Este trabalho foi financiado pelo programa Descoberta NSERC Individual, o NSERC / CIHR Programa Cooperativo de Investigação de Saúde (CHRP), eo NSERC CRIAR canadense Programa de Formação de Astrobiologia (CAPT).

1. Solubilização QD Este é um método apropriado para CdTe. Métodos semelhantes podem ser utilizados com outros tipos de QDs tais como InP / ZnS 20 e CdSe / ZnS 21. <ol><li> Prepara-se uma solução de QDs CdTe em tolueno a 15 mM (densidade óptica = 2,5 no pico exciton primeiro). </li><li> Transferir 200 uL deste estoque para um frasco de vidro. Não utilize plástico! </li><li> Adicionar 800 uL de tolueno, 1 mL de tampão de borato 200 mM (pH 9) e 2 uL de 11,5 M de ácido mercaptopropiónico (MPA). </li><li> Tampe o frasco e agitar vigorosamente durante 30-60 segundos. </li><li> As fases aquosas e orgânicas-solvente irá separar-se espontaneamente. A fase aquosa irá tornar-se a cor das QDs. Para evitar a camada de tolueno, removê-la e descartá-lo. Em seguida, transferir a fase aquosa para um frasco limpo. </li><li> Purifica-se os QDs solubilizados por lavagem / filtragem quatro vezes usando um uL 500, 10000 de peso molecular de filtro de centrifugação de corte. Os filtros devem sercentrifugada a 3000 xg durante 13 minutos. Para pelo menos, as duas últimas lavagens, lava-se com o tampão final desejado. </li><li> Após a lavagem final, suspender as QDs lavadas em tampão de borato 50 mM ao pH desejado e armazenar a 4 ° C. Eles são estáveis ​​durante 1-2 semanas. </li><li> Medir a absorvância espectros de emissão e estimar a concentração de base em fórmulas publicados 22. </li></ol> Os resultados representativos: Figura 1 mostra uma imagem de QDs CdTe sob iluminação lâmpada de UV, e espectros de emissão antes e após solubilização água, mostrando a mudança insignificante da troca da tampa. Os valores de tamanho são o diâmetro do núcleo medido por microscopia electrónica. 2. Conjugação QD a antibióticos Esta parte do protocolo é aplicável a qualquer carregada negativamente nanopartícula-água solubilizada, incluindo QDs mais comerciais, partículas de metal, e mais 19. <ol><li> Qualquer molécula que irá trabalhar either de auto-montagem para os QDs negativamente carregadas solubilizados, ou que tem um grupo reactivo que pode ser conjugado, tal como uma amina primária. Neste exemplo, estamos a utilizar polimixina B (PMB), que está carregada positivamente e de auto-montagem sem necessidade de reagentes de conjugação. Dissolve-se o PMB em H2O a 60 mM. (Se o antibiótico escolhido não é solúvel em H2O, dissolver em DMSO ou etanol a uma concentração de 0,1-1 mM). Esta será uma solução 10x (em H2O) ou uma solução de 100x (em solvente). </li><li> Calcule quanto solução QD você vai precisar para os experimentos de toxicidade bacterianas. Para uma placa de 96 poços com 0,3 mL por poço em quadruplica, 0,5 mL de 200 nM conjugado é necessário. Preparar dois tubos contendo 100 L de 1 mícron pontos quânticos em 50 mM tampão borato. </li><li> Se o acoplamento com uma amina primária, preparar um mg 19 / mL (100 mM) de solução de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]-carbodiimida (EDC) em H 2 O. EDC em solução não é estável; Usar imediatamente e jogar o resto fora. </li><li> Adicionar 50 ul de solução 10x antibiótico (em H2O) ou 5 uL da solução de 100x (em solvente) para o tubo de conjugado. Para PMB: a conjugação CdTe na proporção molar de 30:1, adicionar 50 uL de 60 mM PMB. Adicionar H2O ou solvente para o tubo de controlo QD só. </li><li> Se necessário, adicionar 1 mL da solução-mãe de EDC para o tubo de conjugado. </li><li> Traga o volume conjugado a 0,5 ml com o tampão apropriado (tampão borato ou PBS; nenhum buffers contendo amina, tais como Tris, uma vez que irá inibir a EDC). </li><li> Tubos de protetor de luz com papel alumínio e coloque em um nutator ou roqueiro durante 1 hora. Se a agregação ocorre, repetir a conjugação com menores concentrações de antibiótico. Titular para cima de concentração até que as partículas não agregada. </li><li> Lavar os conjugados por passagem através de um filtro apropriado. 