Diese Arbeit wurde vom NSERC Individuelle Discovery-Programms, dem NSERC / CIHR Collaborative Health Research Program (CHRP) und dem kanadischen NSERC CREATE Astrobiologie Training Program (CAPT) gefördert.

1. QD Solubilisierung Dies ist eine geeignete Methode für CdTe. Ähnliche Verfahren können mit anderen Arten von QD wie InP / ZnS 20 und CdSe / ZnS 21 verwendet werden. <ol><li> Eine Lösung aus CdTe-QDs in Toluol bei 15 uM (optische Dichte = 2,5 bei der ersten Excitonenpeak). </li><li> Übertragen Sie 200 ul dieser Aktie in einen Glaskolben. Verwenden Sie kein Plastik! </li><li> Fügen Sie 800 ul Toluol, 1 ml 200 mM Boratpuffer (pH 9) und 2 ul 11,5 M Mercaptopropionsäure (MPA). </li><li> Verschließe das Röhrchen und schütteln Sie sie kräftig für 30-60 Sekunden. </li><li> Die wässrigen und organischen Phasen-Lösungsmittel spontan trennen. Die wässrige Phase wird die Farbe der QDs geworden. Um die Toluol-Schicht zu vermeiden, entfernen Sie sie und entsorgen Sie sie. Übertragen Sie anschließend die wässrige Phase in ein sauberes Gefäß. </li><li> Reinigung der solubilisierten QDs durch Waschen / Filterung viermal mit 500 ul, 10000 Molekulargewichtsschnitt Zentrifuge Filter. Die Filter solltenversponnen bei 3000 × g für 13 Minuten. Für mindestens die letzten zwei Wäschen, mit dem gewünschten End-Puffer waschen. </li><li> Nach dem letzten Waschen, suspendieren die gewaschenen QDs in 50 mM Boratpuffer bei dem gewünschten pH-Wert und lagern bei 4 ° C. Sie werden für 1-2 Wochen stabil. </li><li> Wird die Extinktion und Emissionsspektren, um die Konzentration auf den veröffentlichten Formeln 22 schätzen. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Abbildung 1 zeigt ein Bild von CdTe-QDs unter UV-Lampe Beleuchtung, und Emissionsspektren vor und nach Wasser Solubilisierung, zeigt vernachlässigbare Veränderung von der Kappe Austausch. Die Größe Werte der Kerndurchmesser gemessen durch Elektronenmikroskopie. 2. QD Konjugation an Antibiotika Dieser Teil des Protokolls ist anwendbar auf alle negativ geladene Wasser gelösten Nanopartikel, darunter die meisten kommerziellen QDs, Metallpartikel, 19 und mehr. <ol><li> Jedes Molekül wird funktionieren, dass either selbst montiert, um den negativ geladenen solubilisiert QD, oder das eine reaktive Gruppe, die konjugiert werden können, wie ein primäres Amin. In diesem Beispiel verwenden wir Polymyxin B (PMB), das positiv geladen ist und selbst montiert, ohne dass eine Konjugation Reagenzien. Lösen Sie die PMB in H 2 O bei 60 um. (Wenn das Antibiotikum ausgewählt ist nicht löslich in H 2 O, in DMSO oder Ethanol gelöst in einer Konzentration von 0,1-1 mM). Dies wird eine 10-Lösung (in H 2 O) oder eine 100-Lösung (in Lösungsmittel) sein. </li><li> Berechnen Sie, wie viel QD-Lösung werden Sie für die Bakterientoxizität Experimente benötigen. Für eine Platte mit 96 Vertiefungen mit 0,3 ml pro Vertiefung in quadruplicates werden 0,5 ml von 200 nM Konjugat benötigt. Bereiten Sie zwei Röhrchen mit 100 ul 1 uM Quantenpunkte in 50 mM Boratpuffer. </li><li> Wenn Kopplung mit einem primären Amin, Herstellung einer 19 mg / ml (100 mM) Lösung von 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimid-hydrochlorid (EDC) in H 2 O. EDC in Lösung nicht stabil ist; Sie diese sofort und den Rest wegwerfen. </li><li> In 50 ul der 10x Antibiotika-Lösung (in H 2 O) oder 5 ul der 100x-Lösung (in Lösungsmittel) zu dem Konjugat Rohr. Für PMB: CdTe-Konjugation bei molaren Verhältnis von 30:1, fügen Sie 50 ul 60 uM PMB. In H 2 O oder Lösungsmittel zu der QD nur Steuerrohr. </li><li> Wenn nötig, fügen Sie 1 ul der EDC-Stammlösung zu dem Konjugat Rohr. </li><li> Öffne das Konjugat Volumen von 0,5 mL mit dem geeigneten Puffer (Borat oder PBS, keine Amin-enthaltenden Puffer wie Tris, da sie EDC inhibieren). </li><li> Schild Rohre von Licht mit Aluminiumfolie, und auf ein Kolbenpendel oder Wippe für 1 Stunde. Wenn Aggregation auftritt, wiederholen Sie die Konjugation mit niedrigeren Konzentrationen von Antibiotika. Daraufhin wird die Konzentration nach oben, bis die Partikel nicht aggregieren. </li><li> Waschen Sie die Konjugate, indem sie durch einen entsprechenden Filter. 