Name: cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products
Uploaded: 2015-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products at JoVE.com

The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).

HINWEIS: Alle Verfahren in diesem Protokoll werden in Übereinstimmung mit den Richtlinien, die von Großbritannien Home Office und der Universität von Edinburgh Veterinary Services eingestellt geführt. 1. Infektion der Mäuse durch Gavage <ol><li> Shop Heligmosomoides polygyrus L3-Larven in destilliertem Wasser für bis zu sechs Monate bei 4 ° C. </li><li> Vor Gebrauch waschen L3-Larven dreimal in destilliertem Wasser: Zentrifuge bei 300 xg für 10 Minuten (mit Bremse), entfernen Sie alle, aber 500 ul Wasser (um störende pelletiert L3-Larven zu vermeiden) und das Pellet jedes Mal. </li><li> Bei dem dritten Waschen, Wasser hinzufügen, um eine genaue Volumen (in der Regel 40 ml) und saugen Sie 20 ul mit 200 ul Spitze geschnitten, um ihre Öffnung zu erweitern. Platzieren zwei 20-ul-Proben auf der Oberfläche einer 60 mm Kulturschale und zählen die L3-Larven (üblicherweise mobil und am besten unter 50-facher Vergrößerung mit einem Präpariermikroskop betrachtet). Resuspendieren endgültige Pellet in destilliertem Wasser auf ein concentration von 2.000 L3 Larven pro ml. </li><li> Für Lebenszyklus Produktion, infizieren 8 Wochen alte F1 (C57BL / 6xCBA) Mäuse mit 400 H. polygyrus L3-Larven in 200 ul destilliertem Wasser durch orale Gabe (zurückhalten Mäuse in aufrechter Position durch das Genick des Halses und sanft passieren die stumpfe Sondennadel durch den Mund und Speiseröhre in den Magen). Gut geschüttelt, vor jeder Infektion (Larven begleichen schnell in Wasser) und saugen Sie 200 ul in einer 1 ml Spritze; einen dedizierten Sondennadel mit einem abgerundeten Ende. Für experimentelle Infektion von jüngeren Mäuse (6-8 Wochen alt) oder anderen Inzuchtstämme (z C57BL / 6 oder BALBc) infizieren Mäuse mit 200 L3 Larven. </li></ol> 2. Vermehrung und Pflege von H. polygyrus <ol><li> Zeigen Kohle in der Mitte eines großen Kunststoffwanne und lassen kaltes Leitungswasser, um über sie für mindestens 30 Minuten laufen (ungewaschen Aktivkohle ist giftig für L3-Larven). Lassen Sie das Wasser aus der Wanne und legen Sie die Holzkohle auf two saugfähiges Papier legen, so dass es bis zur vollständigen Trocknung der Raumluft ausgesetzt. </li><li> Wenn Eier erforderlich sind, kratzen Kot zuerst aus dem Dickdarm mit einer Pinzette (und Schere falls erforderlich). Wenn eine große Anzahl von L3-Larven erforderlich ist, platzieren Mäuse auf einem Drahtgitter und sammeln Kotpillen über mehrere Tage. </li><li> Mischen Sie die Fäkalien mit granulierte Aktivkohle bei einem Verhältnis von mindestens 1: 1, um eine Konsistenz zu erreichen nur feucht genug, um sich an Filterpapier. Schmieren Sie eine dünne Schicht auf der Mitte von etwas angefeuchteten Filterpapier in einer Petrischale und legen Sie diese in einer feuchten Box (fügen Sie einige feuchten Papiertuch und eine Schüssel mit Wasser) im Dunkeln für 12-14 Tage. </li><li> Entfernen L3-Larven von Tag 7 ab, und sammeln sie auf mindestens zwei Gelegenheiten, bevor das Papier wird verworfen. Die Larven bilden einen Ring rund um den Rand des Filterpapiers; Heben Sie das Filterpapier aus der Petrischale und spülen Sie die Larven, die der Platte gelassen werden (mit einer Pipette und 5 ml sterilem Wasser pro Platte) in einen 50-ml-Tube. </li><li> AufzugAus dem Filterpapier und ernten die restlichen Larven links auf der Platte mit destilliertem Wasser in einen 50-ml-Tube. Zentrifugieren Sie die abfließende Lösung bei 300 g für 10 min. Dreimal Waschen Sie die Larven mit destilliertem Wasser und dann bei 4 ° C lagern in bis zu 50 ml destilliertem Wasser, bis sie benötigt. HINWEIS: Die Larven bleiben lebensfähig und infektiös für mindestens 6 Monate. </li></ol> 3. Sammlung von Adult H. polygyrus Worms <ol><li> Bereiten Sie die modifizierten Baermann Apparat im Voraus, wie in Abbildung 1 dargestellt. </li><li> Cull Mäusen 14 Tage nach der Infektion. </li><li> Den Unterleib mit 70% Ethanol waschen. Schneiden Sie die Haut über den Bauch und ziehen Sie, um die vordere Bauchwand zu offenbaren. Stellen Sie Mittellinienschnitt, um die Bauchhöhle gelangen. </li><li> Nehmen Sie den gesamten Dünndarm und Dickdarm (Duodenum von proximal nach distal Rektum). Zeigen in eine trockene Petrischale. </li><li> Richten Sie den Darm über ihre gesamte Länge; Verbrauchsteuern die Fäkalien haltige Dick; legen Sie diese in eine separate Schüssel für Eierzubereitungen später. </li><li> Zuschneiden die proximalen 20 cm des Dünndarms, die die adulten Würmer von der relativ dicken Wand des Duodenums und oft eine rote Erscheinungsbild -identified aufgrund der intraluminalen Würmer enthält. In eine (Durchmesser 100 mm) Petrischale mit 5 ml Hanks-Lösung, erwärmt auf 37 ° C (zwei Exemplare pro Schale). </li><li> Öffnen Sie den Wurm-gefüllte proximalen Darmteil in Längsrichtung mit einer Schere (rund digen Schere sind am besten für diese), und kratzen im Inneren der Darmschleimhaut mit zwei Glasobjektträger um die Würmer zu entfernen. Dann werfen Sie die saubere Darmwand. </li><li> Tipp Würmer in kleine Musselin Taschen, Klammer geschlossen und mit Büroklammern um den Rand des Glastrichters (Abbildung 1). </li><li> Füllen Trichter mit Hanks-Lösung, geben Sie ca. 4 Petrischalen von