Die Autoren bedanken sich für die Gemeinden in der Provinz Yunnan, Volksrepublik China und Agboville, Côte d&#39;Ivoire, für ihre Teilnahme an den oben beschriebenen Studien. Wir danken den lokalen Teams vor Ort, die bei der Prüfung und Durchführung der Protokolle unterstützt haben. Wir sind besonders dankbar für die folgenden Kollegen aus dem Schweizerischen Tropen-und Public Health-Institut: Yvette Endriss für die Bereitstellung der mikroskopischen Bildern, Hanspeter Marti und sein Team für Labor-Unterstützung und Stefanie Krauth für ihre Unterstützung während der Videoaufnahmen. Schließlich danken wir den zwei anonymen Gutachtern für eine Reihe von nützlichen Kommentare.

Ein. Kato-Katz-Technik <ol><li> Legen Sie eine Standard-Kato-Katz-Vorlage mit einem Loch zur Aufnahme 41,7 Milligramm (mg) des Stuhls auf einem Objektträger. </li><li> Scoop 2-3 Gramm (g) einer frischen Stuhlprobe auf ein Stück Zeitungspapier oder Aluminiumfolie, und drücken Sie ein Stück Draht oder Kunststoffgewebe nach oben, um Sieb es. </li><li> Verwendung einer kleinen Plastikspatel, kratzen die gesiebte Material aus dem Netz und vollständig füllt das Loch in der Kato-Katz Vorlage damit. Um überschüssige Fäkalmaterial zu entfernen, nivellieren den Inhalt des Lochs mit dem Spatel. </li><li> Senkrecht zu entfernen die Vorlage ohne die Fäkalien jetzt die Einhaltung der Objektträger. Die Vorlage und Spachtel kann in Wasser mit Reinigungsmittel gereinigt werden, und wieder verwendet. </li><li> Legen Sie ein Stück Zellophan, in Glycerin-Malachitgrün-Lösung für mindestens 24 Stunden (hr) vorgetränkt, über die Stuhlprobe auf dem Objektträger. </li><li> Um die Fäkalien in eine dicke Schmierschicht zu verbreiten, drücken Sie vorsichtig eine saubere Mikro-Geltungsbereich Schieber gegen die Probenobjektträger, gleichmäßigen Verteilen des Materials innerhalb eines Kreises mit einem Durchmesser etwas kleiner als die Breite des Mikroskopobjektträgers. </li><li> Lassen Sie die Folie für 30-60 Minuten (min), bei denen die Folien vor direkter Sonneneinstrahlung geschützt werden müssen löschen. Dann systematisch untersuchen die dicke Schmierschicht unter einem Lichtmikroskop (40-100-facher Vergrößerung). Zähle die Anzahl der STH Eier und schichten sie nach Arten (dh A.lumbricoides, T.trichiura und Hakenwürmer). Zu beachten ist, können andere Helmintheneier (zB Schistosoma mansoni) auch durch dieses Verfahren detektiert werden und sollte gezählt und getrennt erfasst. </li><li> Eine standardisierte Schätzung der Intensität der Infektion zu bekommen, die herkömmlich als Anzahl von Eiern pro Gramm Stuhl (EPG) ausgedrückt, multiplizieren das Ei Zählung um 24 (24 x 41,7 mg ≈ 1 g). </li></ol> 2. Baermann-Technik <ol><li> Richten Sie einen Stand, halten einen Glastrichter und befestigen einen Gummischlauch kann geschlossen witha Klammer, an der Unterseite des Trichters. </li><li> Legen Sie ein Sieb oder ein Stück Draht Bildschirm wie ein Kegel geformt, in den Trichter und die Schicht mit einem Stück von medizinischen Gaze. </li><li> Füllen Sie den Trichter mit Leitungswasser und sicherzustellen, dass das ganze Set-up nicht auslaufen. </li><li> Portionierer 20-30 g frischer Stuhl auf die Mitte des Verbandmull und sicherzustellen, dass sie vollständig in Wasser getaucht. Fügen Sie mehr Wasser, wenn nötig. Falten Sie die medizinische Gaze über der Probe. </li><li> Von unten, leuchten künstliche Licht am Trichter für 2 Stunden. </li><li> Drain 50 Milliliter (ml) des unteren Teils des Wassers in dem Trichter in ein Zentrifugenröhrchen durch leichtes Lösen der Clip auf den Gummischlauch. </li><li> Zentrifuge das gesammelte Wasser bei 600 xg (relative Zentrifugalkraft) für 5 min und vorsichtig aus dem Überstand ohne den Bodensatz. Bewahren Sie die letzten Tropfen in die Röhre. </li><li> Resuspendieren die Sediment-und Pipette 2 Tropfen der Lösung auf einen Objektträger und untersuchen die Folieunter einem Lichtmikroskop (40x Vergrößerung für die Erkennung und 100-400facher Vergrößerung für Arten Bestätigung). Erststufen-Larven (L1) von S. stercoralis sind lebendig und aktiv unter dem Mikroskop zu bewegen. </li></ol> 3. 20-m Shuttle Run Test <ol><li> Messen Sie einen 20-m flach und gerade Laufstrecke und markieren Sie es mit Zapfen. </li><li> Helfen Sie dem Testteilnehmer tragen eine Pulsuhr am Handgelenk und der entsprechenden Sender um die Brust 18. Dieses Gerät ermöglicht es die Herzfrequenz des Teilnehmers, die vor und nach dem Test gemessen werden und somit überwacht, ob die Teilnehmer hat maximaler Anstrengung ausgeübt. </li><li> Weisen Sie den Teilnehmer hin und her laufen auf dem Platz, indem Sie das Tempo der bespielten Ton-Signale Abgrenzung 20-m Runden. Beginnend mit einer Fahrgeschwindigkeit von 8,5 Kilometer pro Stunde (km / h), die Frequenz der Signale, die 20-m-Intervallen Erhöhungen von einem Äquivalent von 0,5 km / h alle min. </li><li> Stellen Sie sicher, thbei der Teilnehmer beginnt eine neue 20-m-Intervall jedes Mal ein Signal ertönt und beendet es, bevor das nächste Signal ankommt. </li><li> Stoppen Sie den Teilnehmer, wenn er / sie nicht das Tempo für zwei aufeinander folgende 20-m Abständen folgen. </li><li> Aufzuzeichnen höchste Fahrgeschwindigkeit für die letzte Intervall, das der Teilnehmer abgeschlossen vollständig zusammen mit dem Alter und Geschlecht des Teilnehmers angezeigt. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Herzfrequenz am Ende des Tests erreicht das Kind maximalen Herzfrequenz 19 ist. Wenn dies Herzfrequenz nicht erreicht wird, kann das Kind nicht maximaler Anstrengung ausgeübt haben, und damit sollte der Test wiederholt werden. </li><li> Schätzen Sie die maximale aerobe Kapazität (VO 2 max) des Teilnehmers, mit einer Gleichung, die weiter von Léger und Mitarbeiter: VO 2 max = 31,025 + 3,238 * Geschwindigkeit (in km / h) - 3,248 * (in Jahren) + 0,1536 * Geschwindigkeit (in km / h) * (in Jahren). </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse In Hinsicht aufSTH Diagnose mit der Kato-Katz Technik erlaubt eine einzigartige Merkmale der verschiedenen Helmintheneier zur Identifizierung der meisten Arten 20. Die Eier A.lumbricoides (ca. 45-75 Mikrometer (um) lang und 35-50 &amp;mgr; m breit, Abbildung 1) haben dickere Schalenwände als die Eier von T.trichiura (Abbildung 2) und Hakenwürmer (Abbildung 3). Ein befruchtetes Ei A.lumbricoides (Abbildung 1) hat eine äußere Eiweiss-Mantel, der es so aussehen goldbraun macht, während eine nicht befruchtete Eizelle fehlt diese Deckhaar und ist etwas länglich und insgesamt größer. Die Eier T.trichiura (ca. 50 &amp;mgr; m lang und 22 um breit, Abbildung 2) sind länglich und haben unterschiedliche polare Stecker. Hookworm Eier (ca. 64-76 um langen und 36 bis 40 um Breite, Figur 3), andererseits, haben eine sehr dünne Wand, gefolgt von einer klaren Ring um einen dichten Zellklumpenin der Mitte des Eis. S.stercoralis L 1 Larven (Abbildung 4) sind etwa 180-380 &amp;mgr; m lang und haben eine sehr kurze Mundhöhle. Eine deutliche Genitalbereich Primordium (markiert mit einem blauen Pfeil in Abbildung 4) können beobachtet werden und der Schwanz der Larven (markiert mit einem roten Pfeil in Abbildung 4) hat eine scharfe Ende. Da die tatsächlichen Auswirkungen der STH-Infektionen auf die körperliche Fitness von Kindern ist noch 13,14,15 diskutiert wird, gibt es keine repräsentative Ergebnis für ihre Auswirkungen an dieser Stelle. Interpretation der 20-m-Pendellauf Testergebnissen kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden. Die körperliche Fitness von Kindern zwischen infizierten und nicht-infizierten Patienten, die ähnlich in Bezug auf Alter und Geschlecht, andere potenziell einschlägigen Hygienevorschriften, sozioökonomischer Status und kulturelle Gewohnheiten verglichen werden. Dies kann in einer Querschnitterhebung 13,14,15 erfolgen, wo derSTH Infektionsstatus und körperliche Fitness von infizierten und nicht-infizierten Kinder werden zu einem bestimmten Zeitpunkt beurteilt. Die Stärke der Beweise wird höher sein, wenn nach einer randomisierten kontrollierten Studie Design, wo die körperliche Fitness der Kinder im schulpflichtigen Alter vor und nach Anthelminthikum / Placebo-Behandlung beurteilt wird, so dass sowohl für kurz-und langfristige Auswertung. Man kann weiter versuchen, eine mögliche Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen der Intensität der STH Infektionen und körperliche Fitness zu identifizieren und vergleichen unterschiedliche multiparasitism 1 mit der körperlichen Fitness. In der Arbeit von Yap und Mitarbeiter 15 dargestellt, wurde die körperliche Fitness, wie VO 2 max dargestellt, fand deutlich bei Kindern mit T.trichiura infiziert werden im Vergleich zu Kindern, die nicht mit T.trichiura infiziert wurden (Abbildung 5) reduziert . <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3966/3966fig1.jpg" /> Figu<html> . re 1 Mikroskopische Aufnahmen von A.lumbricoides Eier: befruchteten (A) und (B) unter 500-facher Vergrößerung nicht befruchtet. Maßstab = 50 um. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3966/3966fig2.jpg" /> Abbildung 2. Mikroskopische Aufnahme einer T.trichiura Ei unter 500-facher Vergrößerung. Maßstabsbalken = 50 um. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3966/3966fig3.jpg" /> Abbildung 3. Mikroskopische Aufnahme einer Hakenwurm Ei unter 500-facher Vergrößerung. Maßstab = 50 um. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3966/3966fig4.jpg" /> Abbildung 4. Mikroskopische Aufnahme einer S.stercoralis L 1 Larve unter 250x Vergrößerung. Die Pfeile zeigen die tail (rot) und genitale Primordium (blau). Maßstab = 100 um. d/3966/3966fig5.jpg &quot;/&gt; Abbildung 5. Graph zeigt die körperliche Fitness von Kindern mit T.trichiura infiziert im Vergleich zur physikalischen Fitness von Kindern nicht mit T. infiziert trichiura.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die drei Protokolle in diesem Papier beschrieben wurden getestet und im süd-westlichen Teil der Provinz Yunnan, Volksrepublik China unter den Mitgliedern der Bulang ethnische Minderheit 21 und in verschiedenen Teilen Afrikas 6,13,14 ausgeführt. Es gibt mehrere Vorlagen für die Kato-Katz-Technik. Jede einzelne Loch-Größe liefert eine deutliche Menge an Fäkalien. Für die Berechnung der EPGs, ist es daher notwendig, um die Einheit der Schablone kennen, um so die gez...