10.000 Molekulargewicht Cutoff ist für die meisten Antibiotika, aber nicht für Proteine ​​oder Antikörper. </li&gt; <li> Je nach dem Molekül, können verschiedene Methoden verwendet, um die Zahl der Antibiotika-Moleküle pro QD schätzen werden: Absorption oder Fluoreszenz-Spektroskopie, Gelelektrophorese oder Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR). </li></ol> Repräsentative Ergebnisse. In diesem Beispiel wird PMB Konjugation durch Veränderungen in QD-Emission-Spektrum charakterisiert. Abbildung 2 zeigt die Spektren von CdTe-QDs mit PMB hinaus. 3. Vorbereitung der Bakterien für 96-Well-Screen; Bestimmung von Antibiotika-IC 50 Dies ist auf fast jedes Bakterienstamm in einem geeigneten Medium gezüchtet 18. Die genaue Länge der Zeit die Aufnahmen sollten weiterhin abhängig von der bakteriellen Wachstumsrate. In unserem Beispiel verwenden wir Escherichia coli in Lysogenie Brühe (LB)-Medium. <ol><li> Um die entsprechenden QD-Konjugat-Konzentrationen zu wählen, ist es wichtig, das wissenIC 50 des Antibiotikums zu konjugiert werden und wenn die QDs allein toxisch sind. Dies sollte 2 Tage vor der Konjugation Experiment begonnen werden. Am Abend, mit Samen 10 ml Bakterienwachstum Medium aus einer frischen Kolonie, richtig steril und Biosicherheit Technik. </li><li> Am nächsten Tag, 1-2 Stunden vor dem Experiment, füllen jede der Mulden einer klaren mit 96-Loch-Platte mit einer nahezu maximale Menge an Wachstumsmedium. Mit einer Mehrkanal-Pipette, Saatgut jedes Well mit 1-50 ul der Bakterienkultur (der Zusammenschluss auf, wie schnell die besondere Belastung wächst hängen und müssen von Ihrem Labor kalibriert werden). </li><li> Legen Sie die Platte auf die Platte Leser und stellen Sie es auf alle 10 Minuten für 2 Stunden bei einer bestimmten Wellenlänge (meist 600 nm) zu lesen. Überwachen Sie den Teller so, dass die Bakterien nicht wachsen zu dicht, zu schnell. </li><li> Wenn die Zellen alle erreichen OD = 0,1 bis 0,15, entfernen Sie die Platte aus der Platten-Lesegerät und stoppen Sie die Aufnahme. </li><li> Fügen Medikament allein und allein an QDsunterschiedlichen Konzentrationen in mindestens dreifacher Ausführung. Verwenden Sie eine Seite der Platte als &quot;dunkel&quot;-Steuerung und eine Hälfte beleuchtet werden. Eine vorgeschlagene Layout ist in Abbildung 3 angegeben. Die Konzentrationen sollten umfassen einen weiten Bereich genug, um eine Konzentration, die die Bakterien hemmt sehr wenig, und eine, die sie alle tötet gehören. </li><li> Schirmen Sie das &quot;dunkle&quot; Seite der Platte mit Aluminiumfolie. Freilegen der anderen Seite mit einer Lampe bei der gewünschten Wellenlänge. Wir verwenden ein benutzerdefiniertes 96-well, 440-nm-Lampe von 2,4 mW-LEDs (Abbildung 4) und bestrahlen für 30-60 min gemacht. Die schwarzen Platten mit transparentem Boden helfen, schützen die unbelichteten Bakterien von Streulicht. Eine leere Spalte kann auch zwischen den exponierten und nicht-exponierten Seiten verwendet werden. </li><li> Nach Belichtung, stellte den Teller in die Platte und Leser Rekord OD 600 alle 10 Minuten für 5-12 Stunden je nach Wachstumsrate. Halten Sie die Temperatur &lt;32 °. C, wenn möglich zu vermeiden, Trocknen der Kulturen </li><li> Zeichnen Sie die Wachstumskurvenbei einer ausgewählten Zeitpunkt gegen log [Konzentration] und bestimmen den IC 50 des Antibiotikums mit der