Würmern in jeden Trichter. </li><li> Platz Gerät in 37 ° C-Inkubator für 1-2 h, Rühren sanft auf halbem Weg durch, um zu verdrängenSchmutz aus dem Darm Vorbereitung, die den Musselin Filter verstopfen können. Achten Sie darauf, um das Auslaufen von Schutt außerhalb des Musselinbeutel zu vermeiden - das wird eine Verunreinigung des letzten HES Vorbereitung verursachen. Erwachsene Würmer sollten langsam durch das Baumwolltuch migriert und an der Unterseite des Glasteströhrchen angesiedelt haben. Entfernen Sie vorsichtig das Reagenzglas aus dem Verbindungsgummischlauch über dem Waschbecken (dabei darauf achten, nicht zu verlieren Würmer an dieser Stelle). </li><li> Mit einem Kunststoff Pipette die Würmer in einen 50-ml-Tube und waschen sechsmal mit Hanks-Lösung (erlauben Würmer mit der Schwerkraft mit einer Stripette niederzulassen, zu entfernen Medien, 40 ml Hanks-Lösung, und wiederholen Sie fünf Mal). HINWEIS: Wurm Kultur muss ab diesem Zeitpunkt steril gehalten werden. <ol><li> Gehen Sie zu einer Steril und waschen weitere sechs Mal in steriler Hanks-Lösung mit 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin, bereit für die in-vitro-Kultur ergänzt. </li></ol></li><li> Zählen Sie dieerwachsenen Würmer, indem man zwei Proben von 20 ul mit einer gelben Spitze cut ergriffen, um ihre Öffnung zu erweitern erholt; erwarten, etwa 50% der Menge des inokulierten Larven. </li></ol> 4. Einrichten Kulturen für HES: Medium Vorbereitung, Waschen Erwachsene Worms <ol><li> Weichen die Würmer von 3,11 in etwa 10 ml RPMI, ergänzt mit 10% Gentamycin für 20 Minuten, so dass die Röhre ruht in einem Winkel, um sicherzustellen, Würmern vollständig abgedeckt werden. </li><li> Führen Sie diese in einer Steril: nachwaschen sechsmal mit Hanks-Lösung (ergänzt mit 5 U / ml Penicillin und 5 ug / ml Streptomycin). </li><li> Bereiten H. polygrus Medien. </li><li> Die Aufrechterhaltung der Sterilität in einem Abzug mit laminarer Strömung, um 500 ml des RPMI1640 Fügen 11,1 ml 45% Glukose (Endkonzentration 1,2% RPMI1640 enthält 0,2% Glucose), 5 ml 100x Peniclllin-Streptomycin (Endkonzentration 5 U / ml Penicillin, 5 &amp; ​​mgr; g / ml Streptomycin) versetzt, 5 ml L-Glutamin (Endkonzentration 2 mM), und5 ml Gentamycin (Endkonzentration 1%). Sie FCS hinzufügen nicht. </li><li> Aliquoten Würmer in entlüftet T25-Kolben, ca. 1.000 Würmer in 15 ml H. polygyrus Medien pro Kolben und Ort aufrecht in 37 ° C-Inkubator (5% CO 2) für 3 Wochen. </li></ol> 5. Herstellung von HES <ol><li> Sammeln HES haltigen Kulturmedien aus Kulturen in Abständen von nicht mehr als zweimal pro Woche, die Aufhebung der ersten Kollektion nach 24 Stunden der Kultur (durch den hohen Grad der LPS Verschmutzung und Wirtsproteinen - getrennt verarbeitet oder verworfen werden). Halten Sie jede Sammlung getrennt und deutlich mit dem Datum und Chargennummer versehen. Ersetzen Sie mit dem gleichen Volumen von H. polygyrus Medium auf jeder Gelegenheit. </li><li> Zentrifuge HES haltigen Medien bei 400 x g für 5 min. Dann filtern sterilisieren durch 0,2 um niedrige Proteinbindung Filter in 50 ml Tuben. Shop in der -20 ° C Gefrierschrank deutlich mit Datum der Wurm Ernte und das Datum der HES c gekennzeichnetollektion. </li><li> Nach 21 Tagen der HES Sammlung von Kultur, verwerfen Würmer. </li><li> Pool 500-1.000 ml HES Überstand (in der Regel aus der Tiefkühl, und nicht die, die die erste 24-Stunden-Sammlung) und einen 3.000 MWCO-Filter in der Ultrafiltrationsvorrichtung zu konzentrieren auf unter Stickstoffdruck. HINWEIS: Achten Sie sorgfältig darauf, den Filter trocken laufen lassen. <ol><li> So richten Sie das Filtergerät, zuerst die 3 kDa Membran glänzende Seite in einem 1-Liter-Becher sich gründlich mit destilliertem Wasser für 3 x 20 Minuten unter Rühren. Montieren Sie die Ultrafiltrationsvorrichtung nach Angaben des Herstellers mit Filtermembran glänzenden Seite nach oben. Platz im Schrank bei 4 ° C erwärmt und 50 ml destilliertem Wasser durch, bevor Sie sich auf die Sammel HES konzentrieren. </li><li> Fügen jedes Rohr von HES in die Filtrationsvorrichtung nach Bedarf (100-140 ml pro Tag), bis das Volumen 2-5 ml eingeengt wird. </li></ol></li><li> Um Verunreinigungen von der HES-enthaltende Kulturmedien zu entfernen, 50 ml pyr hinzufügenogen freien PBS zu der Filtervorrichtung und dann konzentrieren sich auf ca. 2 ml. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal (150 ml PBS insgesamt). Übertragen HES in einen 15-ml-Röhrchen, filtersterilisieren (mit einem 0,2-um-Filter) in einer Haube mit laminarer Strömung und Messen der Proteinkonzentration unter Verwendung eines Spektrophotometers (E 280 = 10) oder mit dem Bradford-Assay. </li><li> Aliquot, Label mit Chargennummer und das Datum und die Gefriert bei -80 ° C. </li><li> Führen eines chromogenen LAL Assay nach den Protokollen des Herstellers für jeden Ansatz durch HES vor der Verwendung. Wenn LPS Niveau von größer als 1 U LPS pro 1 ug Protein sind, sollten Sie nicht mit dieser Charge für in vivo-Experimenten oder in vitro-Kulturen. </li><li> Verarbeiten Sie die bei 24 Stunden getrennt in der gleichen Art und Weise gesammelt HES; es wird LPS und einige Wirtsproteine ​​enthalten und, obwohl sie nicht für verschiedene Experimente ist es eine nützliche Quelle von einzelnen Molekülen, die durch den monoklonalen Antikörper der Affinitätsreinigung isoliert werden kann. </li></ol&gt;