Hinweis: Materialien in dieser Liste sind generisch und kann aus verschiedenen Quellen gewonnen werden. <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Kato-Katz-Kit [400 Plastikschablonen mit einem Loch von 6 Millimeter (mm) (Durchmesser) in einem 1,5 mm dicken Matrize; 400 Kunststoffspatel, ein 20-m-Rolle Nylonsieb von 80 Maschenweite, ein 20-m-Rolle hydrophilen Cellophan, 34 um dick.] </td><td> Vestergaard Frandsen </td><td></td><td> Bitte beachten Sie, dass das Glycerin-Malachitgrün-Lösung ist nicht in diesem Kit enthalten, kann aber von jedem chemischen Lieferanten gekauft werden. </td></tr><tr><td> Glastrichter [ca. 8 Zentimeter (cm) breit und 6 cm tief] </td><td></td><td></td><td> Der Glastrichter für die Baermann Technik sollte bis etwa 60 ml Wasser zu halten. The Größe der Gummischlauch und Gaze ist abhängig von der Art der Glastrichter verwendet. </td></tr><tr><td> Biologisches Mikroskop </td><td> Olymp </td><td> CX21LED/CX21 </td><td></td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Shanghai Medical Instruments Group </td><td> 80 - 2T </td><td></td></tr><tr><td> Pre-aufgezeichneten Signale </td><td> Bitworks Design- </td><td> Team Bleep Test Version 1.3.1 </td><td> iPhone-Anwendung </td></tr><tr><td> Pulsuhr </td><td> POLAR </td><td> FT1 </td><td> Uhr und Sender </td></tr></tbody></table>