Hill-Gleichung: </li></ol><img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/3969/3969eq1.jpg" /> wobei H der Hill-Koeffizient ist, y max der höchste Punkt des Wachstums (im Idealfall auf einem Plateau) und y min ist der Nullpunkt, auch ideal auf einem Plateau. Es ist unwahrscheinlich, dass QD allein wesentlich Toxizität für die Zellen bei den verwendeten Konzentrationen zeigen, so dass ein Wert nicht bestimmt werden. Repräsentative Ergebnisse. Am Ende der Aufnahmezeit wird klar Vertiefungen zeigen vollständige Zelltod, und einen Gradienten von Zelldichte sollte entlang steigenden Konzentrationen des Arzneimittels zu sehen. Die Bakterien sollten für S-förmigen Wachstumskurven (5 A), die Lage des Maximums Plateau wird sehr von Stamm zu Stamm und hängt auch von der Temperatur ab. Ein gegebenen Zeitpunkt kanngewählt als Vertreter und die Werte aufgetragen gegen log [Antibiotikum], um dem IC 50 (Abbildung 5 B). Um QD Toxizität zu bewerten, Überleben vs Log [QD] kann auch aufgetragen werden, aber Erzielung erheblicher Abtöten der Bakterien mit QDs allein ist selten (Abbildung 5 C). 4. Vorbereitung der Bakterien für 96-Well-Screen mit Antibiotika / QDs <ol><li> Der Tag vor dem Experiment, Samen 10 ml Kultur aus einer frischen Kolonie in das entsprechende reichen Medium, mit richtig steril und Biosicherheit Technik. Die QD-Antibiotikum-Konjugat sollte an diesem Tag zubereitet werden, es sei denn, es ist sehr instabil. </li><li> 1-2 Stunden vor dem Experiment füllen jede der Mulden einer klaren mit 96-Loch-Platte mit einer nahezu maximale Menge an Wachstumsmedium. Mit einer Mehrkanal-Pipette, Saatgut jedes Well mit 1-50 ul der Bakterienkultur. </li><li> Legen Sie die Platte auf die Platte Leser und stellen Sie es auf alle 10 Minuten für 2 Stunden bei der gleichen Wellenlänge wie in Teil 3 zu lesen.</li><li> Wenn die Zellen alle erreichen OD = 0,1 bis 0,15, entfernen Sie die Platte aus der Platten-Lesegerät und stoppen Sie die Aufnahme. </li><li> Fügen Sie QD-Konjugate in unterschiedlichen Konzentrationen in mindestens vierfacher Ausfertigung. Verwenden Sie eine Seite der Platte als &quot;dunkel&quot;-Steuerung und eine Hälfte beleuchtet werden. Eine vorgeschlagene Layout ist in Abbildung 6 zu entnehmen. A-Bakterien nur Kontrollstreifen immer sollte bei Problemen mit dem Kultur-, Temperatur aufgenommen werden, beeinflussen usw. Wachstumsbedingungen. Ein einziger Streifen von Medikamenten und nur QD nur sollten ebenfalls einbezogen, um sicherzustellen, dass sie die Kontrolle Platte gemacht vorher angepasst werden. Der Rest der Brunnen befinden, um Konjugate gewidmet, um für gute Statistiken zu ermöglichen. </li><li> Schirmen Sie das &quot;dunkle&quot; Seite der Platte mit Aluminiumfolie. Freilegen der anderen Seite mit einer Lampe bei der gewünschten Wellenlänge. </li><li> Nach Belichtung, stellte den Teller in die Platte und Leser Rekord OD 600 alle 10 Minuten für 5-12 Stunden. Halten Sie die Temperatur &lt;32 ° C, wenn möglich, vermeiden drYing der Kulturen. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse. Die Kombination von Quantenpunkten und Antibiotikum möglicherweise weniger toxisch als Antibiotikum allein, gleich toxisch; oder mehr giftig. Dies kann quantifiziert werden mit Hilfe der Wachstumskurven und IC 50 Messungen werden. Abbildung 7 zeigt ein Beispiel, dass Konjugate gleich toxisch als Antibiotikum allein, und ein Beispiel für Konjugate, die giftiger sind. 5. Keimzahl <ol><li> Wählen Sie eine oder mehrere Vertiefungen der behandelten 96-Well Platte, für serielle Verdünnungen und das Auszählen von Kolonien verwendet werden. </li><li> Einen seriellen Verdünnung von jedem der ausgewählten bakteriellen Proben mit PBS oder Salzlösung (0,9% NaCl). Übertragen Sie 20 ul der