The authors have no conflicts of interest.

Der Lebenszyklus von H. polygyrus Erlöse in einer konsistenten Art und Weise zuverlässig. Nach Natur Verschlucken oder orale Gabe von L3-Larven am Tag 0, beginnen Zysten unter der Zwölffingerdarm-Serosa von Tag 5 zu bilden, voran zu Larven Häutungen und Schwellenländern als erwachsenen Würmer in das Darmlumen von Tag 10, können Eier im Kot aus gesehen werden Tag 14 und Granulome auf der duodenalen Serosaoberfläche von Tag 21. Die oben beschriebenen (und in Figur 6 zusammengefaßt) -Protokoll sichtbar ermöglicht Produktion mit hohem Durchsatz von H. polygyrus Ausscheidungs-Sekretionsprodukte (HES), zusätzlich zum zuverlässigen Wiederherstellung lebensfähiger L3-Larven für zukünftige experimentelle und Lebenszyklus-Infektionen. H. polygyrus Infektion hat sich gezeigt Schutz in Modellen von Asthma abhängig von OVA oder Der p 1 (Hausstaubmilben-Allergen) 14 sein. Darüber hinaus könnte die Unterdrückung der Atemwegsentzündung mit CD4 + CD25 + übertragen werden </sup&gt; regulatorischen T-Zellen 14 oder CD19 + CD23 hallo regulatorischen B-Zellen 24 aus nicht-sensibilisierten, H. polygyrus infizierten Mäusen. Bei den Modellen der Autoimmunität, H. polygyrus Infektion wurde gezeigt suppressive in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) -Modell von Multipler Sklerose 9 zu sein, und die Unterdrückung kann entweder mit CD4 + T-Zellen oder CD19 + B-Zellen aus infizierten Mäusen 24 übertragen werden. Heligmosomoides polygyrus Ausführungs sekretorischen Produkten (HES) modulieren die Immunantwort des Wirts und Th2-vermittelte Entzündung unterdrücken, indem eine Reihe von Mechanismen (in Abbildung 7 beschrieben), einschließlich: a) Hemmung der dendritischen Zellen gegenüber Stimulation 25, b) Induktion von CD4 + Foxp3 + regulatorischen T-Zellen 18. und c) die Blockierung von IL-33 Produktion 20. HES hat sich gezeigt, schützend zu sein, wenn sie verabreicht eint Sensibilisierung oder Herausforderung in der OVA-Alaun-Modell von Asthma 19 und auch, wenn intranasal mit Alternaria Extrakt Allergen 20 verabreicht, durch Unterdrückung der frühen IL-33 Freisetzung. Vermeidung der LPS Kontamination von HES ist oft von entscheidender Bedeutung für den Erfolg der Zukunft immunologischen Experimenten. Im Protokoll hier skizzierten die kritischen Schritte bei der Erreichung dieses sind, dass innerhalb der Musselin Taschen der Baermann Gerät nicht in die endgültige HES Zubereitung enthaltenen Schmutz zu gewährleisten (siehe 2.10) und zur Seite zu ES-Lösung aus der ersten 24 Stunden der Kultur gesetzt (siehe 5.1). In den letzten Jahren HES wurde gründlich an der Proteom-Ebene mit mehr als 370 identifiziert 26,27 unterschiedliche Proteine ​​aus. Darüber hinaus hat ES aus dem 4. Larvenstadium zu Proteomanalyse 28 unterzogen. Laufende Arbeiten Charakterisierung der Hauptkomponenten von Glycan HES bekannte stark immunogen 3 zu sein, und sezernierten Mikro RNWie die in 50 bis 100 nm Bläschen oder Exosomen (Buck et al., Zur Publikation eingereicht) gekapselt. Mit der Gründung der reproduzierbaren Protokolle für die Sammlung von ES aus diesem hoch immunmodulatorische Parasiten und mit umfangreichen proteomische Daten zur Identifizierung der molekularen Komponenten von HES ist die Bühne nun für die Identifizierung und therapeutische Prüfung einzelner Moleküle aus H. eingestellt polygyrus die Schlüssel Auswirkungen auf das Immunsystem des Wirts zu vermitteln können.