10.000 cutoff de peso molecular funciona para a maioria dos antibióticos, mas não para as proteínas ou anticorpos. </li&gt; <li> Dependendo da molécula, diferentes métodos podem ser utilizados para estimar o número de moléculas de antibióticos por QD: absorvância ou espectroscopia de fluorescência, electroforese em gel, ou de infravermelhos com transformada de Fourier (FTIR). </li></ol> Os resultados representativos. Neste exemplo, a conjugação PMB é caracterizada por alterações no espectro de emissão QD. A Figura 2 mostra os espectros de QDs CdTe com adição PMB. 3. Preparação de bactérias para a tela de 96 poços; Determinação da IC antibiótico 50 Isto é aplicável a quase qualquer estirpe bacteriana crescido no meio adequado 18. O comprimento exacto do tempo as gravações deve continuar depende da taxa de crescimento bacteriano. No nosso exemplo, usamos Escherichia coli cultivadas em caldo lisogenia (LB) médio. <ol><li> A fim de escolher os adequadas concentrações de conjugado QD, é importante conhecer oIC 50 do antibiótico a ser conjugada e se os QDs sozinhos são tóxicos. Isto deve ser iniciado 2 dias antes da experiência conjugação. À noite, mL semente 10 de meio de crescimento bacteriano a partir de uma colônia fresca, usando técnica estéril e biossegurança correta. </li><li> No dia seguinte, 1-2 horas antes da experiência, encher cada um dos poços de uma clara de fundo placa de 96 poços com uma quantidade quase-máxima de meio de crescimento. Usando uma pipeta de canais múltiplos de sementes, cada poço com 1-50 uL de cultura bacteriana (a concentração irá depender da rapidez com que o estirpe particular cresce e terá de ser calibrado pelo seu laboratório). </li><li> Colocar a placa sobre o leitor de placas e ajustá-lo para ler a cada 10 minutos durante 2 horas a um comprimento de onda determinado (normalmente 600 nm). Monitorar a placa para que as bactérias não crescem muito densa muito rapidamente. </li><li> Quando as células atingem todos os OD = 0,1-0,15, retire a placa do leitor de placa e parar a gravação. </li><li> Adicionar droga sozinho e sozinho em QDsconcentrações diferentes em pelo menos triplicados. Use um lado da placa como um controlo &quot;escuro&quot; e uma meia para ser iluminada. Um esquema sugerido é dado na Figura 3. As concentrações devem abranger uma ampla gama suficiente para incluir uma concentração que inibe as bactérias muito pouco, e um que mata todos eles. </li><li> Proteja o lado &quot;negro&quot; da placa com papel alumínio. Expor o outro lado para uma lâmpada no comprimento de onda desejado. Usamos um costume de 96 poços, a lâmpada de 440 nm feita a partir de 2,4 mW LEDs (Figura 4) e irradiam para 30-60 min. As placas pretas com fundo claros ajudam a proteger as bactérias não expostas de luz difusa. Uma coluna vazia pode também ser usado entre os lados expostos e un exposto. </li><li> Após a exposição à luz, colocar a placa no leitor de placas e OD registo 600 a cada 10 minutos para 5-12 horas, dependendo da taxa de crescimento. Mantenha a temperatura &lt;32 ° C, se possível, para evitar a secagem das culturas. </li><li> Traçar as curvas de crescimentonum ponto de tempo seleccionado vs log [concentração] e determinar o IC 50 do antibiótico utilizando a equação de Hill: </li></ol><img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/3969/3969eq1.jpg" /> em que H é o coeficiente de Hill, y max é o ponto mais alto de crescimento (idealmente em um planalto), e y min é o ponto de zero, também idealmente em um planalto. É improvável que QDs só por si, mostram a toxicidade muito para as células nas concentrações utilizadas, portanto, um valor não será determinado. Os resultados representativos. No final do período de gravação, poços claros irá indicar a morte celular completa, e um gradiente de densidade de células deve aparecer ao longo concentrações crescentes da droga. As bactérias devem mostrar as curvas em forma de S de crescimento (Figura 5 A); a localização do patamar máximo irá variar muito de estirpe para estirpe e também depende da temperatura. Um ponto de tempo dado pode serescolhida como representante e os valores representados vs log [antibiótico] para dar o IC 50 (Figura 5 B). Para avaliar a toxicidade QD, sobrevivência versus Log [QD] também pode ser traçado, mas alcançar a morte bacteriana significativa com QDs sozinho é rara (Figura 5 C). 