bakteriellen Lösung und verdünnen Sie es mit 180 ul Kochsalzlösung, ändern Sie die Pipettenspitze, Mischen und Übertragen 20 uL der verdünnten Lösung, um bakterielle 180 ul Kochsalzlösung. Wiederholen Sie die 6-fache. </li><li> Nehmen Sie sich 10 ul von jeder Verdünnung und Teller auf einem geeigneten<html> festen Medien Platte. Alle 8-Konzentrationen einer Probe kann auf einem 10 cm runden Petrischale ausgestrichen werden, obwohl rechteckige Gerichte bevorzugt werden, da es einfacher ist, Dinge antreten. </li><li> Lassen Sie es auf der Bank für 15 Minuten trocknen lassen. dann bei entsprechender Temperatur für Ihre Bakterien inkubieren für 16 Stunden. </li><li> Anzahl Kolonien und Berechnung koloniebildenden Einheiten (CFU) nach Anspruch (# von Kolonien x Verdünnungsfaktor) / Volumen plattierten = CFU / ml. </li></ol> Abbildung 8 zeigt ein Beispiel CFU Platte. 6. Repräsentative Ergebnisse <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig1.jpg" /> Abbildung 1. CdTe-QDs. (A) acht Zubereitungen von CdTe-QDs die Beleuchtung mit einer UV-Stab (365 nm). (B) Absorptions-und Emissionsspektren von fünf ausgewählten Größen vor und nach der Wasser-Solubilisierung. Die gestrichelten Linien sind Spektren in Toluol, die durchgezogenen Linien in Wasser. files/ftp_upload/3969/3969fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Spectral-und Gel-Analyse der QD-PMB-Konjugate. Orange-emittierende CdTe-QDs wurden für dieses Beispiel verwendet, die Auswirkungen auf andere Arten von QDs müssen für jedes Experiment ausgewertet werden. (A) Typische Absorption (graue Linie) und Emissionsspektren (schwarze Linie) der QDs vor der Konjugation von PMB und der Emission (gestrichelte Linie) nach der Zugabe von 160 Moläquivalenten PMB. (B) Beziehung zwischen dem Verhältnis von PMB und dem QD Emissionsintensität (Quadrate) und Peakwellenlänge Lage (Dreiecke). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig3.jpg" /> Abbildung 3. Empfohlene Platte Layout für die Steuerung Wachstumsfuge. Eine Vielzahl von PMB und QD-Konzentrationen dargestellt. Die eine Hälfte der Platte wird bestrahlt (blau hervorgehoben), und eine identische Hälfte wird vor Licht geschützt. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier</a>für eine größere Abbildung zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig4.jpg" /> Abbildung 4. Benutzerdefinierte 96-LED-Lampe für eine gleichmäßige Bestrahlung Platte, welche Erscheinung aus-und einschalten. Eine typische Hand-UV-Lampe kann auch verwendet werden, jedoch wird nicht die gesamte Platte gleichmäßig. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig5.jpg" /> Abbildung 5. Beispiel für Kontrolle Wachstumsfuge. (A) Repräsentative Bakterienwachstum Kurven mit unterschiedlichen Wirkstoffkonzentrationen, von 0 abzuschließen Zelltod. Die offenen Symbole sind nur mit PMB Konzentrationen gegeben, die festen Symbole sind CdTe-PMB ohne Bestrahlung, und die halb gefüllte Symbole sind CdTe-PMB mit Bestrahlung. Die Bestrahlung hatte keinen Einfluss auf den PMB nur Muster, so dass diese Kurven aus Gründen der Klarheit weggelassen wurden. Alle PMB-CdTe-Konjugate sind 30:1 PMB: QD-Verhältnisse. (B) Plots der Wachstumskurve Werte bei 200 min vs Log [PMB] und passt zu Gl. (1). Um control für die Wirkung des Lichts wird eine Kurve mit Antibiotika nur 30 min mit der Belichtung erfolgen. (C) die Überlebensrate der Bakterien bei 200 min vs QD-Konzentration, mit CdTe-QDs. Einige Toxizität ist mit der Belichtung, aber zu wenig, um einen IC 50-Wert bestimmen zu sehen. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig5large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="6" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig6.jpg" /> Abbildung 6. Vorgeschlagene Layout für Konjugat Testplatte. Die blau-markierten Hälfte der Platte sollte sie dem Licht ausgesetzt werden, und der nicht hervorgehobenen Hälfte wird geschützt. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig6large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="7" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig7.jpg" /> Abbildung 7. Beispiel für konjugierte Testplatte. Wachstumskurve Werte bei 200 min waren plotted und fit zu Gl. (1). (A) CdTe-PMB-Konjugate Toxizität über PMB allein erhöht. (B) Gold-Nanopartikel-Au-PMB-Konjugate zeigen keine erhöhte Toxizität über PMB allein. <img alt="8" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig8.jpg" /> Abbildung 8. Beispiel einer CFU Platte. E. coli in einer 96-Well-Platte ausgesät wurde mit QD-PMB mit oder ohne Bestrahlung für 30 min behandelt. dann bei 32 ° C für 4 Stunden inkubiert. Serielle Verdünnungen von jeder bakteriellen Probe wurden mit Kochsalzlösung und 10 ul 100 X 10 7 X Verdünnungen wurden auf Agarplatten ausplattiert. Die Platten wurden inkubiert bei 37 ° C und Kolonien nach 16 Stunden gezählt. Die Platte zeigt, die Verdünnungen entlang der Reihen wie angegeben, die Säulen sind: (A) 0,06 uM PMB + 2 nM CdTe, (B) 0,12 uM PMB + 4 nM CdTe (C) 0,2 uM PMB + 6,7 nM CdTe, (D) 0,06 um PMB + 2 nM CdTe bestrahlt, (E) 0,12 uM PMB + 4 nM CdTe bestrahlt, (F) 0,2 uM PMB + 6,7 nM CdTe Bestrahlungsbestrahlte.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Nanopartikel bieten einen vielversprechenden Ansatz zur Schaffung neuer antimikrobieller Mittel. Wachstumskurvenanalyse ist ein Weg, der bakteriellen Zelldichte, die aktiv wachsenden Zellen von Wachstum gehemmt Zellen zeichnet überwachen. Wenn mit Platte gekoppelt zählt, ermöglicht es einer gründlichen Analyse des Antibiotikums Potenzial eines Konjugats. Der 96-Well-Format erlaubt relativ hohem Durchsatz Variationen der Konzentration und anderer Bedingungen, wie Belichtung, die letztere ist entscheidend für Licht a...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Boratpuffer Component # 1 </td><td> Fischer </td><td> Borsäure A-74-1 </td><td></td></tr><tr><td> Boratpuffer Component # 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Natriumtetraborat B9876 </td><td></td></tr><tr><td> MPA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5801 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin 500 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9322 </td><td> Verschiedene MWCO verfügbar </td></tr><tr><td> Glasfläschchen </td><td> Fischer </td><td> 03-338C </td><td></td></tr><tr><td> EDC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E6383 </td><td></td></tr><tr><td> Polymyxin B </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1004 </td><td></td></tr><tr><td> Bakterielle growth Medium (LB)-Komponente Nr. 1 </td><td> Fischer </td><td> NaCl-S271 </td><td></td></tr><tr><td> Bakterienwachstum Medium (LB)-Komponente # 2 </td><td> BD </td><td> Trypton 211705 </td><td></td></tr><tr><td> Bakterienwachstum Medium (LB)-Komponente # 3 </td><td> BD </td><td> Hefeextrakt 211929 </td><td></td></tr><tr><td> Lampe für Belichtung </td><td> Brauch </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Clear-bottom 96-Well Platten </td><td> Fischer </td><td> 07-200-567 oder 07-200-730 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszenz-Spektrometer </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Die Absorption Plattenlesegerät </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bactoagar für feste Medien </td><td> Bioshop </td><td> AGR001.1 </td><td></td></tr><tr><td> Petrischalen runden </td><td> Fischer </td><td> 08-75-12 </td><td></td></tr><tr><td> Petrischalen rechteckigen </td><td> Fischer </td><td> 08 bis 757-11A </td><td></td></tr></tbody></table>