determining soil-transmitted helminth infection status and physical fitness of school-aged children

Soil-transmitted Helminthen (STH) Infektionen sind häufig. Tatsächlich sind mehr als 1 Milliarde Menschen betroffen, vor allem in den Entwicklungsländern, in denen Armut herrscht und Hygiene Verhalten, Wasserversorgung und sanitäre Einrichtungen sind oft mangelhaft 1,2. Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, und die beiden Hakenwurm Arten Ancylostoma duodenale und Necator americanus, sind die am weitesten verbreiteten STHS 3. Der geschätzte weltweite Belastung durch Hakenwurmkrankheit, Ascariasis und trichuriasis beträgt 22,1, 10,5 und 6,4 Millionen disability-adjusted life years (DALYs) bzw. 4. Darüber hinaus sind schätzungsweise 30 bis 100.000.000 Menschen mit Zwergfadenwurm, die am meisten vernachlässigten STH Arten von globaler Bedeutung, die wohl auch bewirkt eine erhebliche Auswirkungen auf die Volksgesundheit 5,6 infiziert. Multiple-Arten Infektionen (dh verschiedene STHS in einer einzigen Person hegte) sind weit verbreitet, und Infektionen wurden lin<html> ked gesenkt Produktivität und damit wirtschaftlichen Aussichten der Entwicklungsländer 1,3. Für die Diagnose der gemeinsamen STHS, empfiehlt die Weltgesundheitsorganisation (WHO) die Kato-Katz-Technik 7,8, was eine relativ einfache Methode zur Bestimmung der Prävalenz und Intensität solcher Infektionen ist. Es erleichtert die Erkennung von Parasiten Eier, die infizierten Patienten passieren in ihrem Kot. In Bezug auf die Diagnose von S.stercoralis, liegt keine einfache und genaue Tool zur Verfügung. Die Baermann Technik ist die am weitesten verbreiteten Verfahren zu dessen Diagnose. Das Prinzip hinter dem Baermann Technik ist, dass aktive S.stercoralis Larven wandern aus einem beleuchteten frischen Stuhlprobe als die Larven phototaktischen 9 sind. Es erfordert weniger anspruchsvollen Labor-Materialien und ist weniger zeitaufwendig als Kultur und immunologischen Methoden 5. t &quot;&gt; Begleiterkrankungen mit STH Infektionen reichen von akuten, aber häufige Symptome, wie Bauchschmerzen, Durchfall und Juckreiz, zu chronischen Symptomen wie Anämie, Unter-und Mangelernährung, und kognitive Beeinträchtigung 10. assoziiert Da die Symptome in der Regel unspezifisch sind und subtile sie oft unbemerkt, werden durch einen normalen Zustand betroffenen Individuen erlaubt, oder werden als Symptome von anderen Krankheiten, die häufiger möglicherweise in einem gegebenen Einstellung behandelt. Daher ist es denkbar, dass die tatsächliche Belastung von STH Infektionen durch Beurteilung unterschätzt Werkzeuge unter Berufung auf selbst ernannte Anzeichen und Symptome, wie es normalerweise der Fall in population-based Umfragen. In den späten 1980er und frühen 1990er Jahren, betonte Stephenson und Kollegen die Möglichkeit STH Infektionen Senkung der körperlichen Fitness der Jungen im Alter von 6-12 Jahren 11,12. Diese Linie der wissenschaftlichen Forschung gewonnenen neuen Schwung kurzem 13,14,15. Die 20-Meter (m) Shuttle Run Test wurde eine entwickelted von Léger et al. 16 validiert und wird weltweit eingesetzt, um die aerobe Fitness von Kindern 17 messen. Der Test ist einfach zu standardisieren und durchgeführt, wo ein 20-m lang und flach Laufstrecke und eine Audioquelle verfügbar sind, wodurch ihre Anwendung attraktiv beschränkten Ressourcen Einstellungen 13. Zur Erleichterung und Standardisierung Versuche der Beurteilung, ob STH Infektionen einen Einfluss auf die körperliche Fitness der Kinder im schulpflichtigen Alter haben, präsentieren wir Methoden, die STH Infektionen oder Maßnahme der körperlichen Fitness, die einfach auszuführen und dennoch genaue und reproduzierbare Ergebnisse sind zu diagnostizieren. Dies wird helfen, neue Erkenntnisse über die gesundheitlichen Auswirkungen der STH Infektionen erzeugen.

