&gt; In vivo</em&gt; Single-Unit-Aufnahme von Optogenetically Identifizierte kortikalen inhibitorischen Inter

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Elektrophysiologische Verfahren zur Aufzeichnung von intrazellulärer Spannung Antworten von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren und Inter auf Lichtreize<em&gt; In Vivo</em