solubilization and bio-conjugation of quantum dots and bacterial toxicity assays by growth curve and plate count

Quantenpunkte (QP) sind fluoreszierende Halbleiter-Nanopartikel mit größenabhängigen Emissionsspektren, die durch eine breite Auswahl an Wellenlängen angeregt werden kann. Quantenpunkte haben ein großes Interesse für die Bildgebung, Diagnostik, Therapie und dank ihres hellen, stabile Fluoreszenz 1,2 3,4,5 angezogen. QD konjugiert werden kann, um eine Vielzahl von bioaktiven Molekülen zur Bindung an Bakterien und Säugerzellen 6. QDs werden auch allgemein als Zytostatika für die gezielte Tötung von Bakterien untersucht. Die Entstehung der mehrfach resistente Bakterienstämme sich schnell zu einer Krise des öffentlichen Gesundheitswesens, insbesondere im Fall von Gram-negative Erreger 7. Wegen der bekannten antimikrobiellen Wirkung bestimmter Nanomaterialien, insbesondere Ag, gibt es Hunderte von Studien, welche die Toxizität von Nanopartikeln zu 8 Bakterien. Bakterielle Studien mit anderen Typen von Halbleiter-Nanopartikeln sowie, durchgeführt Especbeugende Wartung TiO2 9,10-11, sondern auch ZnO-12 und andere, einschließlich CuO 13. Einige Vergleiche von Bakterienstämmen wurden in diesen Studien durchgeführt, üblicherweise Vergleichen eines Gram-negativen Stamm mit einem Gram-positiven. Entweder die Photoerzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) von den Partikeln oder die direkte Freisetzung von Metallionen, die oxidative Toxizität verursachen können: Mit all diesen Teilchen werden Mechanismen der Toxizität gegenüber Oxidation zugeschrieben. Selbst mit diesen Materialien gibt es unterschiedliche Ergebnisse verschiedener Studien erheblich. In einigen Studien die Gram-positive Test-Stamm ist dem Vernehmen empfindlicher als der Gram-negativen 10, in anderen ist es umgekehrt 14. Diese Studien wurden gut 15 bewertet. In allen Studien Nanopartikel können Partikel Zusammensetzung, Größe, Oberflächenchemie, Probe Alterung / Abbau und Wellenlänge, Leistung und Dauer der Lichteinwirkung alle dramatischen Einfluss auf die Ergebnisse. Darüber hinaus SYNTHESIs Nebenprodukte und Lösungsmittel müssen 16 17 berücksichtigt werden. High-Throughput-Screening-Techniken nötig sind, um in der Lage sein, neue wirksame Nanomedizin Mittel zu entwickeln. CdTe-QDs haben antimikrobielle Wirkungen allein 18 oder in Kombination mit Antibiotika. In einer vorangegangenen Studie konnten wir zeigen, dass die Kopplung von Antibiotika kann zu CdTe Toxizität gegenüber Bakterien zu erhöhen, sondern verringern die Toxizität für Säugerzellen, aufgrund der verringerten Produktion von reaktiven Sauerstoff-Spezies aus den Konjugaten 19. Obwohl es unwahrscheinlich, dass Cadmium-Verbindungen zur Verwendung bei Menschen zugelassen werden wird, könnte eine solche Zubereitungen zur Desinfektion von Oberflächen oder Sterilisieren von Wasser verwendet werden. In diesem Protokoll, geben wir einen einfachen Ansatz zur Solubilisierung CdTe-QDs mit Mercaptopropionsäure (MPA). Die Quantenpunkte sind bereit, innerhalb einer Stunde zu nutzen. Wir haben dann zu demonstrieren eines antimikrobiellen Mittels Kopplung. Der zweite Teil des Protokollsdemonstriert eine 96-Well-bakteriellen Hemmtest mit den konjugierten und unkonjugierten QDs. Die optische Dichte wird über viele Stunden zu lesen, es gestatten, die Wirkungen der Zugabe und QD Belichtung sofort als auch nach einer Erholungszeit ausgewertet. Wir zeigen auch eine Zählung der Kolonien für die Quantifizierung von Bakterien das Überleben.