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Determining Soil-transmitted Helminth Infection Status and Physical Fitness of School-aged Children

Chronische Infektion mit Boden übertragenen Helminthen (STHS) verursacht Malabsorption, Verkümmerung und verschwenden in der heranwachsenden Kindes. Daher ist es plausibel, dass diese Infektionen auch zu einer Verminderung der körperlichen Fitness von Kindern. Hier visualisieren wir zwei Techniken für die Diagnose von STHS und der 20-Meter-Shuttle Run Test zur Beurteilung der Kinder körperliche Fitness.

Bestimmung Boden übertragenen Wurminfektionen Status und körperliche Fitness der School-Aged Children

Soil-transmitted helminth (STH) infections are common. Indeed, more than 1 billion people are affected, mainly in the developing world where poverty ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.3K Aufrufe.  Swiss Tropical and Public Health Institute, Basel, Switzerland. Chronische Infektion mit Boden übertragenen Helminthen (STHS) verursacht Malabsorption, Verkümmerung und verschwenden in der heranwachsenden Kindes. Daher ist es plausibel, dass diese Infektionen auch zu einer Verminderung der körperlichen Fitness von Kindern. Hier visualisieren wir zwei Techniken für die Diagnose von STHS und der 20-Meter-Shuttle Run Test zur Beurteilung der Kinder körperliche Fitness.

Serie: Determining Soil-transmitted Helminth Infection Status and Physical Fitness of School-aged Children

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination1-3.
Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 2974-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.
Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis7. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response8.
Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 &mu;m fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple Fc&gamma;Rs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of Fc&gamma;Rs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection9.

We present a high-throughput flow cytometric assay to determine the phagocytic activity of antigen-specific antibodies from clinical samples, utilizing fluorescent antigen-coated beads and a monocytic cell line expressing multiple Fc receptors&#x2014;providing receptor usage and phagocytic activity determinations in a standardized and reproducible fashion for any antigen of interest.

Die Bestimmung der Phagozytoseaktivität of Clinical Antikörper Proben

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

Mit den Eizellen<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Als ein<em&gt; In vivo</em&gt; Modell von Helminthen-induzierten Lungenentzündung

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

Analyse der Lungen-Reifung von dendritischen Zellen und Migration während der allergischen Atemwegsentzündung

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols to address these questions include colony count assays, gentamicin protection assays, and electron microscopy. Colony count and gentamicin protection assays only assess the viability of the entire bacterial population and are unable to determine individual bacterial viability. Electron microscopy can be used to determine the viability of individual bacteria and provide information regarding their localization in host cells. However, bacteria often display a range of electron densities, making assessment of viability difficult. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells. These assays were developed originally to assess survival of Neisseria gonorrhoeae in primary human neutrophils, but should be applicable to any bacterium-host cell interaction. These protocols combine membrane-permeable fluorescent dyes (SYTO9 and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), which stain all bacteria, with membrane-impermeable fluorescent dyes (propidium iodide and SYTOX Green), which are only accessible to nonviable bacteria. Prior to eukaryotic cell permeabilization, an antibody or fluorescent reagent is added to identify extracellular bacteria. Thus these assays discriminate the viability of bacteria adherent to and inside eukaryotic cells. A protocol is also provided for using the viability dyes in combination with fluorescent antibodies to eukaryotic cell markers, in order to determine the subcellular localization of individual bacteria. The bacterial viability dyes discussed in this article are a sensitive complement and/or alternative to traditional microbiology techniques to evaluate the viability of individual bacteria and provide information regarding where bacteria survive in host cells.

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells.