Heligmosomoides polygyrus ist ein natürlicher Maus-Magen-Darm-Helminthen, die eng mit hoch vorherrschende menschliche Nematodparasiten 1 verbunden ist. Im Gegensatz zu anderen Nematoden Modelle wie Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus konsequent stellt eine chronische Infektion in Mäusen als eine direkte Folge von mehreren leistungsstarken immunmodulatorische Mechanismen beschäftigt, um die Immunantwort des Wirts 2 zu unterdrücken. H. polygyrus hat einen direkten Lebenszyklus: infektiösen L3-Larven werden von feco-orale Übertragung aufgenommen (oder durch orale Gabe in der Laborumgebung verabreicht), worauf sie wandern zum subseröse Schicht des Zwölffingerdarms und encyst vor der Rückkehr in das Darmlumen als erwachsenen Würmer etwa acht Tage nach der ersten Infektion. Paarung und Eierproduktion tritt am Tag 10 und es ist möglich, adulte Würmer für Kultur und Sammlung von Ausscheidungs-sekretorischen Produkte da ernteny 14 ab 3. H. polygyrus interagiert auch mit der kommensalen Mikroflora, mit erhöhter Milchsäurebakterien vorhanden in infizierten Mäusen anfällig 4-6, und ein höheres Maß an H. polygyrus Infektion nach Exposition von Mäusen auf Laktobazillen 6. Aktive Infektion mit H. polygyrus wurde gezeigt, dass gegen Immunpathologie in vielen Tiermodellen für Autoimmunität 7-10 schützen, Colitis 11,12 und Allergien 13-16. Daher gab es großes Interesse an dem Potenzial der Ausscheidungs-Sekretorische Moleküle aus diesem Parasiten (&quot;HES&quot;), um nach unten zu modulieren Pathologie in vivo 17,18. Tatsächlich werden schützende Wirkung nach der Behandlung der Mäuse mit HES-Produkte 19 über Pfade, die jetzt identifiziert 18,20 ersichtlich. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die zuverlässige Herstellung von Heligmosomoides polygyrus und Wiederherstellung ihrer abgesondert Produktedaß weiter eine Reihe von funktionellen biochemische und immunologische Untersuchungen verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Amicon concentrator</td><td>Millipore</td><td>5112</td><td>Model 8050 50 ml&lt;br/&gt; http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM&lt;br/&gt; _NF-5122</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; buffered salt solution</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td>500 ml&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>100 ml&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 MM 100ml&lt;br/&gt; https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td></tr><tr><td>Activated charcoal</td><td>Merck</td><td>1.09624.0500</td><td>18-35 mesh&lt;br/&gt; http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td></tr><tr><td>Glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>100 ml 45% solution&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Falcon tubes</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>50 ml&lt;br/&gt; http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td></tr><tr><td>T25 Flasks</td><td>Sigma</td><td>CLS430639&amp;nbsp;</td><td>25cm vented flask&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Chromogenic LAL assay</td><td>Lonza</td><td>50-647U</td><td>QCL-1000 assay&lt;br/&gt; http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>100 ml&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>500 ml; without L-glutamine&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td></tr></tbody></table>

cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products

Heligmosomoides polygyrus (früher Nematospiroides dubius bekannt und auch von einigen als H. bakeri bezeichnet) ist ein gastrointestinaler Helminthen, die mehrere immunmodulatorische Mechanismen einsetzt, um eine chronische Infektion in Mäusen herzustellen und ähnelt vorherrschenden menschlichen Wurminfektionen. H. polygyrus wurde ausgiebig auf dem Gebiet der Wurm abgeleitete Immunregulation studiert und hat sich als potent drücken experimentellen Modellen von Allergie und Autoimmunität (beide mit einer aktiven Infektion und isoliert abgesondert Produkte). Die in diesem Papier beschriebene Protokoll beschreibt Verwaltung des H. polygyrus Lebenszyklus für eine konsistente Produktion von L3-Larven, die Verwertung von erwachsenen Parasiten und Sammlung ihrer Ausscheidungs-Sekretionsprodukte (HES).