4. Preparação de bactérias para tela de 96 poços com antibiótico / QDs <ol><li> Um dia antes do experimento, 10 mL de sementes da cultura de uma colônia fresca para o meio adequado rico, usando técnica estéril e biossegurança correta. O conjugado QD-antibiótico deve ser preparada neste dia, a menos que seja altamente instável. </li><li> 1-2 horas antes da experiência, encher cada um dos poços de uma clara de fundo placa de 96 poços com uma quantidade quase-máxima de meio de crescimento. Usando uma pipeta de canais múltiplos de sementes, cada poço com 1-50 uL de cultura bacteriana. </li><li> Coloque o prato sobre o leitor de placas e configurá-lo para ler a cada 10 minutos durante 2 horas no mesmo comprimento de onda como na Parte 3.</li><li> Quando as células atingem todos os OD = 0,1-0,15, retire a placa do leitor de placa e parar a gravação. </li><li> Adicionar conjugados QD em diferentes concentrações em, pelo menos em quadruplicado. Use um lado da placa como um controlo &quot;escuro&quot; e uma meia para ser iluminada. Um esquema sugerido é dada na Figura 6. A faixa de controle de bactérias só deve ser sempre incluída em casos de problemas com a cultura, temperatura, etc afetar as condições de crescimento. A única faixa de droga apenas e só QD também devem ser incluídos para garantir que elas coincidam com a placa de controle feito anteriormente. O resto dos poços são dedicados a conjugados, a fim de permitir a boas estatísticas. </li><li> Proteja o lado &quot;negro&quot; da placa com papel alumínio. Expor o outro lado para uma lâmpada no comprimento de onda desejado. </li><li> Após a exposição à luz, colocar a placa no leitor de placas e OD recorde de 600 a cada 10 minutos para 5-12 horas. Mantenha a temperatura &lt;32 ° C, se possível, evitar drying das culturas. </li></ol> Resultados representativos. A combinação de QDs e antibiótico pode ser menos tóxico do que o antibiótico por si só; igualmente tóxicos; ou mais tóxico. Isto pode ser quantificada utilizando as curvas de crescimento e de IC50 de medições. A Figura 7 mostra um exemplo de conjugados que igualmente tóxicos como antibiótico por si só, e um exemplo de conjugados que são mais tóxicos. 5. Contagem <ol><li> Escolher um ou mais dos poços da placa de 96 poços tratada de modo a ser utilizados para diluições em série e contagem de colónias. </li><li> Fazer uma diluição em série de cada uma das amostras seleccionadas bacterianas com PBS ou solução salina (0,9% NaCl). Transferir 20 uL da solução bacteriana e diluir com 180 uL solução salina, alterar a ponta da pipeta mistura, e transferir 20 uL de solução bacteriana diluída para 180 uL solução salina. Repita 6 vezes. </li><li> Tome 10 uL de cada diluição e placa sobre um adequado<html> placa de mídia sólido. Todos os 8 concentrações de uma amostra pode ser revestida sobre um prato 10 centímetros de Petri redondo, embora pratos rectangulares são preferidos porque é mais fácil para alinhar as coisas. </li><li> Deixar secar sobre a bancada durante 15 min. então incubar à temperatura apropriada para o seu bactérias durante 16 horas. </li><li> Contar as colónias e calcular unidades formadoras de colónias (CFU) de acordo com (# de colónias x factor de diluição) / volume chapeado = CFU / mL. </li></ol> A Figura 8 mostra uma placa de CFU exemplo. 