Fluoreszenz-Mikroskopie-Methoden zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Bakterien in Verbindung mit Säugerzellen

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

Gesamtproteinextraktion und 2-D Gelelektrophorese-Methoden für<em&gt; Burkholderia</em&gt; Arten

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

In vitro Coculture Assay zur Bewertung pathogeninduzierter Neutrophiler Transepithelmigration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

Paarweise Wachstum Wettbewerb Assay zur Bestimmung der Replication Fitness von Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in myelin destruction, which not only slows conduction of nerve impulses, but causes axonal injury resulting in motor and cognitive decline. Current treatments for MS focus on attenuating immune cell infiltration into the central nervous system (CNS). These treatments decrease the number of relapses, improving quality of life, but do not completely eliminate relapses so long-term disability is not improved. Therefore, therapeutic agents that protect the CNS are warranted. In both animal models as well as human patients with MS, T cell entry into the CNS is generally considered the initiating inflammatory event. In order to assess if a drug protects the CNS, any potential effects on immune cell infiltration or proliferation in the periphery must be ruled out. This protocol describes how to determine whether CNS protection observed after drug intervention is a consequence of attenuating CNS-infiltrating immune cells or blocking death of CNS cells during inflammatory insults. The ability to examine MS treatments that are protective to the CNS during inflammatory insults is highly critical for the advancement of therapeutic strategies since current treatments reduce, but do not completely eliminate, relapses (i.e., immune cell infiltration), leaving the CNS vulnerable to degeneration.

This protocol describes how to determine whether pharmacological treatments for experimental autoimmune encephalomyelitis show CNS protection as a consequence of suppressing immune cell infiltration or are neuroprotective during the onslaught of immune cell infiltration.

Die Bestimmung Unterdrückung des Immunsystems gegen ZNS-Schutz für pharmakologische Interventionen im Bereich der Autoimmun- Demyelinisierung

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness during infection of Golden Syrian hamsters. Tn-Seq combines random transposon mutagenesis with the power of high-throughput sequencing technology. Animals are challenged with a pool of transposon mutants (input pool), followed by harvesting of blood and tissues a few days later to identify and quantify the number of mutants in each organ (output pools). The output pools are compared to the input pool to evaluate the in vivo fitness of each mutant. This approach enables screening of a large pool of mutants in a limited number of animals. With minor modifications, this protocol can be performed with any animal model of leptospirosis, reservoir host models such as rats and acute infection models such as hamsters, as well as in vitro studies. Tn-Seq provides a powerful tool to screen for mutants with in vivo and in vitro fitness defects.

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

We describe here a technique that combines transposon mutagenesis with high-throughput sequencing to identify and quantify transposon leptospiral mutants in tissues after a challenge of hamsters. This protocol can be used to screen mutants for survival and dissemination in animals and can also be applied to in vitro studies.

Hochdurchsatz-parallele Sequenzierung Maßnahme Fitness Leptospira Interrogans Transposon Insertion Mutanten während Golden syrischen Hamster Infektion

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected antigen or a combination of antigens into a plasmid, which enables a tailor-made and safe design. The administration of DNA vaccines into host cells leads to the expression of antigens that stimulate both humoral and cell-mediated immune responses. This report describes a protocol for the cloning of antigen sequences into the pCMV-EGFP plasmid, the immunization of adult zebrafish with the vaccine candidates by intramuscular microinjection, and the subsequent electroporation to improve intake. The vaccine antigens are expressed as green fluorescent protein (GFP)-fusion proteins, which allows the confirmation of the antigen expression under UV light from live fish and the quantification of expression levels of the fusion protein with ELISA, as well as their detection with a western blot analysis. The protective effect of the vaccine candidates is tested by infecting the fish with Mycobacterium marinum five weeks postvaccination, followed by the quantification of the bacteria with qPCR four weeks later. Compared to mammalian preclinical screening models, this method provides a cost-effective method for the preliminary screening of novel DNA-based vaccine candidates against a mycobacterial infection. The method can be further applied to screening DNA-based vaccines against various bacterial and viral diseases.

Here we describe a protocol for the immunization of the adult zebrafish (Danio rerio) with a DNA-based vaccine and demonstrate the validation of a successful vaccination event. This method is suitable for the preclinical screening of vaccine candidates in various infection models.

Impfung von Erwachsenen Zebrafisch für die präklinische Screening von DNA-basierte Impfstoffe

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...