Die Anfälligkeit für eine Infektion mit H. polygyrus wird zu einem großen Teil durch den genetischen Hintergrund der Mausstamm (Tabelle 1) gesteuert wird; C57BL / 6 und CBA-Mäusen sind sehr anfällig 21,22. Für die Versorgung der Lebenszyklus des Parasiten hat die F1-Hybride zwischen diesen beiden Stämmen für seine Fähigkeit, sehr viel höher Wurmlast ohne Morbidität (übermäßige Darmepithelzellen Schäden) zu widerstehen, verglichen mit entweder Elternstamm ausgewählt. Oralsonde 400 L3 Larven wird der Lebenszyklus in F1-Mäuse zu erhalten (was zu Erwachsenen in 2 gezeigt Wurmlast), während eine Dosis von 200 L3 Larven wird allgemein für Experimente bei homozygoten Inzuchtstämmen (beispielsweise C57BL / 6 verwendet oder BALBc). Allerdings müssen diese Dosierung kann je nach Umgebungs Cofaktoren, die zwischen Tierhaltung, wie Schwankungen der Darmflora unterscheiden können reduziert werden. Chargen von HES haben reproduzierbare effi bewährtsamkeit in funktionellen Assays und Protein-Zusammensetzung; Außerdem, wenn Überstände von jedem aufeinanderfolgenden Woche Kultur wurden analysiert, bis zu insgesamt 4 Wochen wurden die Proteinprofile gefunden, sehr ähnlich (Figur 3). Wenn HES Konzentration wird mittels Bradford-Test gemessen (siehe 5.5) werden die Gesamt Protein ist in der Regel etwa 1 mg / ml (Figur 4). Ein alternatives Verfahren zum Konzentrieren von HES mit einem Zentrifugenkonzentrator (zB Vivaspin 3 kDa cut-off Membran), in denen die Proben werden auf bis zu 4.000 g in einem Ausschwingrotor Zentrifuge, Entfernen Puffersalze und niedrigmolekulare Bestandteile. Kreisel Konzentration ist am besten für kleine Verarbeitungsmengen (1-10 ml) geeignet und sind auf eine maximale Konzentration etwa den Faktor 30x begrenzt. Beim Sammeln von HES, ist die Vermeidung der Kontamination von entscheidender Bedeutung. Um eine Kontamination mit Gastmolekülen zu vermeiden, entsorgen wir HES-containing Kulturmedien von der ersten 24 Stunden nach der erwachsene Wurm Ernte aus dem Mausdarm. Wir die Höhe der LPS Verschmutzung quantifizieren auch in jeder Charge von HES mit einem chromogenen LAL-Test (siehe 5.7). 1 U LPS entspricht ~ 100 pg LPS und Ebenen darunter werden als vernachlässigbar angesehen 23. In unseren Händen, die meisten Partien von HES deutlich unter dieser Grenze, die mittlere Konzentration von LPS in HES als 0,23 U / ug (Abbildung 5). Die Wirkungen von LPS in in vivo-Modellen der Pathologie (zum Beispiel die Unterdrückung von asthmatischen Reaktionen) benötigt mindestens 10 ng LPS 23. Daher in vivo-Verabreichung von 5 ug HES aus einer Charge mit 100 pg LPS / ug HES umfasst 500 pg LPS deutlich unter die effektive Konzentration in dem LPS zu einem Problem. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> Abbildung 1: Baermann Apparat BaerMann Versuchsaufbau für die Sammlung von Erwachsenen H. polygyrus (wie in Kapitel 2 beschrieben). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> Abbildung 2: Mittlere Worm Burden 14 Tage nach der Infektion mit 400 L3 Larven Mittlere Wurm belastet 14 Tage nach der Infektion mit 400 L3-Larven. Gezeigten Datenpunkte sind aus 19 separaten Runden der Infektion von C57BL / 6xCBA Mäusen. Mittelwert ± SEM dargestellt. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> Abbildung 3: Proteinprofile von HES aus aufeinanderfolgenden Wochen in Kultur SDS-PAGE-Profil von HES-Proteine ​​in aufeinander folgenden Wochen der Kultur gesammelt. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> Abbildung 4: </strong&gt; Endmenge von HES 500 ml ES-haltigen Medien Die Ausbeute an HES-Protein aus 11 verschiedenen Chargen von ca. 500 ml Kulturüberstand stammt. Mittelwert ± SEM dargestellt. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> Abbildung 5: LPS Kontamination von HES Ebenen LPS Kontamination in 41 Chargen von HES durch die Limulus ameobocyte Assay gemessen. Median LPS-Konzentration = 86 U pro mg HES. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> Abbildung 6: Schematische Darstellung der Animated H. polygyrus Lebenszyklus Zusammenfassung der wichtigsten Phasen des Lebenszyklus von orale Gabe von L3-Larven, durch Rückgewinnung von Larven und erwachsenen Würmer zu Isolierung von HES. Abbildung 7: Schematische Darstellung der Animated HES und ihre Funktionen Taste immunmodulatorische Effekte von in HES enthaltenen löslichen Mediatoren und Exosomen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotype (und Hintergrund Stamm) </td><td> Primäre Infektion Phänotyp </td><td> Hinweis </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inzuchtstämmen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J, CBA, C3H </td><td> Sehr anfällig </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 und C57BL / 10 </td><td> Anfällig </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / c, DBA / 2, 129 / J </td><td> Zwischen- </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> Geringe Empfindlichkeit </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgene für Cytokine oder Cytokinrezeptoren </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> Anfälliger </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> Weniger anfällig (a); keine Änderung in der Empfindlichkeit, sondern erhöht Granulome (b) </td><td> (A) 33 </td></tr><tr><td> (B) 34 </td></tr><tr><td> IL-2R &amp; beta; Transgenic (C57BL / 6) </td><td> Beständig </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> Höhere Fruchtbarkeit </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R-- / - (C57BL / 6 und BALB / c) </td><td> Sehr anfällig </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (BALB / c oder C57BL / 6) </td><td> Highly Resistant </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 Transgenic(FVB) </td><td> Beständig </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Mangel Th2, verringert Granulom gormation </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / c) </td><td> Anfälliger </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) </td><td> Keine Veränderung der Empfindlichkeit </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> Hohe Th1, Erhöhte Anfälligkeit </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgene für die T-Zell-Marker </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / c) </td><td> Geringfügig höheren Fruchtbarkeit </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) </td><td> Höhere Fruchtbarkeit </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / c) </td><td> Höhere Fruchtbarkeit &amp;# 160; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgene für angeborene Immun loci </td><td></td></tr><tr><td> Typ-1-Interferon-Rezeptor (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> Höhere Fruchtbarkeit, mehr Granulome </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> Widerstandsfähiger, mehr Granulome </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / Wv (WBB6) </td><td> Anfälliger </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Primäre Infektion mit H. polygyrus in genetisch unterschiedliche und gezielte Gen-Mausstämme.

Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products at JoVE.com

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus ein Maus Nematoden mit starken immunmodulatorischen Fähigkeiten, ähneln denen von hoch vorherrschende menschliche Wurminfektion. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die langfristige Wartung der H. polygyrus Lebenszyklus.

Der Anbau von<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Eine immunmodulatorische Nematode Parasite und seine Secreted Produkte

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

cultivation-heligmosomoides-polygyrus-an-immunomodulatory-nematode

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

18.2K Aufrufe.  University of Edinburgh.  Heligmosomoides polygyrus ein Maus Nematoden mit starken immunmodulatorischen Fähigkeiten, ähneln denen von hoch vorherrschende menschliche Wurminfektion. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die langfristige Wartung der H. polygyrus Lebenszyklus. 

Serie: Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. Infective eggs are given by oral gavage, hatch in the distal small intestine, invade the intestinal epithelial cells (IECs) 
that line the crypts of the cecum and proximal colon and upon maturation the worms release eggs into the environment1. This model is a powerful tool to 
examine factors that control CD4+ T helper (Th) cell activation as well as changes in the intestinal epithelium. The immune response that occurs in 
resistant inbred strains, such as C57BL/6 and BALB/c, is characterized by Th2 polarized cytokines (IL-4, IL-5 and IL-13) and expulsion of worms while Th1-associated 
cytokines (IL-12, IL-18, IFN-&gamma;) promote chronic infections in genetically susceptible AKR/J mice2-6. Th2 cytokines promote physiological changes in 
the intestinal microenvironment including rapid turnover of IECs, goblet cell differentiation, recruitment and changes in epithelial permeability and smooth muscle 
contraction, all of which have been implicated in worm expulsion7-15. Here we detail a protocol for propagating Trichuris muris eggs which can 
be used in subsequent experiments. We also provide a sample experimental harvest with suggestions for post-infection analysis. Overall, this protocol will provide 
researchers with the basic tools to perform a Trichuris muris mouse infection model which can be used to address questions pertaining to Th proclivity in 
the gastrointestinal tract as well as immune effector functions of IECs.

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris infection is an intestinal model of Th2 immunity where resistant mice generate a protective Th2 response and susceptible mice generate a pathological Th1 response.

Trichuris muris Infektion: Ein Modell des Typ-2-Immunität und Entzündung im Darm

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Forschung

Immunologie und Infektion

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (EPN) (Steinernematidae and Heterorhabditidae) have a mutualistic partnership with Gram-negative Gamma-Proteobacteria in the family Enterobacteriaceae. Xenorhabdus bacteria are associated with steinernematids nematodes while Photorhabdus are symbionts of heterorhabditids. Together nematodes and bacteria form a potent insecticidal complex that kills a wide range of insect species in an intimate and specific partnership. Herein, we demonstrate in vivo and in vitro techniques commonly used in the rearing of these nematodes under laboratory conditions. Furthermore, these techniques represent key steps for the successful establishment of EPN cultures and also form the basis for other bioassays that utilize these organisms for research. The production of aposymbiotic (symbiont&#8211;free) nematodes is often critical for an in-depth and multifaceted approach to the study of symbiosis. This protocol does not require the addition of antibiotics and can be accomplished in a short amount of time with standard laboratory equipment. Nematodes produced in this manner are relatively robust, although their survivorship in storage may vary depending on the species used. The techniques detailed in this presentation correspond to those described by various authors and refined by P. Stock&#8217;s Laboratory, University of Arizona (Tucson, AZ, USA). These techniques are distinct from the body of techniques that are used in the mass production of these organisms for pest management purposes.

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae

The goal of this presentation is to demonstrate in vivo and in vitro techniques for the rearing of entomopathogenic nematodes. In vivo methods consider the rearing of these nematodes with an insect host, whereas the in vitro methods utilize rich agar media.