6. Os resultados representativos <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig1.jpg" /> Figura 1. QDs CdTe. (A) Oito preparações de QDs CdTe iluminada com uma varinha de UV (365 nm). (B) Espectro de absorção e emissão de cinco tamanhos selecionados antes e depois da água solubilização. As linhas tracejadas são espectros em tolueno, as linhas sólidas são em água. files/ftp_upload/3969/3969fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. A análise espectral e gel de QD-PMB conjugados. QDs laranja emissores de CdTe foram utilizados para este exemplo, os efeitos sobre outros tipos de QDs terá de ser avaliados para cada experiência. (A) absorvância típica (cinza de linha) e espectros de emissão (linha preta) dos QDs antes de conjugação de PMB ea emissão (linha tracejada) após a adição de 160 equivalentes molares de PMB. (B) relação entre a razão do PMB ea intensidade da emissão QD (quadrados) e localização do pico de comprimento de onda (triângulos). <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig3.jpg" /> Figura 3. Sugerida layout da placa para placa de controle de crescimento. Uma ampla gama de concentrações de PMB e QD está representado. Uma metade da placa é irradiada (realçado azul), e uma meia idêntica é protegido da luz. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui</a>para ver maior figura. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig4.jpg" /> Figura 4. Lâmpada personalizado 96-LED para irradiação placa uniforme, mostrando aparência off e on. Uma lâmpada de mão típico UV pode também ser utilizado, mas não vai cobrir a totalidade da placa de modo uniforme. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig5.jpg" /> Figura 5. Exemplos de resultados para o controle da placa de crescimento. (A) representativos curvas de crescimento de bactérias com diferentes concentrações da droga, de 0 a completar a morte celular. Os símbolos abertos são PMB apenas com concentrações dadas; os símbolos a cheio são CdTe-PMB sem irradiação; e os símbolos meia-cheias são CdTe-PMB com irradiação. A irradiação não teve nenhum efeito sobre as amostras PMB-somente, assim estas curvas foram omitidos para maior clareza. Todos os conjugados PMB-CdTe são 30:1 PMB: razões de QD. (B) Parcelas de valores da curva de crescimento em 200 min vs Log [PMB] e se encaixa com a equação. (1). Para control para os efeitos da luz, uma curva é feito com antibiótico apenas com 30 minutos de exposição à luz. (C) a sobrevivência bacteriana em 200 min vs concentração QD, usando QDs CdTe. Alguns toxicidade é visto com exposição à luz, mas muito pouco para determinar um valor IC50. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="A Figura 6" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig6.jpg" /> Figura 6. Sugerida layout para placa de teste conjugado. A metade azul-destaque da placa deve ser exposto à luz, ea metade unhighlighted está protegida. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="A Figura 7" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig7.jpg" /> Figura 7. Exemplo resultados para placa de teste do conjugado. Valores de crescimento curva em 200 min foram plotted e ajuste para a equação. (1). (A) CdTe-PMB conjugados mostram aumento de toxicidade sobre PMB sozinho. (B) de nanopartículas de ouro Au-PMB conjugados não mostram aumento da toxicidade sobre PMB sozinho. <img alt="A Figura 8" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig8.jpg" /> Figura 8. Exemplo de uma placa de CFU. E. coli semeadas numa placa de 96 poços foi tratada com QD-PMB com ou sem irradiação durante 30 min. em seguida, incubadas a 32 ° C durante 4 horas. Diluições em série de cada amostra bacteriana foram feitas com solução salina, e 10 uL de 100 X a 10 7 diluições X foram plaqueadas em placas de agar. As placas foram incubadas a 37 ° C e as colónias foram contadas após 16 horas. A placa mostra as diluições ao longo das linhas como indicado, as colunas são: (A) 0,06 uM PMB + 2 nM CdTe, (B) 0,12 PMB uM + 4 nM CdTe (C) 0,2 uM PMB + 6,7 nM CdTe, (D) 0,06 iM PMB + 2 nM CdTe irradiadas, (E) 0,12 uM PMB + 4 nM CdTe irradiadas, (F) 0,2 uM PMB + 6,7 nM CdTe irradiaçãomediado.