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Solubilization and Bio-conjugation of Quantum Dots and Bacterial Toxicity Assays by Growth Curve and Plate Count

Nanopartikel wie Halbleiter-Quantenpunkten (QP) verwendet werden, um photoaktivierbare Agenten für anti-mikrobiellen oder Anti-Krebs-Anwendungen zu erstellen. Diese Technik zeigt, wie Wasser-löslich zu Cadmium-Tellurid (CdTe) QDs, konjugieren sie gegen ein Antibiotikum, und führen Sie einen bakteriellen Hemmtest auf Wachstumskurven und die Keimzahl basiert.

Solubilisierung und Bio-Konjugation von Quantenpunkten und bakterielle Toxizitätstests von Wachstumskurve und Keimzahl

Quantum dots (QDs) are fluorescent semiconductor nanoparticles with size-dependent emission spectra that can be excited by a broad choice of wavelengths. ...

solubilization-bio-conjugation-quantum-dots-bacterial-toxicity-assays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.2K Aufrufe.  McGill University, Montreal, QC Canada. Nanopartikel wie Halbleiter-Quantenpunkten (QP) verwendet werden, um photoaktivierbare Agenten für anti-mikrobiellen oder Anti-Krebs-Anwendungen zu erstellen. Diese Technik zeigt, wie Wasser-löslich zu Cadmium-Tellurid (CdTe) QDs, konjugieren sie gegen ein Antibiotikum, und führen Sie einen bakteriellen Hemmtest auf Wachstumskurven und die Keimzahl basiert.

Serie: Solubilization and Bio-conjugation of Quantum Dots and Bacterial Toxicity Assays by Growth Curve and Plate Count

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduktion des neuronalen Wachstums

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Forschung

Biotechnik

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Bakterielle Immobilisierung für Imaging von Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.

We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.

Produktion und Targeting von Monovalenter Quantenpunkte

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Korrelative Light- und Elektronenmikroskopie Quantum Dot Nanopartikel

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

20 mJ, 1 ps Yb:YAG Thin-disk Regenerative Amplifier

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with turn-key performance and microjoule-level pulse energy is used to seed the regenerative chirped-pulse amplifier. The amplifier is placed in airtight housing. It operates at room temperature and exhibits stable operation at a 5 kHz repetition rate, with a pulse-to-pulse stability less than 1%. By employing a 1.5 mm-thick beta barium borate crystal, the frequency of the laser output is doubled to 515 nm, with an average power of 70 W, which corresponds to an optical-to-optical efficiency of 70%. This superior performance makes the system an attractive pump source for optical parametric chirped-pulse amplifiers in the near-infrared and mid-infrared spectral range. Combining the turn-key performance and the superior stability of the regenerative amplifier, the system facilitates the generation of a broadband, CEP-stable seed. Providing the seed and pump of the optical parametric chirped-pulse amplification (OPCPA) from one laser source eliminates the demand of active temporal synchronization between these pulses. This work presents a detailed guide to set up and operate a Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier, based on chirped-pulse amplification (CPA), as a pump source for an optical parametric chirped-pulse amplifier.

A protocol for the operation of a high-energy, high-power optical parametric chirped pulse amplifier pump source based on an Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier is presented here.

20 mJ, 1 ps Yb: YAG Dünnschicht-Regenerationsverstärker

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means of identifying radiosensitive sites in living organisms. This paper describes a series of on-chip immobilization methods developed for the targeted microbeam irradiation of live individuals of Caenorhabditis elegans. Notably, the treatment of the polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chips that we previously developed to immobilize C. elegans individuals without the need for anesthesia is explained in detail. This chip, referred to as a worm sheet, is resilient to allow the microfluidic channels to be expanded, and the elasticity allows animals to be enveloped gently. Also, owing to the self-adsorption capacity of the PDMS, animals can be sealed in the channels by covering the surface of the worm sheet with a thin cover film, in which animals are not pushed into the channels for enclosure. By turning the cover film over, we can easily collect the animals. Furthermore, the worm sheet shows water retention and allows C. elegans individuals to be subjected to microscopic observation for long periods under live conditions. In addition, the sheet is only 300 &#181;m thick, allowing heavy ions such as carbon ions to pass through the sheet enclosing the animals, thus allowing the ion particles to be detected and the applied radiation dose to be measured accurately. Because selection of the cover films used for enclosing the animals is very important for successful long-term immobilization, we conducted the selection of the suitable cover films and showed a recommended one among some films. As an application example of the chip, we introduced imaging observation of muscular activities of animals enclosing the microfluidic channel of the worm sheet, as well as the microbeam irradiation. These examples indicate that the worm sheets have greatly expanded the possibilities for biological experiments.

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

A series of immobilization methods has been established to allow the targeted irradiation of live Caenorhabditis elegans individuals using a recently developed ultra-thin polydimethylsiloxane microfluidic chip with water retention. This novel on-chip immobilization is also adequate for imaging observations. The detailed treatment and application examples of the chip are explained.