In-vivo-und In-vitro-Aufzucht von Nematoden (Steinernematidae und Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (EPN) (Steinernematidae and Heterorhabditidae) have a mutualistic partnership with Gram-negative Gamma-Proteobacteria in the ...

Biotechnik

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Visualisierung Bakterien in Nematoden durch Fluoreszenzmikroskopie

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Biologie

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the context of the intestines. Recently, ecological sampling of wild Caenorhabditis nematodes has discovered a diverse array of associated microbes, including bacteria, viruses, fungi, and microsporidia. Many of these microbes have interesting colonization or infection phenotypes that warrant further study, but they are often unculturable. This protocol presents a method to enrich the desired intestinal microbes in C. elegans and related nematodes and reduce the presence of the many contaminating microbes adhering to the cuticle. This protocol involves forcing animals into the dauer stage of development and using a series of antibiotic and detergent washes to remove external contamination. As dauer animals have physiological changes that protect nematodes from harsh environmental conditions, any intestinal microbes will be protected from these conditions. But, for enrichment to work, the microbe of interest must be maintained when animals develop into dauers. When the animals leave the dauer stage, they are singly propagated into individual lines. F1 populations are then selected for desired microbes or infection phenotypes and against visible contamination. These methods will allow researchers to enrich unculturable microbes in the intestinal lumen, which make up part of the natural microbiome of C. elegans and intracellular intestinal pathogens. These microbes can then be studied for colonization or infection phenotypes and their effects on the host fitness.

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Wild Caenorhabditis nematodes are associated with many microbes, often in the gut lumen or infecting the intestine. This protocol details a method to enrich unculturable microbes colonizing the intestine, taking advantage of the resistance of the dauer cuticle.

Selektive Reinigung von wilden Caenorhabditis-Nematoden zur Anreicherung von Darmmikrobiombakterien

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the ...

Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection

The genus Strongyloides consists of multiple species of skin-penetrating nematodes with different host ranges, including Strongyloides stercoralis and Strongyloides ratti. S.&#160;stercoralis is a human-parasitic, skin-penetrating nematode that infects approximately 610 million people, while the rat parasite S.&#160;ratti is closely related to S.&#160;stercoralis and is often used as a laboratory model for S.&#160;stercoralis. Both S.&#160;stercoralis and S.&#160;ratti are easily amenable to the generation of transgenics and knockouts through the exogenous nucleic acid delivery technique of intragonadal microinjection, and as such, have emerged as model systems for other parasitic helminths that are not yet amenable to this technique.
Parasitic Strongyloides adults inhabit the small intestine of their host and release progeny into the environment via the feces. Once in the environment, the larvae develop into free-living adults, which live in feces and produce progeny that must find and invade a new host. This environmental generation is unique to the Strongyloides species and similar enough in morphology to the model free-living nematode Caenorhabditis elegans that techniques developed for C. elegans can be adapted for use with these parasitic nematodes, including intragonadal microinjection. Using intragonadal microinjection, a wide variety of transgenes can be introduced into Strongyloides. CRISPR/Cas9 components can also be microinjected to create mutant Strongyloides larvae. Here, the technique of intragonadal microinjection into Strongyloides, including the preparation of free-living adults, the injection procedure, and the selection of transgenic progeny, is described. Images of transgenic Strongyloides larvae created using CRISPR/Cas9 mutagenesis are included. The aim of this paper is to enable other researchers to use microinjection to create transgenic and mutant Strongyloides.

Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection

The functional genomic toolkit for the parasitic nematodes Strongyloides stercoralis and Strongyloides ratti includes transgenesis, CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis, and RNAi. This protocol will demonstrate how to use intragonadal microinjection to introduce transgenes and CRISPR components into S.&#160;stercoralis and S.&#160;ratti.

Erzeugung von Transgenics und Knockouts in Strongyloides-Spezies durch Mikroinjektion

The genus Strongyloides consists of multiple species of skin-penetrating nematodes with different host ranges, including Strongyloides stercoralis and ...

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in their progeny and promote survival. While inherited immunity has been reported in many invertebrates, the mechanisms underlying this epigenetic phenomenon are largely unknown. The infection of Caenorhabditis elegans by the natural microsporidian pathogen Nematocida parisii results in the worms producing offspring that are robustly resistant to microsporidia. The present protocol describes the study of intergenerational immunity in the simple and genetically tractable N. parisii -C. elegans infection model. The current article describes methods for infecting C. elegans and generating immune-primed offspring. Methods are also given for assaying resistance to microsporidia infection by staining for microsporidia and visualizing infection by microscopy. In particular, inherited immunity prevents host cell invasion by microsporidia, and fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used to quantify invasion events. The relative amount of microsporidia spores produced in the immune-primed offspring can be quantified by staining the spores with a chitin-binding dye. To date, these methods have shed light on the kinetics and pathogen specificity of inherited immunity, as well as the molecular mechanisms underlying it. These techniques, alongside the extensive tools available for C. elegans research, will enable important discoveries in the field of inherited immunity.

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

The infection of Caenorhabditis elegans by the microsporidian parasite Nematocida parisii enables the worms to produce offspring that are highly resistant to the same pathogen. This is an example of inherited immunity, a poorly understood epigenetic phenomenon. The present protocol describes the study of inherited immunity in a genetically tractable worm&#160;model.