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Não há conflitos de interesse declarados.

As nanopartículas representam uma abordagem promissora para a criação de novos agentes anti-microbianos. Análise da curva de crescimento é uma maneira de monitorar a densidade da célula bacteriana que distingue as células-ativamente crescentes de crescimento inibido células. Quando acoplada com contagens de placas, permite uma análise completa do potencial antibiótico de um conjugado. O formato de 96 poços permite variações relativamente alto rendimento de concentração e outras condições, tais como expo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Borato componente tampão # 1 </td><td> Pescador </td><td> O ácido bórico A-74-1 </td><td></td></tr><tr><td> Borato componente tampão # 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Tetraborato de sódio B9876 </td><td></td></tr><tr><td> MPA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5801 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin 500 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9322 </td><td> Vários MWCO disponível </td></tr><tr><td> Frascos de vidro </td><td> Pescador </td><td> 03-338C </td><td></td></tr><tr><td> EDC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E6383 </td><td></td></tr><tr><td> A polimixina B </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1004 </td><td></td></tr><tr><td> Gr bacterianaowth médio Componente (LB) # 1 </td><td> Pescador </td><td> NaCl S271 </td><td></td></tr><tr><td> Meio de crescimento bacteriano (LB) Componente # 2 </td><td> BD </td><td> Triptona 211705 </td><td></td></tr><tr><td> Meio de crescimento bacteriano (LB) Componente # 3 </td><td> BD </td><td> Extracto de levedura 211.929 </td><td></td></tr><tr><td> Lâmpada para exposição à luz </td><td> Personalizado </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Clara de fundo placas de 96 poços </td><td> Pescador </td><td> 07-200-567 ou 07-200-730 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescência espectrômetro </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Leitor de placas de absorbância </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BactoAgar para meios sólidos </td><td> Bioshop </td><td> AGR001.1 </td><td></td></tr><tr><td> As placas de Petri em volta </td><td> Pescador </td><td> 08-75-12 </td><td></td></tr><tr><td> As placas de Petri rectangulares </td><td> Pescador </td><td> 08-757-11A </td><td></td></tr></tbody></table>