Immobilisierung von Live Caenorhabditis Elegans Einzelpersonen, die eine ultraflache Polydimethylsiloxan Mikrofluidik-Chip mit Wassereinlagerungen

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell monolayers. Although they cannot completely model in vivo complexity, they retain some functionality of the original organ. In cancer models, organoids are commonly used to study tumor cell invasion. This protocol aims to develop and characterize organoids from the normal and irradiated mouse mammary gland tissue to evaluate the radiation response in normal tissues. These organoids can be applied to future in vitro cancer studies to evaluate tumor cell interactions with irradiated organoids. Mammary glands were resected, irradiated to 20 Gy and digested in a collagenase VIII solution. Epithelial organoids were separated via centrifugal differentiation, and 3D organoids were developed in 96-well low-adhesion microplates. Organoids expressed the characteristic epithelial marker cytokeratin 14. Macrophage interaction with the organoids was observed in co-culture experiments. This model may be useful for studying tumor-stromal interactions, infiltration of immune cells, and macrophage polarization within an irradiated microenvironment.

Organoids developed from mouse mammary glands were irradiated and characterized to assess epithelial traits and interactions with immune cells. Irradiated organoids can be used to better evaluate cell-cell interactions that may lead to tumor cell recruitment in irradiated normal tissue.

Wachstum und Charakterisierung der bestrahlten Organoide aus den Brustdrüsen

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation of the drug-protein interactions is highly desirable for not only understanding the molecular mechanisms underlying therapeutic efficacy but also for assessing drug characteristics, such as adsorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity (ADMET) for clinical use. Here, we present a biosensor-based high throughput strategy for the biopanning of T7 phage-displayed short peptides that can be easily displayed on the phage capsid. Subsequent analysis of the amino acid sequences of peptides containing short segments, as &#34;broken relics&#34;, of the drug-binding sites using bioinformatics programs in receptor ligand contact (RELIC) suite, is also shown. By applying this method to two clinically approved drugs, an anti-tumor irinotecan, and an anti-flu oseltamivir, the detailed process for collecting the drug-recognizing peptide sequences and highlighting the drug-binding sites of the target proteins are explained in this paper. The strategy described herein can be applied for any small molecules of interest.

This study aimed to present a strategy for identifying drug-peptide interactions. The strategy involves the biopanning of drug-recognizing short peptides based on a quartz-crystal microbalance (QCM) biosensor, followed by bioinformatics analysis for quantitatively assessing the information obtained for the drug recognition and annotation of the drug-binding sites on proteins.

Biosensor-basierte Hochdurchsatz-Biopanning- und Bioinformatik-Analysestrategie zur globalen Validierung von Wechselwirkungen zwischen Arzneimittel und Proteinen

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

Ein kombiniertes Mikrogerätesystem zur Förderung und Überwachung des Korallenwachstums

An Integrated Micro-Device System for Coral Growth and Monitoring

Corals are fundamental organisms in marine and coastal ecosystems. With the advancement of coral protection research in recent years, precise control of the coral culture environment is highly in demand for coral conservation and study. Here, we developed a semi-closed coral culture micro-device system as a multi-functional platform, which can provide accurate and programmable temperature control, a sterile initial environment, long-term stable water quality, an adjustable dissolved oxygen concentration, and a customized light spectrum for corals. Owing to the modular design, the coral culture system can be upgraded or modified by installing desirable new modules or removing existing ones. Currently, under appropriate conditions and with proper system maintenance, the sample corals can survive for at least 30 days in a healthy state. Furthermore, due to the controllable and sterile initial environment, this coral culture system can support research into the symbiotic relationship between corals and associated microorganisms. Therefore, this micro-device system can be applied to monitor and investigate sea corals in a relatively quantitative manner.

Autor im Rampenlicht: Förderung der Korallenkultur - Schaffung eines semi-quantitativ kontrollierten Mikroumgebungssystems, um den derzeitigen Einschränkungen entgegenzuwirken 

This protocol describes the development of a modular controllable micro-device system that can be applied for the long-term culturing and monitoring of sea corals.

Ein integriertes Mikrogerätesystem für Korallenwachstum und -überwachung

Corals are fundamental organisms in marine and coastal ecosystems. With the advancement of coral protection research in recent years, precise control of ...

Methods Article

Solubilisierung und Bio-Konjugation von Quantenpunkten und bakterielle Toxizitätstests von Wachstumskurve und Keimzahl