Untersuchung der vererbten Immunität in einem Caenorhabditis elegans Modell der Mikrosporidieninfektion

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

Kultivierung und genetische Manipulation entomopathogener Nematoden

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response against helminth infections, where it plays an important role in the expulsion of the parasite. In a murine model of Nippostrongylus brasiliensis infection, IL-9 is produced mainly by CD4+ T lymphocytes and innate lymphoid cells found in the lung, small intestine, and draining lymph nodes. Given the technical difficulties involved in the intracellular staining of IL-9, as well as the complexity of isolating hematopoietic cells from the small intestine upon infection, there is a pressing need for a comprehensive but straightforward protocol to analyze the expression of IL-9 in different lymphoid and non-lymphoid tissues in this model. The protocol described here outlines the kinetics of IL-9 produced by CD4+ T cells and innate lymphoid cells in the lung and small intestine, the main organs targeted by N. brasiliensis, as well as in the mediastinal and mesenteric lymph nodes, throughout the infection. In addition, it details the number of larvae needed for infection, depending on the cell type and organ of interest. This protocol aims to assist in the standardization of assays to save time and resources by offering the opportunity to focus on the specific cells, organs, and disease stages of interest in the N. brasiliensis infection model.

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9-expressing T and ILC2 cells are induced during N. brasiliensis infection, yet their characterization has been largely overlooked in the infected intestine due to their low frequency and differential kinetics. This protocol describes the isolation of these cells from different target organs and confirmation of their identity via flow cytometry at different infection stages.

Eine Strategie für die Untersuchung von IL-9-produzierenden lymphatischen Zellen im Nippostrongylus brasiliensis-Infektionsmodell

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...

NAD(P)H Fluorescence Lifetime Imaging for the Metabolic Analysis of the Murine Intestine and Parasites During Nematode Infection

Parasites generally have a negative effect on the health of their host. They represent a huge health burden, as they globally affect the health of the infested human or animal in the long term and, thus, impact agricultural and socio-economic outcomes. However, parasite-driven immune-regulatory effects have been described, with potential therapeutic relevance for autoimmune diseases. While the metabolism in both the host and parasites contributes to their defense and is the basis for nematode survival in the intestine, it has remained largely understudied due to a lack of adequate technologies. We have developed and applied NAD(P)H fluorescence lifetime imaging to explanted murine intestinal tissue during infection with the natural nematode Heligmosomoides polygyrus to study the metabolic processes in both the host and parasites in a spatially resolved manner. The exploitation of the fluorescence lifetime of the co-enzymes nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH), hereafter NAD(P)H, which are preserved across species, depends on their binding status and the binding site on the enzymes catalyzing metabolic processes. Focusing on the most abundantly expressed NAD(P)H-dependent enzymes, the metabolic pathways associated with anaerobic glycolysis, oxidative phosphorylation/aerobic glycolysis, and NOX-based oxidative burst, as a major defense mechanism, were distinguished, and the metabolic crosstalk between the host and parasite during infection was characterized.

NADPH Fluorescence Lifetime Imaging for the Metabolic Analysis of the Murine Intestine and Parasites During Nematode Infection

The present protocol describes the NAD(P)H fluorescence lifetime imaging of an explanted murine intestine infected with the natural parasite Heligmosomoides polygyrus, which allows one to investigate metabolic processes both in host and parasite tissues in a spatially resolved manner.

Parasites generally have a negative effect on the health of their host. They represent a huge health burden, as they globally affect the health of the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Untersuchung der Strongyloides ratti-Infektion bei Labormäusen

Experimental Infection of Mice with the Parasitic Nematode Strongyloides ratti

Strongyloides ratti is a parasitic nematode that naturally infects wild rats. However, most laboratory rat and mouse strains are fully susceptible to infection. Immunocompetent BALB/c and C57BL/6 mice terminate S. ratti infections within a month in the context of a canonical type 2 immune response and&#160;remain semi-resistant to a re-infection. The course of infection can be divided into three phases: (a) the tissue migration phase of the infective third-stage larvae during the first two days; (b) the early intestinal phase, including the molting to the adult parasites and embedding in the mucosa of the intestine in days 3 to 6 post-infection with reproduction starting by day 5 to 6 post-infection; (c) the later intestinal phase ending with the complete clearance of the parasites. Experimental infections of mice with S. ratti enable the precise study of host-parasite interactions throughout the whole life cycle at the different sites of infection, as well as immune evasion strategies employed by the parasite. The protocol presented here describes the maintenance of the parasite in Wistar rats, the infection of laboratory mice, and the detection and quantification of S. ratti parasites in the tissue migrating phase and during the intestinal phase.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Geschlechtsabhängige intestinale Immunität und ortsspezifische Immunantworten bei Strongyloides ratti-Infektionen

Strongyloides ratti is a parasitic nematode that causes transient infections in laboratory mice, displaying tissue-migrating and intestinal life stages. Here, we present a protocol for the maintenance of the parasite cycle in rats and experimental infection of mice, including parasite quantification in the head, lung, and intestine.

Experimentelle Infektion von Mäusen mit dem parasitären Fadenwurm Strongyloides ratti

Strongyloides ratti is a parasitic nematode that naturally infects wild rats. However, most laboratory rat and mouse strains are fully susceptible to ...

Der Anbau von

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video