solubilization and bio-conjugation of quantum dots and bacterial toxicity assays by growth curve and plate count

Os pontos quânticos (QDs) são nanopartículas de semicondutores fluorescentes com tamanho dependente de espectros de emissão que podem ser excitados por uma ampla gama de comprimentos de onda. QDs têm atraído muito interesse para a imagem, diagnóstico e terapêutica devido a sua fluorescência brilhante e estável 1,2 3,4,5. QDs podem ser conjugados com uma variedade de moléculas bio-activas para a ligação a bactérias e células de mamíferos 6. QDs também estão sendo amplamente investigada como agentes citotóxicos para o assassinato seletivo de bactérias. O surgimento de multiplicar-estirpes bacterianas resistentes torna-se rapidamente uma crise de saúde pública, particularmente no caso de agentes patogénicos Gram negativos 7. Por causa do efeito bem conhecido antimicrobiana de nanomateriais certos, especialmente de Ag, existem centenas de estudos que examinam a toxicidade das nanopartículas de bactérias 8. Estudos bacterianas foram realizados com outros tipos de nanopartículas de semicondutores, bem como, especially TiO 2 9,10-11, mas também ZnO 12 e outros, incluindo CuO 13. Alguns comparações de estirpes bacterianas foram realizados nestes estudos, geralmente comparando uma estirpe de bactérias Gram negativas com um positivo de Gram. Com todas essas partículas, mecanismos de toxicidade são atribuídos a oxidação: ou fotogeração o de espécies reactivas de oxigénio (ROS) pelas partículas ou a libertação directa de iões metálicos que podem causar toxicidade oxidativo. Mesmo com esses materiais, resultados de diferentes estudos variam muito. Em alguns estudos a cepa teste do Gram positivo é declaradamente mais sensível do que os 10 Gram negativa, em outros, é o 14 oposto. Estes estudos têm sido bem revisada 15. Em todos os estudos de nanopartículas, a composição de partículas, o tamanho, a química de superfície, a amostra de envelhecimento / avaria, eo comprimento de onda, a potência ea duração da exposição à luz podem todos afectar dramaticamente os resultados. Além disso, sintetizadosubprodutos s e solventes deve ser considerado 16 17. Técnicas de rastreio de alto rendimento são necessários para ser capaz de desenvolver agentes eficazes de nanomedicina novos. QDs CdTe têm efeitos anti-microbianos por si só 18 ou em combinação com antibióticos. Em um estudo anterior, mostramos que o acoplamento de antibióticos para CdTe pode aumentar a toxicidade para as bactérias, mas reduzir a toxicidade para células de mamíferos, devido à diminuição da produção de espécies reativas de oxigênio a partir das 19 conjugados. Embora seja improvável que o cádmio contendo-os compostos irão ser aprovado para utilização em seres humanos, tais preparações podem ser utilizadas para a desinfecção de superfícies ou de esterilização da água. Neste protocolo, damos uma abordagem direta para solubilização QDs CdTe com ácido mercaptopropiónico (MPA). Os QDs estão prontos para uso dentro de uma hora. Nós, então, demonstrar o acoplamento de um agente antimicrobiano. A segunda parte do protocolodemonstra um ensaio de inibição de 96 poços bacteriana utilizando os QDs conjugados e não conjugada. A densidade óptica é lida durante muitas horas, permitindo que os efeitos da adição QD e exposição à luz a ser avaliada, bem como imediatamente após um período de recuperação. Nós também ilustram uma contagem da colónia para a quantificação de sobrevivência bacteriana.

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Solubilization and Bio-conjugation of Quantum Dots and Bacterial Toxicity Assays by Growth Curve and Plate Count

As nanopartículas, tais como pontos quânticos de semicondutores (QDs) pode ser usado para criar agentes fotoactiváveis ​​para aplicações anti-microbianos ou anti-cancro. Esta técnica mostra como a água-solubilizar telureto de cádmio (CdTe) QDs, conjugá-los a um antibiótico, e realizar um ensaio de inibição bacteriana baseada em curvas de crescimento e contagem de placa.

Solubilização e Bio conjugação de pontos quânticos e ensaios de toxicidade bacterianas por curva de crescimento e Contagem

Quantum dots (QDs) are fluorescent semiconductor nanoparticles with size-dependent emission spectra that can be excited by a broad choice of wavelengths. ...

solubilization-bio-conjugation-quantum-dots-bacterial-toxicity-assays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.2K visualizações.  McGill University, Montreal, QC Canada. As nanopartículas, tais como pontos quânticos de semicondutores (QDs) pode ser usado para criar agentes fotoactiváveis ​​para aplicações anti-microbianos ou anti-cancro. Esta técnica mostra como a água-solubilizar telureto de cádmio (CdTe) QDs, conjugá-los a um antibiótico, e realizar um ensaio de inibição bacteriana baseada em curvas de crescimento e contagem de placa.

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Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

Axon Crescimento Stretch: O Mecanotransdução do Crescimento Neuronal

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Bioengenharia

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

A imobilização de bactérias for Imaging por Microscopia de Força Atômica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.

We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.

Produção e Segmentação de Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Correlativa luz e de Microscopia Eletrônica Usando Quantum Dot Nanopartículas

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

20 mJ, 1 ps Yb:YAG Thin-disk Regenerative Amplifier

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with turn-key performance and microjoule-level pulse energy is used to seed the regenerative chirped-pulse amplifier. The amplifier is placed in airtight housing. It operates at room temperature and exhibits stable operation at a 5 kHz repetition rate, with a pulse-to-pulse stability less than 1%. By employing a 1.5 mm-thick beta barium borate crystal, the frequency of the laser output is doubled to 515 nm, with an average power of 70 W, which corresponds to an optical-to-optical efficiency of 70%. This superior performance makes the system an attractive pump source for optical parametric chirped-pulse amplifiers in the near-infrared and mid-infrared spectral range. Combining the turn-key performance and the superior stability of the regenerative amplifier, the system facilitates the generation of a broadband, CEP-stable seed. Providing the seed and pump of the optical parametric chirped-pulse amplification (OPCPA) from one laser source eliminates the demand of active temporal synchronization between these pulses. This work presents a detailed guide to set up and operate a Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier, based on chirped-pulse amplification (CPA), as a pump source for an optical parametric chirped-pulse amplifier.

A protocol for the operation of a high-energy, high-power optical parametric chirped pulse amplifier pump source based on an Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier is presented here.

20 mJ, 1 ps Yb: amplificador regenerativo de disco fino YAG

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Deteção da endotoxina em Nano-formulações usando Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) ensaios

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means of identifying radiosensitive sites in living organisms. This paper describes a series of on-chip immobilization methods developed for the targeted microbeam irradiation of live individuals of Caenorhabditis elegans. Notably, the treatment of the polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chips that we previously developed to immobilize C. elegans individuals without the need for anesthesia is explained in detail. This chip, referred to as a worm sheet, is resilient to allow the microfluidic channels to be expanded, and the elasticity allows animals to be enveloped gently. Also, owing to the self-adsorption capacity of the PDMS, animals can be sealed in the channels by covering the surface of the worm sheet with a thin cover film, in which animals are not pushed into the channels for enclosure. By turning the cover film over, we can easily collect the animals. Furthermore, the worm sheet shows water retention and allows C. elegans individuals to be subjected to microscopic observation for long periods under live conditions. In addition, the sheet is only 300 &#181;m thick, allowing heavy ions such as carbon ions to pass through the sheet enclosing the animals, thus allowing the ion particles to be detected and the applied radiation dose to be measured accurately. Because selection of the cover films used for enclosing the animals is very important for successful long-term immobilization, we conducted the selection of the suitable cover films and showed a recommended one among some films. As an application example of the chip, we introduced imaging observation of muscular activities of animals enclosing the microfluidic channel of the worm sheet, as well as the microbeam irradiation. These examples indicate that the worm sheets have greatly expanded the possibilities for biological experiments.

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

A series of immobilization methods has been established to allow the targeted irradiation of live Caenorhabditis elegans individuals using a recently developed ultra-thin polydimethylsiloxane microfluidic chip with water retention. This novel on-chip immobilization is also adequate for imaging observations. The detailed treatment and application examples of the chip are explained.

Imobilização de indivíduos ao vivo Caenorhabditis elegans , usando um Chip de Microfluidic polidimetilsiloxano ultrafino com retenção de água

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell monolayers. Although they cannot completely model in vivo complexity, they retain some functionality of the original organ. In cancer models, organoids are commonly used to study tumor cell invasion. This protocol aims to develop and characterize organoids from the normal and irradiated mouse mammary gland tissue to evaluate the radiation response in normal tissues. These organoids can be applied to future in vitro cancer studies to evaluate tumor cell interactions with irradiated organoids. Mammary glands were resected, irradiated to 20 Gy and digested in a collagenase VIII solution. Epithelial organoids were separated via centrifugal differentiation, and 3D organoids were developed in 96-well low-adhesion microplates. Organoids expressed the characteristic epithelial marker cytokeratin 14. Macrophage interaction with the organoids was observed in co-culture experiments. This model may be useful for studying tumor-stromal interactions, infiltration of immune cells, and macrophage polarization within an irradiated microenvironment.

Organoids developed from mouse mammary glands were irradiated and characterized to assess epithelial traits and interactions with immune cells. Irradiated organoids can be used to better evaluate cell-cell interactions that may lead to tumor cell recruitment in irradiated normal tissue.

Crescimento e caracterização de organóides irradiados de glândulas mamárias

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation of the drug-protein interactions is highly desirable for not only understanding the molecular mechanisms underlying therapeutic efficacy but also for assessing drug characteristics, such as adsorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity (ADMET) for clinical use. Here, we present a biosensor-based high throughput strategy for the biopanning of T7 phage-displayed short peptides that can be easily displayed on the phage capsid. Subsequent analysis of the amino acid sequences of peptides containing short segments, as &#34;broken relics&#34;, of the drug-binding sites using bioinformatics programs in receptor ligand contact (RELIC) suite, is also shown. By applying this method to two clinically approved drugs, an anti-tumor irinotecan, and an anti-flu oseltamivir, the detailed process for collecting the drug-recognizing peptide sequences and highlighting the drug-binding sites of the target proteins are explained in this paper. The strategy described herein can be applied for any small molecules of interest.

This study aimed to present a strategy for identifying drug-peptide interactions. The strategy involves the biopanning of drug-recognizing short peptides based on a quartz-crystal microbalance (QCM) biosensor, followed by bioinformatics analysis for quantitatively assessing the information obtained for the drug recognition and annotation of the drug-binding sites on proteins.

Estratégia de análise de biopanning e bioinformática baseada em biosensor para a validação global de interações medicamentosas-proteínas

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

Um sistema combinado de microdispositivos para promover e monitorar o crescimento de corais

An Integrated Micro-Device System for Coral Growth and Monitoring

Corals are fundamental organisms in marine and coastal ecosystems. With the advancement of coral protection research in recent years, precise control of the coral culture environment is highly in demand for coral conservation and study. Here, we developed a semi-closed coral culture micro-device system as a multi-functional platform, which can provide accurate and programmable temperature control, a sterile initial environment, long-term stable water quality, an adjustable dissolved oxygen concentration, and a customized light spectrum for corals. Owing to the modular design, the coral culture system can be upgraded or modified by installing desirable new modules or removing existing ones. Currently, under appropriate conditions and with proper system maintenance, the sample corals can survive for at least 30 days in a healthy state. Furthermore, due to the controllable and sterile initial environment, this coral culture system can support research into the symbiotic relationship between corals and associated microorganisms. Therefore, this micro-device system can be applied to monitor and investigate sea corals in a relatively quantitative manner.

Autor em destaque: Avançando na cultura de corais - Criando um sistema de microambiente semi-quantitativamente controlado para combater as limitações atuais 

This protocol describes the development of a modular controllable micro-device system that can be applied for the long-term culturing and monitoring of sea corals.

Um sistema integrado de microdispositivos para crescimento e monitoramento de corais

Corals are fundamental organisms in marine and coastal ecosystems. With the advancement of coral protection research in recent years, precise control of ...